景菲，胡旭東，彭淵，邢楓，陶艷艷，劉成海，3

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；3.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

肺纖維化病因復(fù)雜，是多種肺疾病的共同結(jié)局，中位生存時間僅3～8年，嚴重影響患者存活率及生活質(zhì)量。近年來，我國肺纖維化患者數(shù)量呈明顯增多趨勢，中醫(yī)治療該病取得了一定成效。目前尚無治療肺纖維化的特效藥物，臨床治療的主要目標是減輕癥狀、延緩疾病進展和提高生活質(zhì)量。

扶正化瘀方由丹參、冬蟲夏草、絞股藍、桃仁、松花粉、五味子組成，適用于瘀血阻絡(luò)、肝腎不足者，臨床常用于肝纖維化的治療。本課題組前期研究表明，扶正化瘀方可減輕博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型大鼠的肺間質(zhì)炎癥和纖維化，臨床觀察發(fā)現(xiàn)其可明顯改善慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能，但該方治療肺纖維化的作用機制尚不清楚。因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和小鼠肺纖維化實驗驗證相結(jié)合的方法，探討扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在關(guān)鍵靶點和信號通路。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及靶點預(yù)測

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（https://www.tcmsp-e.com/，TCMSP）檢索扶正化瘀方組方藥物丹參、桃仁、冬蟲夏草、北五味子、絞股藍、松花粉的化學(xué)成分，以口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，獲得活性化合物及其作用的蛋白靶點，并根據(jù)文獻報道補充未預(yù)測到的活性化合物的已知靶點。

1.2 疾病相關(guān)基因篩選

以“pulmonary fibrosis”“fibrosing alveolitis”“idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（ https://www.genecards.org）、 OMIM（http://www.omim.org）數(shù)據(jù)庫，獲取肺纖維化的疾病相關(guān)基因。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

通過STRING平臺（https://string-db.org）將扶正化瘀方相關(guān)靶點蛋白名轉(zhuǎn)換成基因名，再與肺纖維化疾病靶點基因集合取交集，獲得交集基因。將交集基因所對應(yīng)的蛋白通過STRING平臺進行蛋白相互作用（PPI）分析，將生物種類設(shè)定為“homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（＞0.9），其余均為默認設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)及數(shù)據(jù)；將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape3.8.0軟件，運用 Network Analyze工具分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，靶點蛋白的節(jié)點度（degree）越大其在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.4 KEGG通路富集分析

利用 R 語言的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”“org.Hs.EG.db”數(shù)據(jù)包對扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在核心作用靶點進行KEGG通路富集分析，設(shè)定顯著性為＜0.05。

1.5 動物實驗驗證

1.5.1 動物及藥物

C57BL/6小鼠46只，雄性，SPF級，體質(zhì)量（24±2）g，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2019-0001。于獨立通氣籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由進食飲水。本實驗已獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準（PZSHUTCM200821006）。

扶正化瘀方干膏粉，上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司，批號200414；甲潑尼龍片，Pfizer Italia Srl公司，批號DL2665。

1.5.2 主要試劑與儀器

硫酸博來霉素（批號CSN10472），美國Csnpharm公司；生理鹽水（批號W180403G1），青島華仁藥業(yè)股份有限公司；Masson三色染色液（批號ab150686），英國Abcam公司；HE染色試劑盒（批號10004160），南京建成生物工程研究所有限公司；總RNA抽提試劑盒（貨號 B511321）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimescriptRTreagent Kit with gDNA Eraser（貨號 RR047A）、TBGreenPremix EX Taq擴增試劑盒（貨號RR420A），日本TaKaRa公司。

小動物喉鏡、液體定量霧化器（上海伯建生物科技有限公司），3-18KS型高速冷凍離心機（德國Sigma公司），BSA3202SCW型電子天平（德國Sartorius公司），BX51型顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司），ASP300全自動組織脫水機（德國徠卡公司），EG1140石蠟包埋機（德國徠卡公司），Leica RM2235石蠟切片機（德國徠卡公司），HI1210展片機（德國徠卡公司），HI1220烤片機（德國徠卡公司）。

1.5.3 模型制備及給藥

采用隨機數(shù)字表法將 46只小鼠分為正常對照組10只、模型組12只、扶正化瘀組12只、甲潑尼龍組12只。除正常對照組外，其余組小鼠應(yīng)用小動物喉鏡及液體定量霧化器進行一次性氣管內(nèi)霧化噴入博來霉素2 mg/kg。正常對照組氣管內(nèi)霧化等體積生理鹽水。造模次日起，扶正化瘀組和甲潑尼龍組分別灌胃扶正化瘀干膏粉（5.6 g/kg）、甲潑尼龍（10 mg/kg），每日1次。至第21日，以戊巴比妥鈉麻醉小鼠，打開胸腔，一側(cè)肺組織浸入福爾馬林中固定，另一側(cè)肺組織先置于液氮中，后放于-80 ℃冰箱冷凍保存。各組隨機選取5只小鼠肺組織進行qRT-PCR檢測。

1.5.4 肺組織病理學(xué)觀察

取經(jīng)福爾馬林固定的肺組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，貼附于載玻片上，脫蠟至水，酒精梯度脫水，采用HE染色試劑盒進行HE染色，采用Masson三色染色液進行Masson染色，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍片。

1.5.5 qRT-PCR檢測肺組織PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表達

肺組織勻漿后，使用總RNA提取試劑盒提取組織總 RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說明書操作。使用 Primier5.0軟件設(shè)計檢測基因的引物（見表1），使用SYBR Green嵌合熒光法于Roche480機器進行qRT-PCR。

表1 各基因qRT-PCR引物序列

1.5.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 扶正化瘀方活性成分及相應(yīng)靶點

經(jīng)TCMSP檢索并篩選，分別得到丹參、桃仁、冬蟲夏草、北五味子、絞股藍、松花粉的活性成分65、23、7、8、24、2個，相應(yīng)靶點 135、53、71、21、164、62個，去除重復(fù)后共得到125個化學(xué)成分、221個靶點基因。

2.2 肺纖維化疾病靶點

通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，分別獲得“pulmonary fibrosis”“fibrosing alveolitis”“idiopathic pulmonary fibrosis”相關(guān)基因5 492、256、3 236個，合并去除重復(fù)基因，共獲得肺纖維化疾病靶點基因5 897個。

2.3 潛在核心靶點生物信息學(xué)分析

對扶正化瘀方靶點基因和肺纖維化疾病靶點基因取交集，獲得扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在靶點基因191個。利用STRING平臺對交集基因?qū)?yīng)的蛋白進行PPI分析，扶正化瘀方治療肺纖維化靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)見圖1。利用Cytoscape3.8.0軟件分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，節(jié)點度排序前30位的核心靶點見圖2。其中AKT1居首位，提示AKT1可能是扶正化瘀方治療肺纖維化最關(guān)鍵蛋白。

圖1 扶正化瘀方治療肺纖維化靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 扶正化瘀方治療肺纖維化的關(guān)鍵靶點

2.4 核心靶點KEGG通路富集分析

核心靶點KEGG通路富集分析顯示，AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、C型凝集素受體信號通路等是扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在信號通路（見圖3、表2）。

圖3 扶正化瘀方治療肺纖維化核心靶點KEGG通路

表2 扶正化瘀方治療肺纖維化核心靶點KEGG通路富集分析結(jié)果

結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)分析和KEGG通路富集分析結(jié)果，扶正化瘀方可能通過調(diào)控 PI3K-Akt信號通路及通路中的AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2等基因表達發(fā)揮抗肺纖維化作用（見圖4）。

圖4 扶正化瘀方治療肺纖維化的PI3K-Akt信號通路

2.5 扶正化瘀方對模型小鼠肺組織形態(tài)的影響

正常對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，部分肺間隔輕度增厚，間質(zhì)可見少量慢性炎癥細胞浸潤；模型組小鼠可見巨噬細胞、淋巴細胞等浸潤，肺泡壁增厚及肺泡間隔增寬，在肺間質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見成纖維細胞聚集和膠原基質(zhì)沉積增加，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂；與模型組比較，扶正化瘀組和甲潑尼龍組小鼠肺泡壁增厚、炎癥細胞浸潤情況有所緩解。見圖5。

2.6 扶正化瘀方對模型小鼠肺組織纖維化的影響

正常對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見纖維組織增生；模型組小鼠肺泡間隔增厚，肺泡塌陷萎縮，可見大量膠原纖維沉積；與模型組比較，扶正化瘀組與甲潑尼龍組小鼠纖維組織增生有所減輕。見圖6。

圖6 各組小鼠肺組織形態(tài)（Masson染色，×100）

2.7 扶正化瘀方對模型小鼠肺組織PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肺組織 PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表達均明顯升高；與模型組比較，扶正化瘀組和甲潑尼龍組上述基因表達均顯著降低。見表3。

表3 PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量各組比較（±s）

3 討論

纖維化是肺臟損傷后過度修復(fù)的病理過程，早期主要表現(xiàn)為肺泡炎癥，后期可發(fā)展為大量成纖維細胞異常增殖和細胞外基質(zhì)大量沉積。其發(fā)病機制主要與機體免疫失調(diào)及炎癥有關(guān)。肺纖維化屬中醫(yī)學(xué)“肺痿”“肺痹”等范疇，可從“虛、瘀、痰、毒”角度進行闡述，為本虛標實之證，本虛以氣虛為主，標實以血瘀為重。雖然肺纖維化的病因病機復(fù)雜多變，但氣虛血瘀貫穿整個病程，故應(yīng)以扶正化瘀通絡(luò)為基本治法，虛實、標本同治。扶正化瘀方原用于治療肝纖維化，慢性肝病及肺病均有“正虛血瘀”的病機特點，存在異病同治、補虛化瘀的理論基礎(chǔ)及方-證效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，扶正化瘀方可通過抑制 MMP-2/9蛋白活性減少肺組織的炎癥破壞，起到抗大鼠肺纖維化的作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在作用機制。得到扶正化瘀方活性成分125種、相應(yīng)靶點基因221個，以及肺纖維化疾病相關(guān)靶點5 897個，交集基因191個。潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，扶正化瘀方治療肺纖維化的最重要靶點為AKT1；KEGG富集分析顯示，PI3K-Akt信號通路可能是扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在作用通路。PI3K-Akt信號通路具有調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡等功能，與肺纖維化關(guān)系密切。PI3K是生長因子受體超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要組成部分，激活后的PI3K可特異性催化磷脂酰肌醇環(huán)上的 3位羥基磷酸化，引起下游蛋白磷酸化，促進肺泡上皮細胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞外基質(zhì)沉積，從而形成肺纖維化。AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，可參與調(diào)控細胞增殖及代謝，促進纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。王曉艷等觀察肺泡巨噬細胞株NR8383細胞在染塵處理后的自噬情況，以 LY294002阻斷 PI3K途徑，發(fā)現(xiàn) PI3K-Akt信號通路參與了矽塵誘導(dǎo)肺泡巨噬細胞的自噬過程。馬愛平等發(fā)現(xiàn)，肺纖維化組織存在Akt過度活化，活化的Akt激活下游的HIF-1α信號通路，抑制肺泡表面活性物質(zhì)產(chǎn)生和肺泡上皮細胞的正常修復(fù)，從而加重纖維化。核因子-κB（NF-κB）是重要的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，在PI3K-Akt信號通路中，AKT活化可促進NF-κB激活，啟動下游的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等炎性因子，加重纖維化。細胞凋亡在肺纖維化發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，CASP9和Bcl2均是PI3K-Akt信號通路的下游靶蛋白，當細胞受到凋亡信號刺激時，會刺激線粒體釋放細胞色素 C及凋亡小體，引起Caspases家族發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，其中Caspase-9是細胞凋亡的激活劑。此外，孫曉芳等發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié) Bax/Bcl2蛋白和基因表達可抑制肺組織氣道上皮細胞凋亡，從而抑制小鼠肺纖維化的發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，扶正化瘀方可明顯減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷和肺纖維化，并顯著降低PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表達水平，推測扶正化瘀方可能通過調(diào)控 PI3K-Akt信號通路中相關(guān)基因的表達抑制肺組織炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在關(guān)鍵靶點和信號通路，并利用動物實驗進行了初步驗證，結(jié)果表明 PI3K-Akt信號通路可能是扶正化瘀方抗肺纖維化的關(guān)鍵信號通路，其具體機制尚待進一步研究。