仝向娟，周曉，鐘慧，彭子文，單振鋒

(1.中南大學湘雅三醫(yī)院 口腔科,湖南 長沙 410013； 2.湖南省腫瘤醫(yī)院 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院 頭頸外科,湖南 長沙 410013; 3.中南大學生命科學學院,湖南 長沙 410013)

口腔鱗狀細胞癌(簡稱口腔鱗癌)是一種不同程度的口腔鱗狀分化的上皮性侵襲性腫瘤，是頭頸腫瘤的主要形式之一[1]。有研究表明口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展與信號傳導異常密切相關[2-3]。近幾年，對于白細胞介素6抗體(IL-6)/蛋白酪氨酸激酶2抗體(JAK2)/信號傳導和轉錄激活因子3抗體(STAT3)信號激活促進口腔鱗癌發(fā)展?jié)撛诘姆肿訖C制的探討受到了極大關注[4-5]，但其對口腔鱗癌細胞具體作用機制仍然不明晰。本研究旨在通過慢病毒轉染的方式建立體外高效、穩(wěn)定低表達IL-6口腔鱗癌細胞系體系，進而觀察口腔鱗癌細胞中IL-6的變化與JAK2和STAT3聯系，以及對口腔鱗癌細胞的惡性生物學行為的影響，為口腔鱗癌的發(fā)生機制提供相關分子學證據，也為下一步口腔鱗癌的臨床基因靶向干預提供重要參考。

1 資料和方法

1.1 主要儀器和試劑

PowerPac Basic垂直電泳儀(Bio-Rad,美國),180-100轉膜儀(Bio-Rad,美國),FQD-96A實時熒光定量PCR儀(杭州博日科技股份有限公司),KOD-Plus-Neo高保真PCR酶購自Toyobo公司，膠回收試劑盒購自Generay公司，BamHI、EcoRI限制性內切酶、dNTP mix、T4 DNA連接酶、RNase inhibitor購自Fermentas公司，IL-6、STAT3、磷酸化信號傳導和轉錄激活因子3抗體(p-STAT3),JAK2,磷酸化蛋白酪氨酸激酶2抗體(p-JAK),存活素抗體(Survivin),鋅指轉錄因子抗體(Snail),細胞周期蛋白B1抗體(Cyclin B1),金屬基質蛋白酶2(MMP2),鈣黏附蛋白E抗體(E-Cadherin)均購自美國CST公司，血管內皮生長因子A抗體(VEGFA)購自美國Abcam公司。β-肌動蛋白抗體(β-actin)購自美國Sigma公司，人口腔鱗狀細胞癌細胞株(SCC4)購自上海名勁生物科技有限公司，人口腔鱗狀癌細胞株(Cal27)和人口腔角質細胞株(HOK)購自北納創(chuàng)聯生物科技有限公司,質粒pGMLV-SB3及相應的陰性對照質粒pGMLV-SB3-shNC購自上海吉滿生物技術有限公司。

1.2 qPCR評價IL-6基因在各株細胞中的表達

使用含10 %胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)Cal27、SCC4和HOK細胞，并置于CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。Trizol提取各組細胞的總RNA，然后將各組細胞的總RNA逆轉錄成相應的cDNA，通過 SYBR Green Master Mix 進行qPCR檢測各組細胞中IL-6基因和內參基因GAPDH的表達量見表1。

1.3 IL-6 shRNA表達質粒構建

利用shRNA設計軟件設計4條針對人IL-6基因的shRNA靶點和1條陰性對照(NC)序列見表2。單鏈寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA見表3，退火產物與經BamHI和EcoRI雙酶切的pGMLV-SB3載體進行連接，4 ℃過夜。將連接產物轉化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜。

表2 4條IL-6 shRNA靶點序列信息及陰性對照序列信息

表3 IL-6基因特異性shRNA序列信息

1.4 慢病毒感染口腔鱗癌細胞構建穩(wěn)定株

具體分組如下：①Con組：未感染慢病毒的Cal27細胞和SCC4細胞；②NC組：感染pGMLV-SB3-shNC慢病毒的Cal27和SCC4細胞；③IL-6shRNA1(sh1)組：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA1慢病毒的Cal27細胞和SCC4細胞；④IL-6shRNA2(sh2)組：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA2慢病毒的Cal27細胞和SCC4細胞；⑤IL-6shRNA3(sh3)組：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA3慢病毒的Cal27細胞和SCC4細胞；⑥IL-6shRNA4(sh4)：感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA4慢病毒的Cal27細胞和SCC4細胞。在感染16 h后更換成培養(yǎng)基，CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，48 h后選擇嘌呤霉素真核抗性篩選細胞，利用qPCR方法和Western blot方法檢測IL-6基因敲低效果。

1.5 CCK8實驗

配置細胞懸液：取對數期生長期的Cal27/SCC4 Con、Cal27/SCC4 NC、Cal27/SCC4 IL-6shRNA1/3，分別命名為Con組、shRNA NC組、shRNA1/3組。每個細胞單塊96孔板接種3個孔，接種4塊板子，每孔接種100 μL細胞懸液，加入10 μL CCK8溶液，酶標儀檢測450 nm波長吸光度值；剩下板子分別在培養(yǎng)24、48、72 h后進行同樣操作。

1.6 克隆形成實驗

每皿約300個細胞的密度接將細胞種于6孔板中。CO2細胞培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)2周。結晶紫染色液染色15～30 min。用流水清洗掉結晶紫染色液，將細胞培養(yǎng)板置于空氣中干燥，用相機對培養(yǎng)皿進行拍照，計算各孔中的克隆數目。

1.7 流式細胞術檢測

各組細胞并將其收集于無菌EP管中，加入400 μL 100 μg/mL的PI染液，在室溫下避光染色約30 min。用流式細胞儀進行熒光信號檢測，激發(fā)波長設置為488 nm。

1.8 Transwell遷移和侵襲實驗

在細胞小室的上室中加入100 μL細胞懸液(約含5×103個細胞)，下室中DMEM完全培養(yǎng)基或加入Matrigel基質膠的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。加入結晶紫染色液，室溫下靜置15 min。用PBS清洗細胞3次，然后用棉簽輕輕擦去小室濾膜上表面的細胞，置于空氣中干燥，鏡下選取3個視野計數，取平均值算出穿過的細胞數目。

1.9 qPCR檢測各組細胞中基因表達狀況

提取細胞樣本總RNA，逆轉錄cDNA，利用qPCR法檢測各組細胞中E-Cadherin、CyclinB1、MMP2、VEGFA、Snail和STAT3基因表達情況見表4，以GAPDH基因作為內參。為了減少誤差，所有檢測樣本均做3個平行復孔，qPCR檢測完成后，取3個平行復孔的平均值作為該樣本的最終檢測數值。

表4 各目的基因及GAPDH基因的qPCR檢測引物序列

1.10 蛋白質印跡法

蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內。先用80 V約30 min使溴酚藍到達濃縮膠和分離膠分界線后，調電壓至120 V。電泳1.5～2 h后，終止電泳并進行轉膜。封閉，一抗孵育，二抗孵育用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。使用Tanon4600熒光圖像分析系統(tǒng)顯影。并用imageJ軟件讀取各條帶的灰度值，進行定量分析。

1.11 統(tǒng)計學方法

SPSS 22.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，Shapiro-Wilk檢驗數據正態(tài)分布，用單因素方差分析比較多組之間差異，應用GraphPad Prism7.0軟件繪圖，以雙側P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-6 shRNA干擾載體的測序結果

合成4個IL-6shRNA與設計4個靶基因序列完全一致，證明退火后合成片段已完整插入了質粒中，而且沒有單個堿基突變，表明成功構建了4個針對人IL-6基因的shRNA表達質粒，分別命名為IL-6shRNA1,IL-6shRNA2,IL-6shRNA3,IL-6shRNA4，見圖1。經過比對，重組克隆中插入片段序列與設計的oligo序列完全一致，因此載體構建成功。

圖1 pGMLV-SB3-IL-6shRNA質粒測序峰圖(部分) a:IL-6shRNA1質粒測序峰圖; b:IL-6shRNA2質粒測序峰圖; c:IL-6shRNA3質粒測序峰圖; d:IL-6shRNA4質粒測序峰圖 注：通過Chromas LIFE VerSion2.01軟件讀出測序后的峰圖，截取部分圖。

2.2 IL-6基因在各細胞株中的本底表達結果

對Cal27、SCC4進行IL-6基因表達的檢測，與HOK細胞株相比，Cal27細胞株和SCC4細胞株中的IL-6表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(F=12.89，P=0.012，P<0.05)，其中Cal27細胞株中的IL-6表達量比對照HOK細胞組高出4～5倍，見圖2。

圖2 IL-6基因在各細胞株中的本底表達結果 a:HOK細胞; b:SCC4細胞; c:Cal27細胞; d:3組細胞中IL-6基因的表達 注：**P<0.01,*P<0.05 vs.HOK。

2.3 建立穩(wěn)定的IL-6敲低的口腔鱗癌細胞株

將IL-6shRNA1,IL-6shRNA2,IL-6shRNA3,IL-6shRNA4質粒以及相應陰性對照質粒pGMLV-SB3-shNC分別轉染至Cal27細胞和SCC4細胞中，得到穩(wěn)定轉染細胞后，收集各組細胞，對各質粒的沉默效果進行qPCR，Western blot驗證。結果顯示，在Cal27細胞中4個質粒均不同程度的干擾IL-6蛋白的表達，表明基因敲除的細胞模型構建成功，其中IL-6shRNA1質粒干擾結果較明顯((F=92.51，P=0.000)，因此，選擇IL-6shRNA1靶點進行后續(xù)的相關實驗。在SCC4細胞中4個質粒均不同程度的干擾IL-6蛋白的表達，表明基因敲除的細胞模型構建成功，其中IL-6shRNA3質粒干擾結果較明顯(F=116.70，P=0.000)，因此，選擇IL-6shRNA3靶點進行后續(xù)的相關實驗，見圖3。

圖3 IL-6敲低的穩(wěn)定細胞株的構建與驗證 3a:質粒感染Cal27細胞的效果圖; 3b:質粒感染SCC4細胞的效果圖; 3c:Western blot法驗證質粒感染Cal27細胞后IL-6蛋白的干擾效果; 3d:Western blot法驗證質粒感染SCC4細胞后IL-6蛋白的干擾效果 注：**P<0.01 vs.Con，NC。 圖4 Con組、NC組及IL-6sh組口腔鱗癌細胞增殖曲線 4a:Cal27細胞系實驗組與對照組的比較; 4b:SCC4細胞系實驗組與對照組的比較 注：**P<0.01 vs.NC，Con。

2.4 CKK8和克隆形成實驗結果

IL-6基因表達下調后，口腔鱗癌細胞增殖能力在72 h受到了顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(Cal27細胞系實驗組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=13.09，P=0.006)；SCC4細胞系實驗組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=333.97，P=0.000)，見圖4?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果亦顯示，IL-6基因表達下調后，實驗組細胞克隆數對照組明顯減少，Cal27Con、Cal27NC、Cal27 IL-6shRNA1分別為(119±4)、(137±7)、(91±5)個；SCC4 Con、SCC4 NC、SCC4 IL-6shRNA3分別為(154±6)、(143±5)、(115±5)個，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(Cal27各組：F=53.73，P=0.0001；SCC4各組：F=42.31，P=0.0003)，見圖5。

圖5 克隆形成實驗檢測IL-6敲低后口腔鱗癌細胞增殖能力的改變 a:各組細胞的細胞克隆形成情況; b:Cal27細胞系實驗組與對照組的比較; c:SCC4細胞系實驗組與對照組的比較 注：**P<0.01 vs.NC，Con。

2.5 流式細胞學檢測結果

與對照組細胞相比，感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA1慢病毒的Cal27細胞中，G1期和S期細胞所占比例無顯著性差異，而G2期細胞所占比例上升的趨勢。感染pGMLV-SB3-IL-6shRNA3慢病毒的SCC4細胞組中，SCC4 Con、SCC4 NC、SCC4 IL-6shRNA3的G1期細胞所占比例分別為(48.67±0.94)%、(46.40±1.11)%、(36.35±3.47)%，顯著下降(F=45.68，P=0.000)，而G2期細胞所占比例分別為(15.40±2.66)%、(19.68±2.48)%、(23.73±3.87)%顯著上升(F=5.53，P=0.044)，見圖6。

圖6 流式細胞術檢測IL-6敲低后口腔鱗癌細胞周期情況 a:各組細胞的細胞周期圖; b:Cal27細胞系實驗組與對照組的比較; c:SCC4細胞系實驗組與對照組的比較 注：*P<0.05 vs.NC，Con。

2.6 Transwell實驗結果

取對數生長期Cal27/SCC4 Con、Cal27/SCC4 NC、Cal27/SCC4 IL-6shRNA1/3，配置細胞懸液，利用Transwell實驗檢測各組細胞遷移侵襲能力。結果顯示，在48 h內，Cal27Con、Cal27NC、Cal27 IL-6shRNA1遷移侵襲的細胞數與SCC4 Con、SCC4 NC、SCC4 IL-6shRNA3遷移侵襲的細胞數比較，敲低IL-6的口腔鱗癌細胞細胞侵遷移襲能力明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(Cal27各組：F=23.59/53.11，P=0.000/0.000；SCC4各組：F=73.39/38.73，P=0.000/0.000)，見圖7、8。

圖7 抑制IL-6基因表達對口腔鱗癌細胞侵襲能力的影響 a:各組細胞的Transwell細胞侵襲實驗圖 (結晶紫 ×40); b:Cal27細胞系實驗組與對照組的比較; c:SCC4細胞系實驗組與對照組的比較 注：*P<0.01 vs. Con，NC。

2.7 qPCR和蛋白質印跡實驗

由qPCR結果可知，比較Cal27/SCC4 Con、Cal27/SCC4 NC、Cal27/SCC4 IL-6shRNA1/3，STAT3(F=45.30/34.58，P=0.000/0.001)、VEGFA(F=28.18/43.41，P=0.001/0.000)、Cyclin B1(F=18.11/5.41，P=0.003/0.045)、MMP2(F=66.91/18.47，P=0.000/0.030)、Snail(F=1.91/10.88，P=0.03/0.01)基因表達均隨之明顯下降，而E-Cadherin(F=176.92/97.17，P=0.000/0.000)基因表達隨之顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot顯示IL-6蛋白表達下調后，p-JAK、p-STAT3、VEGFA、Cyclin B1、JAK2、Survivin、Snail蛋白表達均隨之明顯下降，而E-Cadherin蛋白表達隨之增加，見圖9。

圖8 抑制IL-6基因表達對口腔鱗癌細胞遷移能力的影響 a:各組細胞的Transwell細胞遷移實驗圖 (結晶紫 ×40); b:Cal27細胞系實驗組與對照組的比較; c:SCC4細胞系實驗組與對照組的比較 注：*P<0.01 vs. Con，NC。

圖9 IL-6敲低的口腔鱗癌細胞中各蛋白表達 a:qPCR檢測Cal27各組細胞中各基因表達狀況; b:qPCR檢測SCC4各組細胞中各基因表達狀況; c:Western blot法檢測Cal27 各組各因子表達情況; d:Western blot法檢測SCC4各組各因子表達情況 注：*P<0.05，**P<0.01 vs.Con，NC。

3 討論

本研究發(fā)現在口腔鱗癌中下調IL-6基因表達后，口腔鱗癌的細胞增殖、細胞侵襲及細胞遷移能力均受到了明顯的抑制，細胞周期發(fā)生了G2期阻滯，表明IL-6基因的表達變化能夠顯著影響口腔鱗癌的各種細胞表型，這提示IL-6基因可能與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其可能在口腔鱗癌的發(fā)病過程中起著關鍵作用。

在確認IL-6基因表達變化能夠影響口腔鱗癌各細胞表型后，本研究根據IL-6基因表達下調后口腔鱗癌細胞表型的變化情況，參考相關文獻[6-9]，選取了STAT3、JAK2、VEGFA、CyclinB1、MMP2、Snail、Survivin、E-Cadherin等基因作為待選的IL-6可能調控的下游通路基因作為研究對象。結果顯示，在口腔鱗癌中，IL-6基因表達下調后，STAT3、JAK2、VEGFA、CyclinB1、MMP2、Snail、Survivin基因表達均隨之明顯下降，而E-Cadherin基因表達隨之顯著增加，表明IL-6基因與這些下游通路基因之間存在著動態(tài)聯系和密切相關性，IL-6基因可能是通過調控這些基因的表達而影響口腔鱗癌的各種細胞表型。

有研究發(fā)現IL-6主要是靠激活JAK2和STAT3使其發(fā)生磷酸化而發(fā)揮作用。當JAK2和STAT3持續(xù)激活即p-JAK2和p-STAT3表達持續(xù)升高，則會造成下游相關的基因出現異常的高表達，從而促進腫瘤細胞增殖，抑制凋亡，促進細胞的侵襲和遷移等[10-11]。例如Prasad等[12]報道活化的STAT3可以通過調控Survivin、VEGF等基因而影響結腸癌細胞周期及促進腫瘤血管生成；Tsareva等[13]發(fā)現活化的STAT3和JAK2即p-JAK2/p-STAT3可以通過調控MMPs來增強結腸癌細胞侵襲能力；Colomiere等[14]報道活化的STAT3可以促進卵巢癌細胞EMT表型轉化，從而影響卵巢癌細胞的侵襲和遷移；Sulkowska等[15]報道p-STAT3可以通過促進Bcl-xL蛋白表達、抑制E-Cadherin蛋白表達而增強乳腺癌細胞侵襲和轉移能力。本課題研究結果顯示，在人口腔鱗癌中，發(fā)現p-STAT3的表達與IL-6基因的表達存在動態(tài)聯系，因此，結合文獻資料可以推測，在IL-6調控口腔鱗癌細胞表型的過程中，活化的STAT3即p-STAT3是一個關鍵中繼節(jié)點，IL-6可能就是通過活化JAK2,進而激活STAT3，進而影響下游眾多基因，從而影響口腔鱗癌的細胞增殖、侵襲以及遷移。

本研究發(fā)現在口腔鱗癌中下調IL-6基因表達后，細胞中VEGFA、CyclinB1、Survivin基因表達亦隨之明顯下降。因此，根據前述的VEGFA基因和CyclinB1基因的功能，以及口腔鱗癌中IL-6基因表達與VEGFA、CyclinB1基因和Survivin表達的動態(tài)聯系，推測IL-6基因可能是通過IL-6/JAK2/STAT3信號通路調控CyclinB1基因、Survivin基因以及VEGFA基因的表達，進而影響口腔鱗癌細胞周期和細胞增殖。此外，MMP2等可能也能夠通過介導E-cadherin蛋白外域脫落而減弱E-cadherin的作用。本研究還發(fā)現在口腔鱗癌細胞中下調IL-6基因表達后，細胞中MMP2、Snail基因表達隨之明顯下降，而E-Cadherin基因表達隨之顯著增加，因此可以推斷，IL-6基因可能是通過IL-6/JAK2/STAT3信號通路調控MMP2、Snail及E-Cadherin基因的表達，進而影響口腔鱗癌侵襲和遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現在口腔鱗癌中下調IL-6基因表達，可能誘導口腔鱗癌細胞周期發(fā)生G2期阻滯，并且顯著抑制口腔鱗癌細胞的細胞增殖、細胞侵襲及細胞遷移能力。進而探討IL-6基因影響口腔鱗癌細胞表型的具體作用機制，發(fā)現在口腔鱗癌細胞中，IL-6可能主要是通過IL-6/JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮作用，其可能是通過活化JAK2/STAT3，進而調控下游的VEGFA、CyclinB1、MMP2、Snail、Survivin、E-cadherin等基因，從而影響口腔鱗癌的各種細胞表型。IL-6/JAK2/STAT3信號通路可能與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其可能在口腔鱗癌的發(fā)病過程中起著關鍵作用，IL-6/JAK2/STAT3信號通路具有作為口腔鱗癌基因治療靶點的潛在價值，有必要進行更深入的研究。