曹玉潔,李正埼,周純,李華斌

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院 耳鼻咽喉科,上海 200031; 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科醫(yī)院 廣州市耳鼻咽喉科學(xué)重點實驗室,廣東 廣州 510080)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種IgE介導(dǎo)的鼻黏膜炎癥，其癥狀包括噴嚏、鼻癢、鼻塞和清涕，影響全球20%～40%的人群[1]。AR嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、工作效率及學(xué)習(xí)能力，并給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-4]。病毒感染是呼吸道感染最常見的原因之一，其中以鼻病毒最為典型[5]。氣道上皮細(xì)胞作為病毒感染和復(fù)制的宿主細(xì)胞利用模式識別受體識別病毒的病原體相關(guān)分子模式，并啟動下游免疫應(yīng)答。模式識別受體包括toll樣受體(toll-like receptors, TLR)3，它可以識別病毒雙鏈RNA(dsRNA)及其合成類似物poly (I:C)，以誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子和I型干擾素的表達(dá)[1,6-7]。鼻病毒的dsRNA在復(fù)制過程中產(chǎn)生，然后被TLR3識別[8]。研究報道，病毒感染可導(dǎo)致AR的發(fā)生和加重[9]。Greiff等[10]發(fā)現(xiàn)鼻病毒感染可激活嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以加重呼吸道炎癥。在社區(qū)獲得性感冒的急性期，AR患者的嗜酸性粒細(xì)胞水平升高[11]。Skoner等[12]也發(fā)現(xiàn)在鼻病毒-39刺激后，AR患者的白細(xì)胞、輔助T淋巴細(xì)胞、抑制型T淋巴細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量和功能與非AR患者相比均發(fā)生變化，這可能來源于先前存在的氣道過敏炎癥。此外，在病毒性感冒期間，AR患者的CT評分顯著高于非AR患者，鼻氣流和黏液纖毛清除率則較低[13-14]。綜上所述，鼻病毒感染的AR患者病情與氣道炎癥更為嚴(yán)重。然而，鼻病毒加重氣道炎癥的機(jī)制仍不清楚。為進(jìn)一步了解鼻病毒感染導(dǎo)致AR加重的分子機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出dsRNA刺激后AR鼻黏膜上皮細(xì)胞特異性差異表達(dá)基因 (differentially expressed genes，DEGs)。然后通過GO和KEGG進(jìn)行通路富集分析，以確定這些基因參與的生物學(xué)過程及功能。此外，通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，尋找AR特異性的關(guān)鍵基因和集簇。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載基于GPL13158平臺的GSE51392數(shù)據(jù)集。共選取11例受試者進(jìn)行進(jìn)一步分析，包括5例AR患者和6例健康對照受試者(healthy control，HC)。分離培養(yǎng)受試者鼻黏膜上皮細(xì)胞，poly (I:C)刺激24 h后提取RNA并使用微陣列(affymetrix U133+ PM genechip array)進(jìn)行分析[15]。

1.2 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理及DEGs篩選

使用R語言的affy包，采用robust multi-array average(RMA)算法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化[16-17]。根據(jù)注釋信息將探針I(yè)D映射到基因符號，如果多個探針對應(yīng)于同一基因符號，則對這些探針的表達(dá)值取平均值。本研究將數(shù)據(jù)分為3組進(jìn)行比較，分別是AR患者來源上皮細(xì)胞受dsRNA刺激前后的差異比較，HC來源上皮細(xì)胞受dsRNA刺激前后的差異比較，以及未刺激狀態(tài)下HC與AR患者來源上皮細(xì)胞之間的差異比較。使用limma包和經(jīng)驗貝葉斯方法篩選DEGs[15, 17-18]。采用false discovery rate(FDR)對P值進(jìn)行校正。篩選標(biāo)準(zhǔn)為校正后P<0.05。根據(jù)校正后P值和倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)的對數(shù)值繪制火山圖。利用UNIPROT數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)獲取基因的詳細(xì)注釋和功能[19]。

1.3 GO和KEGG通路富集分析

為了確定篩選出的DEGs參與的生物學(xué)過程及功能。本研究通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。DEGs的GO功能富集包括生物過程、細(xì)胞成分和分子功能3個層次。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和重要集簇選擇

使用STRING在線分析工具(search tool for retrieval of interactions genes，http://www.string-db.org/)以聯(lián)合評分≥0.700為臨界值構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果重新加載到cytoscape軟件(version 3.7.2)中進(jìn)一步分析。在網(wǎng)絡(luò)中，每個節(jié)點代表一個基因，連線代表節(jié)點之間的連接。Degree表示基因節(jié)點之間的連接或相互作用。Degree較高的節(jié)點被認(rèn)為具有重要生物學(xué)功能的hub基因。使用cytoscape的分子復(fù)合物檢測插件(molecular complex detection，MCODE)從PPI中提取重要基因集簇。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：“degree cutoff=2”，“node score cutoff=0.2”，“k-core=2”，“max. depth=100”。此外，在cytoscape中使用Glue GO插件對各集簇的基因進(jìn)行GO富集分析。

2 結(jié)果

2.1 dsRNA刺激后的AR特異性DEGs

通過篩選發(fā)現(xiàn)，HC來源上皮細(xì)胞經(jīng)dsRNA刺激后共9 550個DEGs，其中4 214個上調(diào)DEGs，5 336個下調(diào)DEGs。與基線水平相比，AR來源上皮細(xì)胞經(jīng)dsRNA刺激后共檢測到8 578個DEGs，其中3 605個上調(diào)，4 973個下調(diào)。而在dsRNA刺激前，未發(fā)現(xiàn)HC與AR的DEGs。為了進(jìn)一步探究AR上皮細(xì)胞對dsRNA的特異性應(yīng)答反應(yīng)，我們通過韋恩圖對3組DEGs進(jìn)行分析。共篩選出545個上調(diào)和400個下調(diào)的AR特異性DEGs。表1展示了根據(jù)差異倍數(shù)排列的前10個上調(diào)或下調(diào)的AR特異性DEGs。包括上調(diào)的血小板堿性蛋白(platelet basic protein，PPBP)，又稱C-X-C motif趨化因子7(CXCL7)以及下調(diào)的白細(xì)胞介素20(interleukin-20，IL-20)、B細(xì)胞連接蛋白(B-cell linker protein，BLNK)、CCAAT/增強(qiáng)劑結(jié)合蛋白delta(CCAAT/enhancer-binding protein delta，CEBPD)和淋巴細(xì)胞抗原96(lymphocyte antigen 96，LY96)。見圖1、2。

圖1 兩組上皮細(xì)胞分別受dsRNA刺激前后的DEGs火山圖 1A：HC; 1B:AR 紅點和藍(lán)點分別表示上調(diào)和下調(diào)的DEGs，黑點表示基因沒有顯著差異 圖2 兩組上皮細(xì)胞分別受dsRNA刺激前后以及基線水平HC和AR的DEGs的維恩圖 2A：上調(diào)基因； 2B：下調(diào)基因

表1 dsRNA刺激后差異變化前10位的AR特異性上調(diào)或下調(diào)的基因

2.2 DEGs的GO和KEGG富集分析

為了進(jìn)一步明確AR特異性DEGs參與的生物學(xué)過程及功能，我們分別對上調(diào)或下調(diào)的DEGs進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。結(jié)果圖3、4所示。dsRNA刺激后，AR特異的功能和信號通路包括增強(qiáng)的“cell adhesion”和“defense response”，以及受損的“positive regulation of tumor necrosis factor production”。

圖3 AR特異性上調(diào)基因的GO和KEGG通路分析 A：生物學(xué)過程；B：細(xì)胞成分；C：分子功能；D：KEGG通路

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

接下來我們使用STRING構(gòu)建了AR特異性DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)。該PPI網(wǎng)絡(luò)由791個節(jié)點和603條連線組成(圖5)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，我們選擇排名前16位的高Degree節(jié)點作為hub基因(圖6)，包括PPBP/CXCL7，它與中性粒細(xì)胞趨化和激活有關(guān)。通過MCODE從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出8組集簇，同時對各集簇進(jìn)行GO富集分析。本研究選擇綜合分?jǐn)?shù)高于5分的集簇進(jìn)行進(jìn)一步分析。共篩選5組集簇分別代表不同的生物途徑。集簇1(MCODE score=11.846)包括14個DEGs富集于nuclear-transcribed mRNA catabolic process, nonsense-mediated decay通路。集簇2(MCODE score=8.6)包括11個DEGs但未發(fā)現(xiàn)富集的GO通路。集簇3(MCODE score=8) 包括8個DEG富集于synaptic vesicle recycling通路。集簇4(MCODE score=6.615)包括14個DEGs富集于adenylate cyclase-inhibiting G protein-coupled receptor signaling pathway通路。集簇5(MCODE score=6)包括6個DEGs但未發(fā)現(xiàn)富集的GO通路。

圖4 AR特異性下調(diào)基因的GO和KEGG通路分析 A：生物學(xué)過程；B：細(xì)胞成分；C：分子功能；D：KEGG通路

圖5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，紅色代表上調(diào)DEGs，藍(lán)色代表下調(diào)DEGs

圖6 從PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出16個hub基因。Degree用從黃(低)到紅(高)的漸變顏色表示

3 討論

鼻黏膜上皮是呼吸道病毒感染和復(fù)制的主要部位。病毒感染導(dǎo)致的氣道炎癥加重可能是由病毒的直接損傷和宿主清除病毒這一免疫過程的間接損傷引起。病毒損傷呼吸道上皮后又可增加AR患者對變應(yīng)原的敏感性，進(jìn)一步加重炎癥[1]。Wagener等[15]鑒定了來自同一個體的鼻黏膜和支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)dsRNA刺激后的基因表達(dá)譜，并報道上、下呼吸道上皮對dsRNA感染的反應(yīng)大致相同，呼吸道病毒影響線粒體基因表達(dá)。Wesolowska-Andersen等[20]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)高病毒攜帶者的氣道免疫細(xì)胞浸潤增加、纖毛基因下調(diào)和2型炎癥受抑。用鼻病毒感染氣-液平面分化培養(yǎng)的下呼吸道上皮細(xì)胞后進(jìn)行RNA-seq分析，也發(fā)現(xiàn)一系列哮喘特異性病毒應(yīng)答相關(guān)基因，包括與炎癥通路、上皮結(jié)構(gòu)重塑以及纖毛組裝和功能相關(guān)的基因[21]。本研究比較了dsRNA刺激前后AR與HC上皮的DEGs，聚焦于dsRNA刺激后AR的特異性DEGs，包括上調(diào)基因PPBP/CXCL7以及下調(diào)基因IL-20、BLNK、CEBPD、LY96。此外，我們分析了dsRNA刺激后AR特異性DEGs相關(guān)的功能和信號通路。最后，我們從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出hub基因PPBP/CXCL7。以上結(jié)果可能有助于闡明RV感染導(dǎo)致AR炎癥加重的分子機(jī)制。

首先，我們發(fā)現(xiàn)dsRNA刺激后PPBP/CXCL7在AR中特異性上調(diào)，并作為PPI網(wǎng)絡(luò)中的hub基因。CXCL7可形成生物活性鏈，包括結(jié)締組織激活肽III(connective tissue-activating peptide III，CTAP-III)和中性粒細(xì)胞激活肽2(neutrophil-activating peptide 2，nap2)。據(jù)報道，CXCL7可促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附并穿越血管內(nèi)皮，且有重要的抗菌作用[22-23]。在穩(wěn)定型嚴(yán)重/非常嚴(yán)重慢性阻塞性肺病患者的支氣管黏膜中CXCL7的mRNA水平、CXCL7+細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量均增加，這表明CXCL7可能是重度慢性阻塞性肺病患者支氣管黏膜中性粒細(xì)胞增多的原因[24]。目前的研究表明CXCL7與中性粒細(xì)胞趨化和激活有關(guān)。然而，CXCL7在AR特異性病毒應(yīng)答中的作用尚不清楚，需未來進(jìn)一步研究。

另一方面，我們發(fā)現(xiàn)dsRNA刺激后AR上皮細(xì)胞中IL-20、BLNK、CEBPD和LY96特異性下調(diào)。IL-20屬于IL-10家族，在免疫應(yīng)答、炎癥調(diào)節(jié)、造血、表皮細(xì)胞和角化細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用。IL-20通過Janus激酶(Janus kinase, JAK)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)途徑主要激活STAT3。IL-20可促進(jìn)多種抗菌肽的產(chǎn)生，增強(qiáng)上皮細(xì)胞的屏障功能，并促進(jìn)白細(xì)胞的募集和激活[25]。有研究報道IL-20信號減少會導(dǎo)致炎癥和變應(yīng)原應(yīng)答增強(qiáng)。Myles等[26]報道IL-20RB信號可抑制皮膚炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致IL-1β和IL-17A的產(chǎn)生減少。Wahl等[27]報道體外刺激IL-20RB-/-缺陷的CD8和CD4 T細(xì)胞可導(dǎo)致IFN-γ和IL-2分泌顯著升高，IL-20RB-/-CD4 T細(xì)胞中IL-10分泌減少。他們發(fā)現(xiàn)IL-20RB-/-小鼠的一級和二級CD8 T細(xì)胞對變應(yīng)原的反應(yīng)比IL-20RB+/-小鼠高2～3倍。因此，IL-20可能直接作用于CD8和CD4 T細(xì)胞，減弱變應(yīng)原反應(yīng)特異性CD8 T細(xì)胞的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)在dsRNA刺激后，IL-20在AR上皮細(xì)胞中特異性下調(diào)；同時，IL-20RB在HC和AR上皮中均下調(diào)。然而在無dsRNA刺激時，HC和AR上皮中IL-20、IL-20RA和IL-20RB無差異。我們推測AR中特異性下調(diào)的IL-20可能增強(qiáng)變應(yīng)原應(yīng)答反應(yīng)。

BLNK是B細(xì)胞抗原受體信號通路的重要組成部分，是B細(xì)胞發(fā)育所必需的因子。BLNK也在調(diào)節(jié)B細(xì)胞祖細(xì)胞向B細(xì)胞前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28]。具有CD1dhiCD5+表型并產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞稱為B10細(xì)胞。雖然在BLNK-/-小鼠中存在B10細(xì)胞，但其IL10的產(chǎn)生能力在體內(nèi)和體外都受到了損害。BLNK-/-小鼠也表現(xiàn)出劇烈的接觸超敏反應(yīng)[29]。BLNK還通過介導(dǎo)Jnk/p38的激活促進(jìn)IgE+B細(xì)胞的凋亡。因此，BLNK-Jnk/p38通路缺陷可導(dǎo)致IgE+記憶B細(xì)胞和長壽命漿細(xì)胞的形成，持續(xù)表達(dá)IgE從而導(dǎo)致變應(yīng)性疾病[30]。基于現(xiàn)有的研究證據(jù)，我們推測BLNK在AR中特異性的下調(diào)可能導(dǎo)致IL-10表達(dá)減少和IgE的異常產(chǎn)生，從而促進(jìn)變應(yīng)性炎癥。

CEBPD作為轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞分化、代謝和免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。LY96可增強(qiáng)TLR2介導(dǎo)的細(xì)菌應(yīng)答，并增強(qiáng)TLR4介導(dǎo)的對細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的應(yīng)答[31-33]。這些基因的下調(diào)可能改變效應(yīng)細(xì)胞的功能，并介導(dǎo)下游細(xì)胞因子變化以參與AR特異性病毒應(yīng)答。但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究驗證。

基于功能富集分析的方法，我們研究了dsRNA刺激后AR特異的功能和信號通路。其中包括增強(qiáng)的“cell adhesion”和“defense response”，以及受損的“positive regulation of tumor necrosis factor production”。前者可增加炎癥細(xì)胞浸潤，增強(qiáng)先天免疫功能。而對于后者我們的研究發(fā)現(xiàn)，在dsRNA刺激后，TNF在AR和HC組均上調(diào)，而HC組(logFC：3.037526833)較AR組(logFC：2.674476928)有更高的表達(dá)趨勢。提示AR上皮在病毒應(yīng)答時TNF的產(chǎn)生能力下降。有研究報道在病毒性鼻炎中TNF-α的濃度顯著高于AR[34]。然而TNF是否與AR的病毒應(yīng)答有關(guān)，以及其詳細(xì)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

在本研究中，我們在基線水平未發(fā)現(xiàn)HC和AR之間的DEGs。該實驗中體外培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞平均需要24 d的時間生長到80%的融合狀態(tài)以接受刺激。因此在離開炎癥微環(huán)境后，AR表達(dá)譜趨于收斂。然而，后續(xù)的dsRNA刺激放大了AR的特征基因表達(dá)模式。

綜上所述，本研究通過比較dsRNA刺激前后AR與HC上皮中DEGs的差異，確定了AR特異性病毒應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組特征，并提示上調(diào)的hub基因CXCL7以及下調(diào)的IL-20、BLNK、CEBPD和LY96可能是鼻病毒誘發(fā)AR加重的重要因素。這些結(jié)果有助于提示鼻病毒感染導(dǎo)致AR加重的潛在機(jī)制，并為下一步的研究提供參考。