陶昱岑，徐淑靜，張續(xù)杰，劉新泳，展鵬

（山東大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)研究所 化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250012）

傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)來源于多輪的化合物設(shè)計(jì)、合成與生物活性評(píng)價(jià)，需要從超過1060種可能的化合物結(jié)構(gòu)中去發(fā)掘潛在具有生物活性的小分子，該過程需要耗費(fèi)巨大的人力、物力與時(shí)間，已經(jīng)無法滿足當(dāng)前對(duì)新藥快速發(fā)現(xiàn)的迫切需求，因此，新方法、新理念亟待發(fā)現(xiàn)[1]。

進(jìn)入21世紀(jì)后，在高通量合成技術(shù)與生物活性篩選技術(shù)快速發(fā)展的基礎(chǔ)上，藥物發(fā)現(xiàn)的速度得到了極大的提升。其中，微量合成技術(shù)與生物活性篩選技術(shù)的有機(jī)結(jié)合極大地增加了先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的概率與速率。微量合成相比于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室合成具有極其顯著的優(yōu)點(diǎn)： 1）原料使用量大大降低，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本的同時(shí)也降低了化學(xué)廢料的排放量，更符合綠色化學(xué)的理念； 2）可以在短時(shí)間內(nèi)平行合成大量的化合物； 3）微量合成輔以智能反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)與合理的活性篩選方法，可以提高化合物從合成到活性篩選的自動(dòng)化程度，極大地節(jié)省了人力物力。因此，微量合成技術(shù)在新藥研發(fā)中的應(yīng)用越來越廣泛。微量合成技術(shù)的應(yīng)用主要包括在以下幾方面： 1）基于96或384孔微孔板的微量合成； 2）基于小分子或液滴微陣列的微量合成； 3）基于微流控芯片的微量合成； 4）靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的微量合成。本文精選近幾年的研究實(shí)例，根據(jù)微量合成的不同類別，從藥物化學(xué)的角度總結(jié)了基于微量合成的藥物研究進(jìn)展。

1 基于96或384微孔板的微量合成藥物

通過在微孔板上快速構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)多樣性的化合物庫，并輔以原位篩選技術(shù)可以極大地提高先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)效率。選擇一種合適的反應(yīng)來生成具有結(jié)構(gòu)多樣性的化合物庫是該策略的核心步驟，其基本特點(diǎn)為：目標(biāo)化合物產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)易于操作。目前，該方法中常用的反應(yīng)有點(diǎn)擊反應(yīng)[2]、酰胺縮合反應(yīng)[3]、多組分反應(yīng)[4]等。除此之外，也有文獻(xiàn)報(bào)道了利用氨基與醛基生成亞胺的反應(yīng)來快速構(gòu)建聚焦型化合物庫的方法等[5]。

單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）是一種具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的酶，主要分布于肝、腎、胰、心等器官。正常情況下，該酶可氧化胺類底物脫氨并產(chǎn)生過氧化氫。因此，MAO的過表達(dá)會(huì)使得機(jī)體內(nèi)過氧化氫、乙醛等過量蓄積，從而導(dǎo)致神經(jīng)元異常和情緒異常[6-8]。2016年，Jia等[9]利用點(diǎn)擊化學(xué)微量合成輔以原位篩選技術(shù)，快速合成并篩選了40個(gè)黃酮衍生物。該化合物庫設(shè)計(jì)思路為通過點(diǎn)擊化學(xué)在黃酮C6位引入不同片段，伸入毗鄰位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)潛在的雙位點(diǎn)抑制作用，其中化合物1的活性最好（對(duì)MAO-A的IC50為 1.6 μmol · L-1；對(duì)MAO-B的IC50為2.1 μmol · L-1）；化合物2的選擇性最高，對(duì)MAO-A無活性，對(duì)MAO-B的IC50為（71.3±7.6）μmol · L-1，其選擇性指數(shù)（SI）大于14。

溶酶體貯積癥（lysosomal storage diseases，LSD）是一組遺傳性代謝疾病，是由于基因突變致溶酶體中有關(guān)酸性水解酶缺陷，導(dǎo)致機(jī)體中相應(yīng)的生物大分子不能正常降解而在溶酶體中貯積，引起細(xì)胞組織器官功能障礙[10]。由LSD引發(fā)的戈謝病在世界各地均有報(bào)道，然而現(xiàn)在臨床對(duì)其缺乏有效的治療手段。2017年，Martínez-Bailén等[11]在吡咯亞氨基糖骨架的基礎(chǔ)上，通過點(diǎn)擊化學(xué)在96孔板上快速構(gòu)建了2類聚焦型化合物庫，并通過后續(xù)生物活性篩選發(fā)現(xiàn)了選擇性β-葡糖腦苷脂酶抑制劑3（IC50= 11 μmol · L-1）和4（IC50= 19 μmol · L-1）。2018年，Carmona等[12]通過點(diǎn)擊反應(yīng)原位篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)了α-巖藻糖苷酶抑制劑二聚體化合物5，β-半乳糖苷酶抑制劑二聚體化合物6，其中化合物5的抑制常數(shù)Ki為0.15 nmol · L-1；化合物6的Ki為5.8 μmol · L-1。

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲是一種常見的能引起患者腹瀉的寄生蟲[13-15]。目前治療賈第蟲病的主要藥物是硝基雜環(huán)類藥物，包括咪唑衍生物、甲硝唑、替硝唑、噻唑、硝唑苯胺衍生物等。但這些藥物的治療失敗率仍高達(dá)20%，并且有報(bào)道其體內(nèi)外的耐藥性[16]。Kim等[17]通過經(jīng)典點(diǎn)擊化學(xué)——銅（I）催化的炔烴-疊氮化物環(huán)加成反應(yīng)[The copper(I)-catalyzed alkyneazide cycloaddition，CuAAC]快速微量合成了442個(gè)含有不同側(cè)鏈取代基的氮雜環(huán)衍生物。對(duì)該化合物庫直接進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物7對(duì)代表性的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲突變株BRIS/83/HEPU/106具有良好的活性（EC50= 0.07 μmol · L-1）。

耐藥性的產(chǎn)生是癌癥治療失敗的主要原因之一。多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistanceassociated protein 1，MDR1）是一種腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP）結(jié)合蛋白，其可以將藥物泵出胞外，從而減少藥物在腫瘤細(xì)胞中的蓄積，降低藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[18-19]，抑制MDR1活性可以減少藥物外排量，從而達(dá)到藥物原有的治療效果。據(jù)報(bào)道，天然產(chǎn)物中的黃酮類化合物是該靶標(biāo)良好的小分子抑制劑，Wong等[20]選取黃酮結(jié)構(gòu)為基本骨架，通過點(diǎn)擊化學(xué)微量合成的方法在微孔板上高效地構(gòu)建了含有300個(gè)二聚體黃酮衍生物的化合物庫，原位篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)35個(gè)化合物對(duì)加有阿霉素（doxorubicin，DOX）的2008/MRP1細(xì)胞表現(xiàn)出較高的抑制率，后續(xù)活性復(fù)篩發(fā)現(xiàn)化合物8活性較好，EC50為（41±3） nmol · L-1，其對(duì)加有DOX的2008/MRP1細(xì)胞表現(xiàn)出了較好的活性，相比陽性對(duì)照MK571（9，EC50= 19 μmol · L-1）活性提升了400多倍。后續(xù)機(jī)制研究表明，化合物8在細(xì)胞內(nèi)可以有效抑制MRP1細(xì)胞活性，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX的外排作用，增強(qiáng)了DOX對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞株的殺傷力。

谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS1）是一種氨基水解酶，是腫瘤細(xì)胞生長與增殖的重要調(diào)控蛋白，通過抑制GLS1活性可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖擴(kuò)散[21]。因此，基于GLS1的小分子抑制劑研究非常重要。Xu等[22]以CB839（10）和BPTES（11）為先導(dǎo)化合物，通過生物電子等排策略，分別將CB839和BPTES右翼的苯環(huán)替換為三氮唑環(huán)。隨后通過點(diǎn)擊化學(xué)微量合成的方法將該片段與不同的小分子片段連接，在微孔板上高效地合成了200個(gè)目標(biāo)化合物。后續(xù)活性篩選發(fā)現(xiàn)化合物12（IC50= 0.041 μmol · L-1）的活性超過陽性對(duì)照CB839（IC50= 0.11 μmol · L-1）。

2018年，He等[23]選取O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（O-benzotriazole-N，N，N'，N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate，HBTU）催化的酰胺縮合反應(yīng)，在室溫下僅用12 h便在微孔板中平行合成了4個(gè)化合物庫（共768個(gè)化合物）。對(duì)庫中化合物快速篩選發(fā)現(xiàn)化合物13 ~ 15活性較好，抑酶活性復(fù)篩發(fā)現(xiàn)化合物13 ~ 15對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶2（src homology 2 containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2）具有良好的抑制活性，其中，化合物13的IC50為（1.5±0.1） μmol · L-1；化合物14的IC50為（1.4±0.04）μmol · L-1；化合物15的IC50為（2.3±0.04）μmol · L-1，化合物13的活性是陽性對(duì)照藥物頭孢磺啶[IC50=（16.8±2.0）μmol · L-1]的10多倍。藥理機(jī)制實(shí)驗(yàn)表明，化合物13在細(xì)胞層面可以通過抑制SHP-2介導(dǎo)的信號(hào)通路來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

近期，筆者所在課題組以細(xì)胞分裂周期因子25蛋 白（cell division cycle 25 phosphatase，Cdc25 phosphatase）磷酸酶的代表性抑制劑NSC663284（16）為先導(dǎo)化合物，選取優(yōu)勢(shì)萘醌片段，在其右翼通過點(diǎn)擊化學(xué)微量合成的方式引入不同的取代基，發(fā)現(xiàn)了高活性、高選擇性的Cdc25C磷酸酶抑制劑17，其 對(duì)Cdc25A的IC50為（0.53±0.03）μmol · L-1；對(duì)Cdc25B的IC50為（1.39±0.95）μmol · L-1；對(duì)Cdc25C的IC50為（0.09±0.01）μmol · L-1，其對(duì)Cdc25C活性相對(duì)于先導(dǎo)化合物NSC663284（IC50= 0.76 μmol · L-1）提高了近10倍[24]。此外，筆者所在課題組以二芳基嘧啶（diarylprimidines，DAPY）類化合物為先導(dǎo)，運(yùn)用基于藥效團(tuán)模型與靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)對(duì)DAPY類非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI）進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化[25]。隨后通過點(diǎn)擊化學(xué)微量合成的方法快速合成了234個(gè)DAPY衍生物，輔以原位篩選技術(shù)與活性復(fù)篩，短時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)了人類免疫缺陷病毒1型（humam immunodeficiency virus-1，HIV-1）抑制劑化合物18，其EC50為3.28 nmol · L-1。同時(shí)，化合物18對(duì)HIV雙突變株RES056也具有抑制活性，其EC50為481 nmol · L-1。

2021年，Sangouard等[26]將聲學(xué)液滴噴射（acoustic droplet ejection，ADE）技術(shù)與基于微孔板的微量合成相結(jié)合，短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建了大型組合大環(huán)化合物文庫。隨后通過直接篩選快速發(fā)現(xiàn)了鼠雙微粒體基因-2蛋白和p53蛋白（murine double minute 2-p53，MDM2-p53）蛋白-蛋白相互作用的抑制劑19，其展現(xiàn)出了良好的抑酶活性，IC50為（0.6 ±0.2） μmol · L-1。傳統(tǒng)的基于微孔板的高通量合成受到高成本移液頭和合成所需的毫克級(jí)前體化合物等因素的限制。為克服上述缺點(diǎn)，Sangouard等[26]對(duì)建庫方法進(jìn)行了改進(jìn)，并首次報(bào)道了應(yīng)用ADE技術(shù)，將砌塊庫逐步轉(zhuǎn)移到384孔微量滴定板中來合成大型組合大環(huán)化合物文庫的方法。該方法與傳統(tǒng)微孔板合成（反應(yīng)液體積為微升）相比，僅需要納升體積的反應(yīng)液，為基于微孔板的微量合成提供了全新的思路，避免了前體物料的過度消耗，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了綠色化學(xué)的理念。

需要指出的是，CuAAC是經(jīng)典的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)之一，但由于該反應(yīng)中催化所必需的銅離子對(duì)生物體系中的酶、細(xì)胞等具有毒性，因此易造成假陽性或假陰性結(jié)果。2004年，Agard等[27]提出了無銅催化的炔烴-疊氮環(huán)加成反應(yīng)（strain-promoted azidealkyne cycloaddtion，SPAAC）。通過環(huán)的構(gòu)象限制，可以提高炔烴的反應(yīng)活性，從而使得SPAAC可以在溫和的無銅催化下進(jìn)行。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是一類非常保守的蛋白酶，其可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡和促炎細(xì)胞因子的成熟，Qian等[28]選擇Vertex公司研發(fā)的口服Caspase-1抑制劑pralnacasan（20）為先導(dǎo)化合物，通過骨架躍遷策略，將pralnacasan分子中的六元和七元并環(huán)結(jié)構(gòu)替換為三氮唑并八元環(huán)，而后通過SPAAC反應(yīng)，在微孔板中快速合成了52個(gè)化合物。由于該反應(yīng)液中不含銅離子，因此可以直接用于細(xì)胞活性的初步篩選，接著選取抑制率最高的5個(gè)化合物對(duì)其進(jìn)行了后續(xù)的活性復(fù)篩。生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物21活性較好，其對(duì)Caspase-1的IC50為（0.899±0.001） μmol · L-1、對(duì)Caspase-3的IC50大 于 100 μmol · L-1、對(duì)Caspase-7的IC50大于140 μmol · L-1。

在96或384微孔板上進(jìn)行的微量合成除了上述的點(diǎn)擊反應(yīng)外，還包括多組分反應(yīng)。2020年，Osipyan等[29]報(bào)道了利用微量多組分反應(yīng)制備亞胺基吡咯烷聚焦庫的方法。該方法核心是利用即時(shí)噴點(diǎn)移液（immediate drop on demand technology，I-DOT）技術(shù)將載有原料的溶液準(zhǔn)確加入到384孔板中，并控制每孔所含反應(yīng)液為660 nL。反應(yīng)16 h后，將反應(yīng)液注入質(zhì)譜（mass spectra，MS）中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示大部分微孔（66%）中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率都在中等及偏上水平（≥ 50%）。接著，Osipyan等[29]又隨機(jī)選擇了12個(gè)微孔中的反應(yīng)進(jìn)行毫摩爾級(jí)的擴(kuò)大量合成以驗(yàn)證其產(chǎn)率。結(jié)果顯示，反應(yīng)底物有環(huán)酮時(shí)，反應(yīng)具有不錯(cuò)的產(chǎn)率（82% ~ 83%），然而當(dāng)酮類底物為環(huán)丁酮時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率僅有34%。醛基底物中，脂肪醛相比于芳香醛，更有利于目標(biāo)化合物的生成。該方法的報(bào)道豐富了微孔板合成技術(shù)的反應(yīng)類型，為后續(xù)基于微孔板的微量合成提供了新的反應(yīng)類型。同時(shí)，I-DOT技術(shù)的出現(xiàn)使得微量合成反應(yīng)中加料量的精確度進(jìn)一步提升，更加有利于微孔板中反應(yīng)的進(jìn)行。

2021年，Gao等[30]通過聲學(xué)傳感移液技術(shù)將3組分反應(yīng)液快速固定在微孔板中，短時(shí)間內(nèi)合成了1 536個(gè)化合物，后續(xù)通過原位篩選和抑酶活性復(fù)篩實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物22，其對(duì)多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤1型基因編碼蛋白（Menin）表現(xiàn)出了微摩爾級(jí)的活性，其IC50為2.8 μmol · L-1。除此之外，Gao等[30]通過共晶進(jìn)一步探討了化合物22與Menin蛋白的結(jié)合模式（見圖1A）。2021年，Sutanto等[31]通過Ugi多組分反應(yīng)和Passerini多組分反應(yīng)分別在96和384微孔板上快速構(gòu)建了具有結(jié)構(gòu)多樣性的化合物庫，由于終產(chǎn)物水溶性較差，當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，大部分終產(chǎn)物在微孔中直接析出，核磁氫譜顯示，該類析出化合物純度較高（純度大于 80%），而未析出的化合物可以通過快速柱層析迅速純化。隨后的高通量蛋白-小分子共晶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)苗頭化合物23 ~ 26與活性位點(diǎn)的氨基酸殘基Cys145形成共價(jià)結(jié)合，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）實(shí)驗(yàn)測(cè)定以上4個(gè)苗頭化合物對(duì)2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的主蛋白酶（3CL-Pro）的活性，其IC50分別為3.96、139.1、9.39及2.36 μmol · L-1，其結(jié)合模式如圖1B所示。

圖1 化合物22 ~ 26的結(jié)構(gòu)式及其與靶蛋白的結(jié)合模式Figure 1 Structures and binding modes of compounds 22 ~ 26

綜上，基于微孔板的高通量合成技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)平行合成大量化合物，極大地提高了苗頭化合物/先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的概率。同時(shí)，微量的條件下，反應(yīng)溶劑及試劑的消耗量極小，節(jié)約原料的同時(shí)，也減少了有毒廢棄物的排放，更符合綠色化學(xué)理念。除此之外，基于微孔板的微量合成技術(shù)由于其操作的簡便性、方法的實(shí)用性等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的實(shí)驗(yàn)室將該方法運(yùn)用到了新藥研發(fā)中[32-33]。

2 基于小分子或液滴微陣列的藥物

1995年，Schena 等[34]發(fā)明DNA微陣列技術(shù)，將已知序列的寡核苷酸固定在固體表面上，同時(shí)將待檢測(cè)的探針核酸序列與上述已知的核苷酸序列進(jìn)行雜交，從而實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測(cè)。隨著化學(xué)的發(fā)展，微陣列技術(shù)不再局限于DNA分子，蛋白質(zhì)分子、化學(xué)合成小分子等也相繼被固定到固相表面用于微陣列分析。小分子微陣列技術(shù)（small molecule microarray，SMM）是指將目標(biāo)化合物有序地固定到固體表面，從而實(shí)現(xiàn)快速、平行的活性篩選的技術(shù)[35]。SMM技術(shù)包含：化合物庫的合成、化合物的固定等，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑中的合成相比，SMM技術(shù)中的固相合成技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：自動(dòng)化程度高、反應(yīng)產(chǎn)率高，因此，其應(yīng)用越來越廣泛[36-38]。

乳腺癌相關(guān)基因1編輯蛋白（breast cancer 1 protein，BRCA1）是一種包含有磷酸化絲氨酸結(jié)合域的細(xì)胞調(diào)控蛋白，其可以抑制細(xì)胞的癌變，在DNA損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了突變型的BRCA1，因此針對(duì)BRCA1突變型的小分子抑制劑研發(fā)非常重要[39]。Na等[40]通過SMM技術(shù)，將優(yōu)勢(shì)氨基酸片段固定于活化玻璃板上，通過微量的酰胺縮合反應(yīng)，快速合成了101個(gè)擬肽類化合物。接著Takaoka等[39]使用N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷對(duì)玻璃板進(jìn)行多輪的清洗，快速除掉殘留的反應(yīng)液和催化劑，從而對(duì)玻璃板上的化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的活性篩選。該方法極大地縮短了化合物合成到先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的時(shí)間，Takaoka等[39]利用該方法成功地發(fā)現(xiàn)BRCA1抑制劑27（IC50= 0.31 μmol · L-1）（見圖2）。

圖2 先導(dǎo)化合物27的發(fā)現(xiàn)過程及結(jié)構(gòu)式Figure 2 Discovery and structure of compound 27

2017年，Peng等[41]針對(duì)多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，利用SMM技術(shù)，通過CuAAC點(diǎn)擊反應(yīng)在樹脂板上微量合成了1 120個(gè)化合物，后續(xù)的活性篩選發(fā)現(xiàn)化合物28是PARP14雙位點(diǎn)抑制劑（IC50= 0.49 μmol · L-1）。為了探討化合物28與PARP14的具體結(jié)合模式，Peng等[41]進(jìn)行了共晶的培養(yǎng)，結(jié)果顯示化合物28同時(shí)結(jié)合于2個(gè)空腔中，并與Ser1700、Ser1688、Thr1684、Ser1722等多個(gè)氨基酸殘基形成了氫鍵作用（見圖3）。

圖3 化合物28的設(shè)計(jì)、合成過程及其與PARP14蛋白的結(jié)合模式圖（PDB ID：5LYH）Figure 3 The design and synthesis of compound 28 and its mode of binding with PARP14（PDB ID：5LYH）

RNA是體內(nèi)重要的遺傳信息載體，其中微小核糖核酸21型（microRNA-21，miRNA-21）在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了過表達(dá)的現(xiàn)象。敲除腫瘤細(xì)胞中的miRNA-21后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。2010年，Medina等[42]通過小鼠模型確證了miRNA-21的過表達(dá)與前體B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生直接相關(guān)。然而，針對(duì)RNA的高親和力小分子抑制劑鮮有報(bào)道。2017年，Connelly等[43]通過微量合成將20 000個(gè)小分子固定于γ-氨基丙基硅烷 （γ--aminopropyl silane，GAPS）玻璃板上，接著將其與熒光標(biāo)記的premiRNA-21共孵育1 h后，通過熒光成像的不同判斷小分子與miRNA-21的結(jié)合力強(qiáng)弱（評(píng)分Z-score＞3即被認(rèn)為是苗頭化合物）。其中，19個(gè)化合物（Z-score＞3）表現(xiàn)出了對(duì)miRNA-21較好的親和力。后續(xù)活性復(fù)篩發(fā)現(xiàn)化合物29和30活性最好，其中，化合物29的解離常數(shù)（Kd）為（2.3±0.5） μmol · L-1；化合物30的Kd為（0.8±0.2）μmol · L-1。

2019年，Rosenfeld等[44]報(bào)道了在納米聚合材料上微量合成多肽的方法，其開發(fā)的納米聚合材料上有序地分布著親水性微孔，孔內(nèi)含有活化的光敏性鏈接基團(tuán)，從而有效地支持孔內(nèi)肽段的固相合成。Rosenfeld等[44]還證實(shí)該方法除了支持肽段合成以外，還可以在微孔中加入反應(yīng)液進(jìn)行微量的小分子化合物合成。后續(xù)通過特定波長的紫外光照射光敏性鏈接基團(tuán)，使其斷裂，從而釋放出目標(biāo)產(chǎn)物。通過改變光線照射時(shí)長與光線強(qiáng)度等因素，可以有效控制目標(biāo)化合物釋放的數(shù)量和時(shí)間等。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)化合物的微量合成與光誘導(dǎo)的控制釋放，輔以后續(xù)的原位篩選技術(shù)可以極大地提高化學(xué)合成到活性篩選的效率，增加苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)機(jī)率。

除了上述小分子微陣列技術(shù)以外，液滴微陣列也同樣是一種常見的微陣列技術(shù)。液滴微陣列技術(shù)是指將含有目標(biāo)化合物的甘油溶液有序滴加在固相表面，從而直接進(jìn)行活性篩選的技術(shù)。該技術(shù)有著諸多優(yōu)勢(shì)： 1）無需將溶液蒸干，液滴即為合成反應(yīng)的微環(huán)境； 2）與小分子微陣列相比，液滴微陣列技術(shù)無需通過化學(xué)反應(yīng)將化合物共價(jià)結(jié)合于平板表面，甘油自帶的表面張力與附著力保證了液滴有序地排列在固相表面； 3）甘油的微環(huán)境可以使得多種酶在體外環(huán)境中變得穩(wěn)定，同時(shí)，甘油也是一種極佳的液體介質(zhì)，其與二甲亞砜、水等常見溶劑完全互溶[45-47]。

由于干細(xì)胞的自我更新能力和高度分化能力[48-49]，使其在過去的幾十年中引起了醫(yī)學(xué)生物學(xué)家們?cè)絹碓綇V泛地關(guān)注。通過基于干細(xì)胞的高通量篩選發(fā)現(xiàn)對(duì)自身組織具有促進(jìn)更新與修復(fù)能力的小分子化合物是一項(xiàng)極有意義的研究[50-52]。但該研究的實(shí)施面臨著諸多問題，其中最主要的問題是干細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)會(huì)自發(fā)地細(xì)胞分化，從而使得實(shí)驗(yàn)失敗。2017年，Tronser等[53]證明了液滴微陣列技術(shù)可以成功阻止干細(xì)胞的自發(fā)性細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)中，Tronser等[53]發(fā)現(xiàn)液滴中的鼠源干細(xì)胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定，自發(fā)的細(xì)胞分化作用停止了72 h。后續(xù)機(jī)制實(shí)驗(yàn)表明，該現(xiàn)象可能歸因于固相載體表面的孔隙率和粗糙程度。雖然該實(shí)驗(yàn)僅短時(shí)間內(nèi)抑制了干細(xì)胞的自發(fā)分化作用，但為后續(xù)干細(xì)胞藥物研發(fā)提供了全新的思路與方法。

2020年，Brehm等[54]在之前研究基礎(chǔ)之上報(bào)道了光控釋放目標(biāo)產(chǎn)物的液滴微陣列技術(shù)。他們?cè)诓ＡП∑细采w一層多孔的納米聚合物材料，該材料每個(gè)微孔中都含有1個(gè)光敏連接鏈用以誘導(dǎo)微孔中的反應(yīng)進(jìn)行。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，通過多次洗滌該玻璃板，將殘留的反應(yīng)液清除干凈，之后在納米微孔中滴加溶劑，并同時(shí)使用365 nm的紫外光照射來控制產(chǎn)物按需釋放入微孔液滴中。后續(xù)通過在液滴中直接加入細(xì)胞，從而進(jìn)行快速的活性篩選。Brehm等[54]在該技術(shù)基礎(chǔ)之上，使用Ugi四組分反應(yīng)，在微滴中快速合成了588個(gè)化合物。

3 基于微流控芯片的藥物

從中世紀(jì)的煉金術(shù)開始，人們習(xí)慣于在玻璃器皿（燒瓶、燒杯）中操縱反應(yīng)原料，獲得產(chǎn)物。然而，面對(duì)人類對(duì)新物質(zhì)、新規(guī)律的不斷需求，傳統(tǒng)玻璃器皿的劣勢(shì)日漸凸顯：集成化、自動(dòng)化程度低，資源浪費(fèi)，選擇性、重現(xiàn)性差，以及安全隱患等。在此背景下，微流控芯片反應(yīng)器應(yīng)運(yùn)而生，并以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在合成方法學(xué)、藥物篩選以及大規(guī)模應(yīng)用等諸多領(lǐng)域扮演著重要角色。

微流控芯片反應(yīng)器一般是指微加工和精密加工技術(shù)制造的小型反應(yīng)系統(tǒng)，內(nèi)部微通道尺寸在亞微米到亞毫米數(shù)量級(jí)。常見的微流控芯片反應(yīng)器從材質(zhì)上分，有玻璃/石英/硅芯片、聚合物芯片和金屬芯片3類[55-57]。

玻璃和石英芯片因具有優(yōu)異的電滲、光學(xué)和表面性質(zhì)，其刻蝕加工方法和表面改性的化學(xué)方法比較成熟[33,58]。但由于玻璃芯片不耐強(qiáng)酸，因此其應(yīng)用也具有一定局限性。

有機(jī)聚合物類芯片由于其種類較多、加工方便，是玻璃和石英芯片不錯(cuò)的替代品。聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）芯片具有良好的光學(xué)性能，價(jià)格便宜易加工，應(yīng)用比較廣泛。PDMS的化學(xué)性質(zhì)大部分情況趨于穩(wěn)定，但遇到丙酮等會(huì)發(fā)生形變，并且這類芯片散熱不及玻璃和石英[59]。

不銹鋼芯片相比于以上3種芯片的穩(wěn)定性較高。這類芯片一般為多模塊組裝而成，易拆卸可清洗，避免了微通道發(fā)生堵塞而使整個(gè)反應(yīng)器報(bào)廢。但由于該類芯片的特殊材質(zhì)和各模塊的精密加工，不銹鋼芯片成本非常高，對(duì)微加工技術(shù)的要求也很高[60-61]。

不同材質(zhì)的微流控反應(yīng)器都具有擴(kuò)散距離短、傳質(zhì)更快的優(yōu)點(diǎn)?；瘜W(xué)反應(yīng)的實(shí)質(zhì)在于分子的碰撞從而反應(yīng)生成新的化學(xué)鍵，因此合成中反應(yīng)物的混合情況是提高反應(yīng)效率的關(guān)鍵之一。其次，微流控芯片反應(yīng)器相比傳統(tǒng)圓底燒瓶等反應(yīng)容器在比表面積上有了飛躍。微流控芯片反應(yīng)器比表面積通?？梢赃_(dá)到5 000~50 000 m2· m-3，超大的換熱面積使微反應(yīng)器的熱傳導(dǎo)系數(shù)與常規(guī)反應(yīng)器相比高出10倍，無論是對(duì)反應(yīng)的加熱還是反應(yīng)本身釋放的熱量都可以快速傳遞，從而使反應(yīng)溫度更穩(wěn)定，反應(yīng)過程的控溫更容易[62]。

以上幾大優(yōu)勢(shì)使得微反應(yīng)器在有機(jī)合成中的應(yīng)用越來越廣泛，這方面的研究也在不斷深入。

Grisoni等[63]將人工智能輔助藥物設(shè)計(jì)與微流控反應(yīng)器有機(jī)結(jié)合，極大地提高了苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的效率。他們首先針對(duì)肝X受體（liver X receptor，LXR）利用人工智能深度學(xué)習(xí)的方法對(duì)所獲得化合物庫進(jìn)行虛擬篩選，同時(shí)對(duì)篩選所得分子進(jìn)行合成可行性分析，最后得到了44個(gè)具有全新結(jié)構(gòu)的可合成化合物。其中，41個(gè)化合物通過自動(dòng)化的微流控反應(yīng)儀合成，3個(gè)化合物從試劑公司購買所得。接著Grisoni等[63]對(duì)其進(jìn)行了活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)化合物31和32分別是LXRα和LXRβ型的激動(dòng)劑，其EC50分別為 （0.183±0.006）和（0.34±0.02） μmol · L-1。該結(jié)果進(jìn)一步證明了微流控合成在藥物合成領(lǐng)域的可行性。同時(shí)，將微流控反應(yīng)儀與人工智能深度學(xué)習(xí)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）等分子設(shè)計(jì)與反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法整合，加快了苗頭化合物發(fā)現(xiàn)速率。

4 基于靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的合成策略

靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的合成（target-guided synthesis，TGS）是藥物發(fā)現(xiàn)中一種極其重要的策略，該策略以蛋白質(zhì)靶標(biāo)為模板誘導(dǎo)與其結(jié)合的小分子片段相互連接。該策略主要分為2類： 1）動(dòng)態(tài)組合化學(xué)（dynamic combinatorial chemistry，DCC），其目的在于建立可變通的適合新藥開發(fā)的組合庫，其途徑類似于分子水平上的達(dá)爾文進(jìn)化論。通過“適者生存”的方法，在組合庫重組的過程中，與模板無關(guān)的化合物或結(jié)合比較弱的配體逐漸“死亡”減少，解離成原來的“分子單元”，而這些分子單元在模板的引導(dǎo)下重新組合、反應(yīng)，形成新的活性配體，它們以此方式“繁殖”增加。組合庫的分子單元作為“生存”的競(jìng)爭(zhēng)者，依賴于單元之間的可逆反應(yīng)，與模板牢固結(jié)合的分子將產(chǎn)生新分子，然而，與模板結(jié)合較弱的分子將作為原料留在母液中。2）不可逆的蛋白模板誘導(dǎo)合成（kinetic target-guided synthesis，KTGS），該方法與DCC唯一不同的是，KTGS中的片段鏈接是不可逆的[64-66]。目前，2種方法均已被成功運(yùn)用在多種靶標(biāo)的苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)中[67]。

2017年，Wang等[68]在DCC策略的指導(dǎo)下，通過點(diǎn)擊化學(xué)原位合成技術(shù)將低活性（IC50＞1 mmol · L-1）的不同小分子片段拼接，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)具有透膜性的化合物33和34（見圖4A），其IC50分別為139和66.7 μmol · L-1。同年，Bhardwaj等[69]以2型環(huán)氧化酶（cyclooxygenase-2，COX-2）蛋白為模板，通過原位點(diǎn)擊反應(yīng)發(fā)現(xiàn)化合物35和36（見圖4B）（化合物35：IC50= 0.09 μmol · L-1；化合物36：IC50= 0.05 μmol · L-1）展現(xiàn)出了與陽性藥物塞來昔布（IC50= 0.07 μmol · L-1）相當(dāng)?shù)囊置富钚浴：罄m(xù)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物35和36在小鼠體內(nèi)活性明顯優(yōu)于陽性藥物塞來昔布，其半數(shù)有效量（median effective dose，ED50）分別為0.44 和0.12 mg · kg-1，而塞來昔布ED50為10.8 mg · kg-1。構(gòu)效關(guān)系分析表明，在引入甲磺?；幮F(tuán)后，化合物的活性有所提高。

圖4 化合物33 ~ 36的發(fā)現(xiàn)過程及其結(jié)構(gòu)式Figure 4 The discovery and structures of compounds 33 ~ 36

靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的合成中除了常見的點(diǎn)擊反應(yīng)以外，2020年，Mancini等[70]首次報(bào)道了蛋白模板誘導(dǎo)的原位四組分Ugi反應(yīng)。Mancini等[70]利用endothiapepsin蛋白為模板，選取羧基砌塊庫、氨基砌塊庫、氰基砌塊庫和醛基砌塊庫合成了48個(gè)化合物，其中化合物37和38對(duì)endothiapepsin蛋白表現(xiàn)出了微摩爾級(jí)的活性，其IC50分別為（1.3±0.03）和（3.5±0.1） μmol · L-1。隨后，Mancini等[70]又將原位四組分反應(yīng)成功應(yīng)用在了細(xì)菌β-滑動(dòng)鉗DnaN蛋白模板上，并發(fā)現(xiàn)了化合物39和40可以與靶標(biāo)蛋白相結(jié)合，其Kd分別為650和510 μmol · L-1。原位四組分反應(yīng)在2種蛋白模板上的成功豐富了TGS策略中的反應(yīng)類型。除此之外，Mancini等[70]觀察到Ugi反應(yīng)中的副反應(yīng)（Pictet-Spengler環(huán)合反應(yīng)）也在原位合成實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)生，因此，基于該類副反應(yīng)的蛋白模板誘導(dǎo)合成或許又是一種全新的嘗試。

值得注意的是，在大多數(shù)靶標(biāo)模板誘導(dǎo)的小分子片段組裝中，對(duì)酶的純度要求較高，這也限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。2018年，Antti等[71]報(bào)道了在細(xì)胞內(nèi)的蛋白模板誘導(dǎo)合成，為那些難以純化的蛋白模板提供了新的思路。

綜上所述，雖然TGS展現(xiàn)出了其在苗頭化合物發(fā)現(xiàn)中的高效性，但該技術(shù)依舊存在諸多限制。比如對(duì)蛋白質(zhì)與目標(biāo)小分子復(fù)合物的分析技術(shù)還未完全成熟，雖然現(xiàn)階段可通過共晶、核磁共振以及HPLC-MS等技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)-小分子復(fù)合物進(jìn)行分析，但這幾類技術(shù)需要耗費(fèi)大量的時(shí)間。除此之外，文獻(xiàn)中報(bào)道的能用于TGS方法的反應(yīng)比較匱乏，常見的反應(yīng)有：點(diǎn)擊反應(yīng)、酰胺縮合反應(yīng)、環(huán)氧乙烷的開環(huán)反應(yīng)等。因此，新的反應(yīng)類型和新型檢測(cè)技術(shù)亟需被發(fā)現(xiàn)。

5 結(jié)語與展望

在新藥研發(fā)中，藥物化學(xué)家們通過微量合成將優(yōu)勢(shì)片段、優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行重組裝，在保證藥物設(shè)計(jì)合理性與結(jié)構(gòu)新穎性的同時(shí)，加速了化合物庫的構(gòu)建，解決了新藥研發(fā)中“如何快速獲得大量目標(biāo)化合物”的難題。隨著分析檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建化合物庫的同時(shí)也能對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，如微量合成與LC-MS技術(shù)的聯(lián)用等。

同時(shí)，在多樣性導(dǎo)向合成理念的指導(dǎo)下，通過微量合成將現(xiàn)有小分子砌塊庫排列組合，進(jìn)一步豐富了化合物庫的結(jié)構(gòu)多樣性，為藥物化學(xué)家們闡明靶標(biāo)與化合物的潛在構(gòu)效關(guān)系提供了有力保障。除此之外，生物活性篩選技術(shù)的發(fā)展，使得對(duì)化合物庫的活性篩選更加準(zhǔn)確，假陽性/假陰性結(jié)果逐步減少，進(jìn)一步促進(jìn)了苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)。在苗頭化合物的基礎(chǔ)之上，微量合成與晚期多樣性修飾等新理念的有機(jī)結(jié)合可以縮短從苗頭到先導(dǎo)化合物所需的時(shí)間。

誠然，微量合成加速了苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的速率，但以下問題依舊值得注意： 1）片段的類藥性； 2）小分子砌塊庫的多樣性； 3）分子片段的手性異構(gòu)以及其大小等，這些問題直接決定了微量合成所構(gòu)建化合物庫的質(zhì)量，從而間接決定了最后苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的成功與否。此外，微量合成所使用的反應(yīng)類型也是庫的構(gòu)建中一項(xiàng)決定性因素。因此，基于微量合成的藥物發(fā)現(xiàn)需要藥物化學(xué)家們綜合考慮多種因素[72-73]。

綜上所述，微量合成與新方法、新理念的創(chuàng)新性組合，幫助藥物化學(xué)家們節(jié)約了大量的人力和物力，縮短了藥物研發(fā)所需的時(shí)間，將“以小博大”體現(xiàn)得淋漓盡致。雖然現(xiàn)階段微量合成在藥物研發(fā)中依舊面臨著部分不足之處，但隨著各學(xué)科的發(fā)展，學(xué)科之間的交叉與融合越來越廣泛、新方法與新理念的有機(jī)結(jié)合越來越普遍，微量合成在新方法、新理念的促進(jìn)下變得越來越成熟，為應(yīng)對(duì)未來公共健康危機(jī)的新藥研發(fā)提供了全新的思路。