黎高翔

自1970年開始，在酶制劑工業(yè)的基礎(chǔ)上，我國酶工程研究只局限于當(dāng)時(shí)興起的固定化酶及細(xì)胞、生物傳感器、生物反應(yīng)器以及天然酶誘變育種的酶制劑工業(yè)。在1988年召開的全國固定化生物催化劑會(huì)議上，已有大量成果問世，為中國酶工程的發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

但是，早在1971年美國工程基金會(huì)就已組織了第一屆國際酶工程會(huì)議，事隔10年，直至1981年在日本召開的第六屆國際酶工程會(huì)議上，才以張樹政院士為代表的我國科研人員首次參會(huì)。當(dāng)時(shí)，我國酶工程領(lǐng)域研究大大落后于國際水平。

為了適應(yīng)國際酶工程的迅猛發(fā)展，加強(qiáng)國內(nèi)外同行的學(xué)術(shù)交流與合作，在鄒承魯院士、張樹政院士和國內(nèi)著名專家倡議下，中國微生物學(xué)會(huì)于 1989年 7月成立了酶工程專業(yè)委員會(huì)，當(dāng)年就立即組織了12人代表團(tuán)赴日本參加第十屆國際酶工程會(huì)議，并與日方商約好每兩年召開一次中、日酶工程會(huì)議。直至2004年韓國要求加入形成了中、日、韓三方的酶工程會(huì)議。至現(xiàn)在，25年中連續(xù)成功舉辦了十四屆中、日、韓酶工程會(huì)議，已形成了亞洲酶工程的軸心。

1997年，經(jīng)國際酶工程組委會(huì)批準(zhǔn)，由我國酶工程專業(yè)委員會(huì)在北京主辦了第十四屆國際酶工程會(huì)議[1]，會(huì)議由南開大學(xué)俞耀庭教授和國際酶工程組織委員會(huì)委員黎高翔研究員任大會(huì)主席。會(huì)上，鄒承魯院士、張樹政院士、田波院士、王志珍院士等我國8位酶學(xué)專家作了特邀報(bào)告。顯示了中國酶工程研究的初步成果，獲得國際上的一致好評(píng)。此次大會(huì)云集了國際上很著名的酶工程專家教授，如美國Arnold F H教授、Klibanov A M教授、Blanch H B教授、Dordick J S教授、Russell A J教授、Clark D S教授、瑞典Mosbach K教授、德國Wandrey C教授、Scheller F教授、日本Tanaka A教授、Karube I教授、Shimizu S教授和以色列Katchalski-Katzir E教授等，是一次國際上高水平的酶工程盛會(huì)，與會(huì)者充分領(lǐng)略了國際酶工程的新領(lǐng)域、新思想、新技術(shù)。

這之后的 1989–2014年，我國共舉辦了 9屆全國酶工程會(huì)議，酶工程的研究和應(yīng)用在國內(nèi)得到廣泛重視，科研工作者們?nèi)翰呷毫Γ瑪U(kuò)展了酶工程研發(fā)的很多新領(lǐng)域，歷經(jīng)25年的奮斗拼搏，在我國各科研院校形成了許多優(yōu)秀的科研隊(duì)伍，建立了許多酶工程研發(fā)的技術(shù)平臺(tái)和中心，學(xué)術(shù)水平迅速提高，在酶工程的主要領(lǐng)域，已趕上或有些已超越了國際先進(jìn)水平，有些獲得國家科學(xué)技術(shù)發(fā)明和進(jìn)步獎(jiǎng)，為國家酶工程產(chǎn)業(yè)化作出了重要貢獻(xiàn)。

1 酶的基因工程與蛋白質(zhì)工程

工業(yè)生物催化在20世紀(jì) 90年代興起，與蛋白質(zhì)定向進(jìn)化、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展有關(guān)。工業(yè)生物催化的核心是酶的應(yīng)用，與傳統(tǒng)的化學(xué)催化相比較，生物催化有位點(diǎn)專一性和立體專一性的優(yōu)勢(shì)，人們可以按人類的意愿進(jìn)行“再進(jìn)化”手段，而不需要了解酶的結(jié)構(gòu)，可以采取基因克隆、隨機(jī)突變或雜交、定點(diǎn)突變，用易錯(cuò)PCR方法構(gòu)建突變庫，結(jié)合高通量篩選策略來提高酶的活性、穩(wěn)定性、立體選擇性及非水反應(yīng)性能。

我國在過去25年中 (至2014年)，共9屆的全國酶工程會(huì)議上，發(fā)表論文總數(shù)為978篇，其中酶基因工程與蛋白質(zhì)工程論文達(dá)到356篇，占總論文數(shù)36.4% (表1)。是一次很大的飛躍和崛起[2-10]?！渡锕こ虒W(xué)報(bào)》曾于2009年與2012年結(jié)合酶工程會(huì)議出版了“酶工程”系列?？痆11-12]。

木聚糖酶是半纖維素降解的關(guān)鍵酶，我國用橄欖綠鏈霉菌基因轉(zhuǎn)到畢赤酵母 Pichia pastoris獲得高效表達(dá)。酶活性為1 200 U/mL，比活性為2 869 U/mg。具非常好的抗蛋白酶降解能力[3]。嗜酸真菌Biospora sp. MEY-1四個(gè)基因成功克隆到畢赤酵母異源表達(dá)，重組酵母XYL11酶比活力為1 8831 U/mg，90 10℃ min仍保留87%以上活力。降解燕麥木聚糖主要產(chǎn)木糖和木二糖，具有很好抗蛋白酶降解的能力[8]。用黑曲IME-216產(chǎn)木聚糖基因克隆到釀酒酵母中表達(dá)，活力提高到 90 000 U/mL[8]，其余 30多篇木聚糖酶基因在Escherichia coli等中表達(dá)的論文不再一一詳述。

飼料用酶已成為世界工業(yè)酶產(chǎn)業(yè)中增長最快、實(shí)力最強(qiáng)的酶工業(yè)。植酸酶是飼料中植酸降解為無機(jī)磷酸和肌醇的飼料添加劑，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所將黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因重組到畢赤酵母中得到高效表達(dá)，酶活力達(dá) 8×105IU/mL，比原黑曲霉產(chǎn)量提高了3 000倍以上，大大高于國外報(bào)道的工程菌[4,11]，國內(nèi)已建立了多家生產(chǎn)企業(yè)。

纖維素酶是多酶的復(fù)合酶系，非理性設(shè)計(jì)是目前纖維素酶定向進(jìn)化的方法，木霉纖維素外切酶和纖維素內(nèi)切酶已在噬菌體展示功能。目前已經(jīng)克隆表達(dá)一批中堿性纖維素酶的基因，可用于紡織和洗滌劑，造紙工業(yè)用途的中性內(nèi)切纖維素酶工程菌優(yōu)化培養(yǎng)，酶活可達(dá)32 529 U/mL[10]，提高了原株的7.8倍。將福壽螺 Ampullaia crossean多功能纖維素酶基因在E. coli中表達(dá)，得到高比活力纖維素酶系，對(duì)木聚糖、對(duì)硝基酚纖維二糖苷、羧甲基纖維素有很好的水解活性[5]?？寺M康木霉S38 Swollenin基因可能是破壞氫鍵，是真菌降解纖維素酶系的組成部分[6]。此外，我國還開展了黃翅大白蟻木質(zhì)纖維素降解酶系的研究[10]。

脂肪酶是生物合成中一個(gè)重要酶類。目前我國已建立了通過理性設(shè)計(jì)成熟的 3個(gè)脂肪酶基因改造、生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)平臺(tái)。用基因改組技術(shù)將抗展青霉 Penicillium expansum FS 8486酶活力提高了317%[7]。對(duì)脂肪酶“蓋子”結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，獲得開蓋型脂肪酶，酶比活力提高5.7倍，兩相催化效率提高1.8倍[8]。我國還構(gòu)建了表面展示工程菌、E. coli工程菌、畢赤酵母工程菌、高密度培養(yǎng)的技術(shù)平臺(tái)，假絲酵母 Candida sp. 99–125脂肪酶活力達(dá)到15 000 U/mL以上[9]?？寺∶缀诟?R. miehei脂肪酶在兩個(gè)畢赤酵母成功表達(dá)，最高酶活力達(dá)到18 000 U/mL。4 6℃?zhèn)€月酶活力不下降，12 h生物柴油產(chǎn)率超過95%[9]。華根霉Rhizopus chinensis脂肪酶基因克隆到畢赤酵母中成功表達(dá)，兩種共表達(dá)的伴侶蛋白可使酶活力提高30%，酶活力達(dá)16 200 U/mL[10-11]。同時(shí)，亦開展了對(duì)有機(jī)溶劑耐受性、熱穩(wěn)定性好的細(xì)胞結(jié)合脂肪酶的研究。

淀粉酶是非常重要的工業(yè)用酶，占酶制劑市場(chǎng) 25%。目前工業(yè)主要是高溫酶，來自深海液口嗜熱厭氧古細(xì)菌熱球菌屬Thermococcus產(chǎn)胞外耐熱高溫酶，最適溫度95 ℃，100 ℃仍有60%活力，用PCR法克隆此酶基因，并在E. coli中得到表達(dá)[7]。又從云南騰沖分離兩株耐熱生淀粉生產(chǎn)的Geobacillus細(xì)菌，經(jīng)純化后，比活力分別為1 320和890 U/mg[7]。用PCR法克隆了嗜堿芽胞桿菌Bacillus alcalophilus基因，其中枯草芽胞桿菌異源表達(dá)，活性為450 U/mL[9]。中溫酸性α-淀粉酶，對(duì)淀粉加工有節(jié)能降耗作用，Bacillus sp. α-淀粉酶基因與B. amyliquefaciens α-淀粉酶基因有98%的同源性[7]。

甘露聚糖酶屬于半纖維素酶，適用于甘露寡糖制備。肇東市日成酶制劑公司用黑曲霉工程菌酸性β-甘露聚糖酶表達(dá)活力達(dá)20 000 U/mL，為目前生產(chǎn)菌株水平的25倍，處于真菌基因工程菌領(lǐng)先地位[10]。利用DNA shuffling定點(diǎn)突變獲得耐高溫耐酸的A. tabescens MAN 47 β-甘露聚糖酶突變體，高溫80 ℃、pH 4.0酶活力為野生型的10倍。定向引入N-糖基化位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了野生型和突變型在畢赤酵母中的表達(dá)，熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、蛋白酶抗性均得到改善。也獲得了比野生型甘露聚糖酶活性高 3–5倍的 3個(gè)突變體[10-11]。從嗜熱網(wǎng)球菌中克隆獲得熱穩(wěn)定的β-1,4-甘露聚糖酶，在80 ℃高溫低滲油井中、對(duì)羥基瓜爾膠有最高活力。該酶半衰期為46 h[10]。

漆酶為含銅多酚氧化酶，為木質(zhì)素分解酶，亦可催化合成酚類、芳香胺的低聚物。擔(dān)子菌漆酶酶基因克隆到畢赤酵母中表達(dá)活力為9.03 U/mL，為原始菌株的3倍[5]。野生革耳Panus rudis漆酶轉(zhuǎn)化到畢赤酵母分泌表達(dá)，通過定點(diǎn)突變及隨機(jī)突變后，酶比活力為16.17 U/mg，提高了4.4倍[7]。新型海洋細(xì)菌漆酶經(jīng)氨基酸定點(diǎn)突變，突變體半衰期延長3倍，可溶性蛋白較優(yōu)化前提高244%。發(fā)酵產(chǎn)率為野生型的 7.9倍[10]。熱帶白腐真菌菌株漆酶酶活力達(dá)11 400 U/L (愈創(chuàng)木酚法)[7]。

普魯蘭酶又稱茁霉多糖酶，屬解枝酶，分解α-1,6-葡萄糖苷鍵。嗜熱古菌Thermococcus sp.HJ21產(chǎn)胞外高溫普魯蘭酶，最適溫度95 ℃，酶活力在100 ℃、2 h仍有50%以上活力[7]。通過PCR技術(shù)克隆了此酶基因。溫泉中厭氧芽胞桿菌屬Anoxy bacillus sp. p28克隆到普魯蘭酶基因序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化到E. coli中，產(chǎn)物為單一麥芽三糖，為Ⅰ型普魯蘭酶。從騰沖熱泉中分離出耐熱厭氧芽胞桿菌普魯蘭酶基因?qū)肟莶菅堪麠U菌中得到表達(dá)。60 ℃、48 h仍保留 50%以上活力，胞外酶活力 42 U/mL，表達(dá)活力提高了40倍[10]。南京百斯杰生物工程公司通過基因敲除及重組技術(shù)，改造野生芽胞桿菌普魯蘭酶基因，與葡萄糖淀粉酶制成復(fù)合酶，可制備出DE值超過96.5的葡萄糖，商品名為High DEX系列，滿足了葡萄糖生產(chǎn)，達(dá)到國際水平[10]。

青霉素?；甘?β-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)的關(guān)鍵酶。我國已成功進(jìn)入酶合成抗生素工業(yè)，青霉素?；竿ㄟ^誘變獲得突變株活力為 820 U/mL[2]。克隆巨大芽胞桿菌青霉素?；富蛟诳莶輻U菌中表達(dá)活力為30 U/mL[4]。青霉素?；冈诳莶菅堪麠U菌中分泌表達(dá)，表達(dá)量為864 U/L，是野生型類產(chǎn)桿菌A. faecalis產(chǎn)量的144倍[5]。糞產(chǎn)桿菌的青霉素?；冈贓. coli中分泌表達(dá)，改進(jìn)培養(yǎng)的工程菌酶活力＞2 000 U/L。7-氨基頭孢烷酸?；?(GL-7-ACA?；? 可轉(zhuǎn)化頭孢菌素C，在E. coli中表達(dá)，最高酶活力達(dá)266 U/L[5]，用Eupergitc載體固定化巨大芽孢桿菌青霉素酰化酶，連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)30批次，活力未見下降[6]。

D-氨基酸氧化酶可催化D-氨基酸生成相應(yīng)的酮酸和氨，此酶與 7-氨基頭孢烷酸酰化酶(7-ACA?；? 兩步法生產(chǎn)頭孢菌素重要原料7-氨基頭孢烷酸 (7-ACA)。用甲醇酵母表達(dá)的D-氨基酸氧化酶，構(gòu)建了高表達(dá)的畢赤酵母重組菌。14 L罐發(fā)酵活力達(dá)8 000–1 2000 U/L[5]。構(gòu)建了畢赤酵母融合表達(dá)的 D-氨基酸氧化酶活力為1 700 U/L[5]，還構(gòu)建了兩種重組GL-7-ACA?；?，組成型菌株達(dá)到1 500 U/L，誘導(dǎo)型菌株達(dá)900 U/L，固定化酶轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%[5]。三角酵母D-氨基酸氧化酶基因轉(zhuǎn)到E. coli中，表達(dá)活力為23.3 U/mL[5]，D-氨基酸氧化酶固定化在 Amberzyme環(huán)氧樹脂上轉(zhuǎn)化 14批次，活力未見下降[6]。對(duì)羥基苯甘氨酸是半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要中間體，可通過海因酶和 D-氨甲酰水解酶兩步催化制備，通過對(duì)D-氨甲酰水解酶隨機(jī)突變，在E. coli中可溶性提高了6倍[6]，重組表達(dá)E. coli的D-海因酶可溶性差，共表達(dá)分子伴侶可將可溶性表達(dá)量提高約3倍[7]。

羰基還原酶不對(duì)稱還原羰基化合物廣泛用于制備手性醇。天藍(lán)色鏈霉菌羰基還原酶制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。其重組菌E. coli BL21制備了 (S)-4-氯-3-4-苯基丁酸乙酯和 (S)-鄰氯扁桃酸甲酯，轉(zhuǎn)化率和ee值均高達(dá)99%以上[9]。面包酵母羰基還原酶基因同源表達(dá)產(chǎn)物對(duì)映體ee值和產(chǎn)率均有提高。近平滑假絲酵母基因組中克隆出新型 (S)-型羰基還原酶，重組菌E. coli BL 21能制備 (S)-苯基乙二醇，光學(xué)純達(dá)99.1%，產(chǎn)率為89.6%[8,11]。

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系的重要組分，可將纖維二糖、可溶性纖維寡糖水解成葡萄糖及相應(yīng)配基，水解β-糖苷鍵及合成新的糖衍生物。瑞士木霉β-葡萄糖苷酶，通過基因敲除、氨基酸突變，突變體酶活力比野生型提高了 143倍[9]。新鞘氨醇桿菌β-葡萄糖苷酶基因在E. coli成功表達(dá)，可轉(zhuǎn)化異黃酮糖苷生成相對(duì)應(yīng)的苷元[10]。臺(tái)灣乳白蟻腸道中的 β-葡萄糖苷酶，用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)，突變酶較野生型酶活力提高了2.6倍。亦提高了葡萄糖耐受性及熱穩(wěn)定性[10]。斜臥青霉 β-葡萄糖苷酶進(jìn)行基因改造，通過轉(zhuǎn)化獲得 3個(gè)表達(dá)菌株，酶活力比原始菌株提高3.4–3.7倍[10]，從非解朊棲熱菌分離到耐熱β-葡萄糖苷酶基因在E. coli中克隆表達(dá)，酶活力提高17倍[4]。從海洋宏基因組篩選到葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶克隆到E. coli高效表達(dá)，葡萄糖濃度低于400 mmol/L，對(duì)酶有促進(jìn)作用，達(dá)到 1 000 mmol/L葡萄糖濃度，酶活性為50%[8,11]。利用 DNA改組和定點(diǎn)突變提高 β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性，4個(gè)突變體與野生型相比，61 ℃熱失活半衰期提高了14.16、68和44倍。耐熱性有明顯提高[8]。

半乳糖苷酶，又名乳糖酶，能將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖基，可以合成低聚糖。通過宏基因組法從海底泥中獲得高效轉(zhuǎn)糖基的 β-半乳糖苷酶，在E. coli中可溶性表達(dá)，對(duì)有機(jī)溶劑有耐受性，合成低聚半乳糖產(chǎn)量可達(dá)51.6%[9]。曲霉α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵，酶活力達(dá)305 IU/g[6]。硫磺礦硫化葉菌Sulfolobus solfataricus P2的 β-半乳糖苷酶進(jìn)行分子改造構(gòu)建了突變體，突變酶F441Y生產(chǎn)低聚半乳糖，產(chǎn)率達(dá)61%，較野生型高10%左右[9]。

腈水合酶在酰胺、羧酸及其衍生物合成中有重要應(yīng)用價(jià)值，催化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺，諾卡氏菌Nocardia sp. YS-2002發(fā)酵活力最高達(dá)6 000國際單位，在E. coli及畢赤酵母中得到表達(dá)[5]。

菊粉酶是水解菊粉的 β-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的水解酶，產(chǎn)低聚果糖，分內(nèi)切酶和外切酶兩種。將黑曲霉菊粉內(nèi)切酶基因克隆到畢赤酵母得到高效表達(dá)，重組酶活力達(dá)128 U/mL，達(dá)到國際水平[9]。

海藻糖合成酶，海藻糖在食品、醫(yī)學(xué)、輕工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，可用單酶法從麥芽糖生產(chǎn)海藻糖，通過酶分子的理性設(shè)計(jì)和DNA shuffling技術(shù)從兩個(gè) GRAS菌種和兩個(gè)嗜熱菌中克隆到海藻糖合成酶基因并成功進(jìn)行了高效表達(dá)，已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[5]。

中性蛋白酶廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)，枯草芽胞桿菌AS1398基因Npr的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B. subtilis AS 1398，獲得多拷貝的重組菌，連續(xù)傳代 30代，重組菌質(zhì)粒穩(wěn)定性保持100%，蛋白酶表達(dá)水平提高1倍以上，達(dá)到24 000–28 000 U/mL[10]。有高效殺線蟲毒力的側(cè)孢短芽胞桿菌株經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)獲得蛋白酶的活力達(dá)12 379 U/mL，比優(yōu)化前提高5倍，應(yīng)用B. subtilis WB600表達(dá)體系，構(gòu)建隨機(jī)突變文庫，獲得熱穩(wěn)定的突變體，為生物殺蟲劑提供依據(jù)[8]。人基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在E. coli中成功克隆表達(dá)了該酶，為研究該酶與腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理和尋找該酶特異抑制劑奠定基礎(chǔ)[5]。

葡聚糖酶屬水解酶，分內(nèi)切酶和外切酶，用于啤酒生產(chǎn)和飼料添加。嗜熱青霉 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入E. coli BL 21誘導(dǎo)表達(dá)，酶活力240 U/mL[8]，鏈霉菌S27內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶基因在E. coli中高效表達(dá)，可水解昆布多糖等，可抑制致病真菌和產(chǎn)毒素真菌[8]。長梗木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍副磉_(dá)，重組菌Ⅲ酶活力達(dá)110 U/mL，優(yōu)化后提高 50%[8]。點(diǎn)突變極耐熱 Thermotoga maritima內(nèi)切葡聚糖酶 Cell-12B，酶最適溫度95 ℃，90 ℃仍保留70%活力[10]。

N-乙酰神經(jīng)氨酸是生物體內(nèi)一種最重要的唾液酸，唾液酸糖鏈參與許多生命過程，CMP-唾液酸能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，對(duì)CMP-唾液酸合成酶基因進(jìn)行堿基改造，在E. coli中得到高效表達(dá)，酶表達(dá)量占總蛋白26.5%，酶活力為100 U/L，為出發(fā)菌株的850倍[4]。

黃曲霉毒素解毒酶為一種加氧酶，用重組技術(shù)構(gòu)建基因在畢赤酵母中高密度發(fā)酵表達(dá)，酶占總蛋白量56%，表達(dá)量達(dá)814.5 mg/L[6]。將酶突變基因重組質(zhì)粒引入E. coli擴(kuò)增轉(zhuǎn)入釀酒酵母，建立突變文庫，突變體 A1773酶活提高5倍。突變體A1242耐高溫性提高了3.5倍。突變體DS1474酶比活力56 U/mg，突變體DS896酶比活力為44 U/mg[9]，已獲準(zhǔn)在飼料中作為除毒的酶產(chǎn)品。

煙曲霉真菌感染是困擾人類健康的難題，系統(tǒng)研究煙曲霉基因組中50多個(gè)糖基化途徑相關(guān)基因，先后從煙曲霉中克隆了幾丁質(zhì)酶、磷酸甘露糖異構(gòu)酶、O-甘露糖轉(zhuǎn)移酶、α-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、α-葡萄糖苷酶I及CMP-唾液酸合成酶等基因、對(duì)了解真菌糖基化機(jī)制、開發(fā)基因工程藥物、抗真菌感染藥物有意義[6]。

L-天冬酰胺酶有明確治療白血病的效果，通過DNA重組技術(shù)，將L-天冬酰胺酶特異單鏈抗體片段與酶構(gòu)建融合蛋白，提高了酶在體內(nèi)的穩(wěn)定性，重組E. coli AS 1357工程酶活力提高達(dá)228 U/mL，相當(dāng)野生菌的50多倍[4]。

用宏基因組學(xué)法將酯酶基因轉(zhuǎn)入E. coli中，構(gòu)建的工程菌提高了活力，表達(dá)量為200 mg/L，酶活力達(dá)180 U/mg，與野生型比較60 ℃熱穩(wěn)定性提高144倍和196倍，獲得了可降解氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氟氯氰菊酯的新型聚酯類農(nóng)藥降解突變酯酶[9]。

重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶，1 t發(fā)酵罐產(chǎn)酶最高達(dá)1 315 U/mL[8]。黑曲霉EIM-6培養(yǎng)優(yōu)化后果膠酶活力可提高至30 231 U/mL[8,11]。

假單胞菌水楊酸羥化酶基因克隆到 E. coli表達(dá)了兩個(gè)萘降解酶，可降解水楊酸、乙酰水楊酸、磺基水楊酸、水楊醛、間硝基苯甲醛、5-氯水楊酸、辛醛及鄰硝基苯甲醛等[5]。

有機(jī)磷酯類是一類高毒化合物，用于殺蟲劑、除草劑或作為神經(jīng)毒劑?？寺×思賳伟袡C(jī)磷酯水解酶，通過氨基酸位點(diǎn)突變，在E. coli中重組表達(dá)，對(duì)有機(jī)磷酯水解能力提高了約7 000倍[10]。

α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中獲得能分解淀粉和生產(chǎn)酒精的 6株酵母工程菌——JL1082工程菌經(jīng)固定化包埋，葡萄糖淀粉酶活力最高達(dá)170 U/mL，淀粉水解率80%以上，產(chǎn)酒率可達(dá)13.3%，在廣西酒精廠年產(chǎn)5 000 t，工程菌AD (YIP19RGAn) 白酒實(shí)驗(yàn)，酒精度為43%，大米利用率為96.16%[5]。

將合成β-聚羥基丁酸酯 (PHB) 的酶基因，λ-噬菌體裂解細(xì)胞的酶基因及能合成血紅蛋白VHb的酶基因——合成透明顫菌血紅蛋白酶基因Vgb，共同轉(zhuǎn)入E. coli中，發(fā)酵產(chǎn)聚β-羥基丁酯(可降解的高分子) 工程菌PHB產(chǎn)量達(dá)194 g/L，占細(xì)胞干重高達(dá) 90%，同時(shí)解決了破壁及高密度培養(yǎng)的生化工程問題，已進(jìn)行投產(chǎn)[5]。

抗體酶，又叫催化抗體，具有抗體高選擇性和酶的高效催化性。谷胱甘肽過氧化物酶(GPX) 可以清除體內(nèi)活性氧 (ROS) 所帶來的細(xì)胞損傷，治療炎癥、糖尿病和心血管病等。根據(jù)Pauling過渡態(tài)理論，設(shè)計(jì)了多種含硒的谷胱甘肽過氧化物酶模擬物，通過雜交瘤技術(shù)免疫小鼠，化學(xué)誘變成功制備了分子量小能穿透細(xì)胞膜有治療價(jià)值的具GPX活力的單鏈抗體模擬物，為天然兔肝酶活力的8.5倍。用人源基因替換鼠非保守區(qū)，全基因片段在噬菌體展示，構(gòu)建了人源化GPX單鏈抗體酶，還制備了含硒多肽GPX模擬物，活力為68.7 U/mg，為天然酶的80%，最適pH和溫度與天然酶相近。通過鼠表皮細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)，具強(qiáng)抗氧化能力。用化學(xué)修飾將θ型谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 (GST) 轉(zhuǎn)化為含硒GPX酶，能有效還原H2O2，催化能力為國外臨床試驗(yàn)的PZ51 (含硒雜環(huán)化合物) 的5 000倍[5]。通過分子印跡技術(shù)，變性卵清蛋白作為印跡分子，除去印跡分子后，印跡分子結(jié)合部位中Ser被Sec取代，該蛋白分子有高的GPX活力，為PZ51的820倍[5]。還合成一系列環(huán)糊精衍生物的有機(jī)硒化合物作為GPX模擬物，對(duì)膜通透性好，無免疫原，體內(nèi)半衰期長[5]。GPX模擬物6-ImTeCD催化谷胱甘肽還原 H2O2活力為6.8 U/μmol，還原t-BuOOH級(jí)CuOOH活力是9.7和 15.2 U/μmol[10]。

核酶 (Ribozyme) 是小分子 RNA，也是一種多功能催化劑，可催化病毒RNA自我切割或斷裂反應(yīng)。我國亦進(jìn)行了[R-]錘頭核酶基因防治馬鈴薯紡錘病毒 (PSTVd) 和[R]錘頭核酶基因防治椰菜花葉病毒 (CaMy) 的工作[1]。

此外，還有利用基因工程菌絲氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn) L-絲氨酸[4]。重組畢赤酵母生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸藥物[5]。重組菌生產(chǎn) 1,3-丙二醇及2,3-丁二醇[8]。構(gòu)建 E. coli工程菌生產(chǎn)色氨酸[8]。芽短梗霉工程菌生產(chǎn)聚蘋果酸[10]。芽胞桿菌突變株Y89D生產(chǎn)環(huán)糊精[8]。重組E. coli合成抗禽流感藥物達(dá)菲前體草莽酸[10]?？莶菅堪麠U菌突變株生產(chǎn)苯丙氨酸。利用菌株基因敲除提高工程菌生產(chǎn)化工產(chǎn)品原料丁二酸產(chǎn)量[10]。大腸桿菌工程菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)α-苯丙酮酸[10]。

酶工程會(huì)議還有許多酶基因克隆與表達(dá)的論文，不能一一敘述，如：修復(fù) DNA損傷的O6-甲基鳥嘌呤 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，甜菜堿醛脫氫酶提高抗氧化酶活力，與噬菌體蛋白同源的新核酸酶。甜蛋白基因的表達(dá)，藍(lán)藻蛋白裂合酶，抗蟲膽固醇氧化酶，嘧啶核苷磷酸化酶[4]，乙醇氧化酶，合成 D-氨基酸的 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶[5]，辣根過氧化物酶[7]，煙酸脫氫酶[8]，乳糖酶[7]，甲烷單加氧酶，苯乙烯單加氧酶，右旋糖酐蔗糖酶[8]，脂肪醛去甲酰加氧酶，多聚乙酰合成酶，CO2關(guān)鍵酶與限速酶，耐熱羧酸酯酶，硫氧化還蛋白谷胱甘肽還原酶[10]，煙酸脫氫酶[7]，畢赤酵母SASA冠狀病毒的表達(dá)，癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的人基質(zhì)金屬蛋白酶，重組畢赤酵母表達(dá)人血清白蛋白，耐熱單加氧酶，合成 r-亞麻酸的Δ6-脫氫酶在酵母中表達(dá)，E. coli表達(dá)1,3-丙二醇氧化還原酶生產(chǎn)多聚纖維單體1,3-丙二醇[5]，殼聚糖酶，酰胺酶，甘油脫水酶，轉(zhuǎn)谷氨酰酶，丙烯腈水解酶，嗜熱菌角質(zhì)酶-CBD融合蛋白[11]，人細(xì)胞色素P450酶在E. coli中表達(dá)，耐堿性葡萄糖脫氫酶在E. coli中表達(dá)，丙氨酸消旋酶[8]，果膠內(nèi)切水解酶，手性藥物合成的NADPH酮基還原酶，酪氨酸激酶，糖基合成酶，天冬酰胺合成酶，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，丙酮酸脫氫酶，無機(jī)焦磷酸酯酶[6]，E. coli表達(dá)治療肝癌與黑色素瘤的精氨酸脫亞胺酶。制備手性醇的酮還原酶。熱穩(wěn)定制備芳基醇的醇脫氫酶[9]。異源表達(dá)β-1,3-氮乙酰胺基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶制備人乳寡糖，克隆了 5種糖核苷酸合成的關(guān)鍵酶合成相應(yīng)的糖核苷酸，E. coli表達(dá)細(xì)菌脂肪氧合酶用于綠色香料和植物激素合成。E. coli誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)治療癌癥及高半胱氨酸癥有價(jià)值的深海甲硫氨酸r-裂解酶。E. coli表達(dá)Bst DNA聚合酶[9]?？股毓羌芫弁铣傻牡弁€原酶。腫瘤標(biāo)記物環(huán)氧化酶-2的人源單鏈抗體。E. coli表達(dá)雙功能D-乳酸脫氫酶，重組表達(dá)系列瓊膠酶制備瓊膠寡糖。里氏木霉異源表達(dá)木質(zhì)素過氧化物酶[10]，構(gòu)建了 α-乙酰乳酸脫羧酶啤酒酵母工程菌用于啤酒生產(chǎn)[4]。聚酮合酶是最強(qiáng)大的化學(xué)合成酶[10]，正在進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能研究。

2 酶與微生物細(xì)胞的生物合成與催化

傳統(tǒng)的化學(xué)催化已不能滿足可持續(xù)發(fā)展的需要，高立體選擇性的微生物細(xì)胞或酶已成為手性生物合成的亮點(diǎn)。在這25年中，我國工業(yè)生物催化已成為具有相當(dāng)規(guī)模和技術(shù)水平的產(chǎn)業(yè)，在世界上占有舉足輕重的地位。

在第一至九屆全國酶工程會(huì)議的 978篇論文中，基因工程酶方面的有 356篇，生物催化合成論文有 186篇，占第二位。其中脂肪酶催化合成論文占55篇，占生物合成的第一位。

我國在有機(jī)相、離子液體、非水溶劑系統(tǒng)已成功利用脂肪酶進(jìn)行了手性 2-辛醇[3,5,7-8]拆分，(R,S) 仲辛醇拆分[3,5-6]，α-苯乙醇拆分[6]，酮洛芬乙烯水解拆分[10]，合成己酸乙酯[3-4,7,11]，合成辛酸乙酯[7]，油酸乙酯[7]，庚酸乙酯[10]，癸酸乙酯[7]，生物柴油[7-9,11]，脂肪酸甲酯[11]，二元酸酯[8]，單甘油酯[4]，油酸油醇酯[3]，香葉醇酯[3]，油酸酯[3]，乙酸乙烯酯[3]，脂肪酸糖脂[9]，(S)-α-氨基-3-苯氧基芐醇[5]，1,3-丙二醇羧酸酯[3]，棕櫚異辛酯[8]，癸酸甘油酯[5]，維生素A棕櫚酸酯[5]，抗壞血酸脂肪酸酯[5]，蔗糖酯[7]，聚羥基丙酸酯[7]，葡萄糖月桂酸單酯[8,11]，果糖月桂酸單酯[8]，及 (+)反式菊酸[4]，以及新聞紙脫墨[7,10]等。

細(xì)胞展示技術(shù)是將外源蛋白錨定在細(xì)胞壁上，酶分子的固定化可提高酶的穩(wěn)定性和對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性，畢赤酵母對(duì)外源脂肪酶表面展示系統(tǒng)可催化合成果糖脂、己酸乙酯，葡萄糖酯、生物柴油、月桂酸單糖酯、脂肪酸甲酯[8,11]等。

離子液體體系是新型綠色非水溶劑，酶法微藻藻油生產(chǎn)生物柴油達(dá) 90%轉(zhuǎn)化率。并合成了脂肪酸糖脂[9-10]。

利用酯酶催化合成酒香己酸乙酯[3]，單一性2-辛醇拆分合成抗癌藥物前體 (2S,3R)-3-苯基縮水甘油酸甲酯[10]，固定化合成脂肪族聚酯[10]，菌株不對(duì)稱合成L-薄荷醇[7]，拆分1,1,1-三氟-2-辛醇[10]，有機(jī)合成壬酸香草醇酯 (辣椒素脂)[8]。

用蛋白酶與化學(xué)法相結(jié)合，在低水有機(jī)相中合成了 4種含 Arg-Gly-Asp(RGD) 的細(xì)胞粘附肽 RGDS、RGD(NH2)2、RGE-NH2和RGDS-NH2，有抗腫瘤作用[7]。

目前，已知酶有4 428種 (至2011年)，工業(yè)上用酶大多數(shù)為水解酶，但氧化還原酶在酶中比例卻約占 32%，很多氧化還原酶未能被開發(fā)，因此拓展氧化還原酶是工業(yè)技術(shù)中一項(xiàng)重要內(nèi)容，但需解決輔酶循環(huán)再生的難題。為建立微生物細(xì)胞氧化還原酶催化體系，提高內(nèi)源輔酶利用率，我國已利用E. coli重組菌雙輔酶底物偶聯(lián)固定化面包酵母羰基還原酶合成 (S)-苯基乙二醇手性模塊物[8]。用雙羰基還原酶偶聯(lián)輔酶再生體系合成他汀類藥物手性側(cè)鏈——3R,5S二羥基-6-芐基己酸乙酯[8]。重組菌羰基還原酶合成醫(yī)藥合成用的手性醇 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，(R)-鄰氯扁桃酸甲酯和 (S)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯[9]。用烯酮/烯酯還原酶還原C=C雙鍵合成有商品價(jià)值的底物，對(duì)甲基馬來酰亞胺、R-香芹酮、衣康酸二甲酯、乙烯酰氧基丙烯酸甲酯、茶香酮、芐烯丙二腈都有較高的轉(zhuǎn)化率[10]。用輔酶再生體系酵母醇脫氫酶不對(duì)稱合成醫(yī)藥，農(nóng)藥光學(xué)手性醇中間體 (R)-扁桃體酸甲酯和 (R)，(S)2-辛醇[8]。菌株 D-氨基酸脫氫酶和胺氧化酶合成手性胺 (如 D-丙氨酸、D-苯丙氨酸、D-叔亮氨酸)。已建立了 D-氨基酸合成的酶催化平臺(tái)[10]。氧化葡萄糖酸桿菌高選擇性氧化合成工業(yè)上第二位的芳香醛——苯甲醛[8]。嗜熱酮還原酶輔酶再生系統(tǒng)不對(duì)稱合成醫(yī)藥中藥中間體S-1-苯基222三氟乙醇[9]。E. coli共表達(dá)全細(xì)胞甲酸脫氫酶催化茴香硫醚不對(duì)稱合成手性亞砜——甲基苯基亞砜[9]。金黃桿菌烯醇還原酶催化C=C雙鍵不對(duì)稱還原環(huán)狀烯酮產(chǎn)生光學(xué)純烷烴化合物用于手性中間體合成[10]。金黃桿菌短鏈脫氫酶不對(duì)稱合成匹瑞匹坦藥物中間體(R)-[3,5-二 (三氟甲基) 苯基]乙醇[10]。芽胞乳桿菌D-乳酸脫氫酶催化谷氨酸合成α-酮戊二酸[10]。高活性全細(xì)胞醇脫氫酶不添加輔酶合成米格列醇[6]，基因敲除提高酶表達(dá)量構(gòu)建甘油脫氫酶合成1,3-二羥基丙酮 (最簡單的多羥基酮糖)[8]。利用天然多脫氫酶體系甲烷氧化細(xì)菌生物催化二氧化碳制甲醇[5]。廈門大學(xué)挖掘了海洋微生物的8種氧化還原酶體系[9]。

國內(nèi)已形成生物催化與微生物轉(zhuǎn)化的科研開發(fā)群體，江南大學(xué)與浙江鑫富生化公司合作，用產(chǎn) D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的串珠鐮孢菌水解拆分得到光學(xué)純的D-泛解酸內(nèi)酯，成功地用于D-泛酸鈣和D-泛醇的生產(chǎn)，D-泛酸鈣產(chǎn)量全球第一[5,10]。此外，還固定化諾卡氏菌水解順式環(huán)氧琥珀酸生產(chǎn) L-酒石酸[7]。微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草酸與香草醛，又名香蘭素 (3-甲氧基-4-羥基苯甲醛) 高檔香料[5]。轉(zhuǎn)化巴豆甜菜堿制L-肉堿[4]，采用雙水相合成用于倍他司汀抗組胺藥物手性中間體-(S)-(4-氯苯基)-(吡喃-2-基) 甲醇[9]。定向進(jìn)化E. coli菌株精氨酸脫亞胺酶為治肝癌藥物[9]。

融合酶是利用融合蛋白將幾種功能蛋白集成于一體的嵌合體。構(gòu)建肝素酶的雙重融合蛋白體系，如麥芽糖結(jié)合蛋白融合或熒光蛋白融合，促進(jìn)了肝素酶的可溶性表達(dá)，用于生產(chǎn)低分子量抗栓藥物——肝素[6-7,9,12]。雙親短肽融合環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的N末端構(gòu)建6種融合酶合成克服Vc氧化的2-氧-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗壞血酸[10]。固定化自組裝短肽18A與腈水解酶融合表達(dá)生產(chǎn)扁桃腈[10]。用嗜熱子囊菌角質(zhì)酶-CBD融合蛋白精煉棉織物[8]。

大孔樹脂吸附法具有吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、時(shí)間短、物理化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),但其也有一定的局限性。樹脂經(jīng)過反復(fù)使用后,樹脂的表面及內(nèi)部會(huì)殘留許多非吸附性成分或者是雜質(zhì)使柱的顏色變深,柱效也會(huì)降低,而且經(jīng)多次使用有時(shí)柱床擠壓過緊還會(huì)導(dǎo)致樹脂顆粒破碎,使用壽命較短。此外由于即使是同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的同一型號(hào)樹脂,各批之間的比表面積和功能基團(tuán)的含量差別也較大,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性較差,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

我國在 20世紀(jì)90年代就已開發(fā)利用過氧化物酶在有機(jī)相或反相膠束中催化酚類和芳香胺的聚合反應(yīng)，如合成聚對(duì)羥聯(lián)苯，并研究了聚合物的光電性能。在非水介質(zhì)中催化去除苯酚達(dá)84.9%。在水乙醇中前列腺素合成酶催化合成前列腺素 E1[3]。青霉菌轉(zhuǎn)化順丙烯磷酸一步環(huán)氧化為磷霉素[4]。環(huán)氧化物水解酶合成藥物手性中間體手性鄰二醇[7]。浙江大學(xué)與海正藥業(yè)公司合作克隆表達(dá) R-酰胺酶和水合酶合成西司他汀手性中心 (S)2,2-二甲基環(huán)丙甲酰胺[8]。利用休止細(xì)胞甘油脫水酶生產(chǎn)聚酯、聚醚、聚氨酯合成的單體1,3丙二醇[5]。構(gòu)建E. coli基因工程菌轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)3-羥基丙醛[8]。利用羥腈酶合成可制備β-氨基醇的羥腈化合物[4]。利用嘧啶核苷磷酸化酶合成抗腫瘤藥物中間體-5-氟尿苷[4]。用反膠束單寧酶催化合成抗氧化劑沒食子酸戊酯[5]。成都生物所用固定化粘紅酵母苯丙氨酸解氨酶/肉桂酸途徑生產(chǎn)苯丙氨酸[7]。腈轉(zhuǎn)化酶是繼酯酶和脂肪酶之后，又一制備手性化合物的工具酶，包括腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶。產(chǎn)業(yè)化實(shí)例有腈水合酶/酰胺酶雙酶偶聯(lián)生產(chǎn)西司他汀鈉關(guān)鍵手性中間體-(S)-(+)2,2-二甲基丙烷甲酰胺[8]。腈水解酶制備除草劑-(L)-單銨膦及農(nóng)藥甘膦中間體——亞氨基二乙酸[10]。用固定化細(xì)胞腈水解酶制備醫(yī)藥中間體-(R)扁桃酸[8]。非水相α-胰凝乳蛋白酶催化合成具有強(qiáng)抗氧化的類肌肽4-(5)-丙氨酰胺5 (4)-羧酸咪唑[8]?；蚬こ叹D(zhuǎn)化制備脫氧核苷三磷酸[8]。定向突變菌株環(huán)氧化物水解酶制備降壓藥普萘洛爾中間體鄰位二醇[10]。甾體激素僅次于抗生素，用青霉菌轉(zhuǎn)化 6種甾體生成 1,2-二氫睪內(nèi)酯[10]。手性胺或非天然氨基酸是重要藥物合成的手性模塊，用 ω-轉(zhuǎn)氨酶獲得光學(xué)純的 (R)手性胺 (R)-α-苯乙胺，(R)-1-苯丙胺，(R)-4-苯基-2-丁胺，(R)-α-四氫萘胺[10]。E.coli表達(dá)細(xì)胞 L-氨基酸脫氨酶催化合成 α-苯丙酮酸[10]。固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化精氨酸為瓜氨酸，通過細(xì)胞谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化谷氨酸制備 α-酮戊二酸[10]。固定化含精氨酸脫亞氨酶的細(xì)胞拆分DL-精氨酸[9,12]。用內(nèi)切型肝素酶制備抗平滑肌細(xì)胞增生的肝素寡糖 (0–8 K)[8]。突變菌株環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶合成6個(gè)葡萄糖的α-環(huán)糊精[8]。用4種酶法合成新生兒益生糖——氮乙酰氨基葡萄糖-1,3-乳糖[9]。嗜熱β-葡萄糖苷酶在兩相中合成非離子表面活性劑——辛基葡萄糖苷[9]。瓊膠酶降解瓊膠生成2、4、6、8和10糖[10]。右旋糖酐酶水解葡聚糖生成麥芽糖，異麥芽三糖和葡萄糖[10]。

新發(fā)現(xiàn)的人參皂苷糖苷酶，從人參二醇類皂苷酶轉(zhuǎn)化法獲得稀有皂苷Rh2，其得率比紅參中提取提高了 500–700倍，在大連已產(chǎn)業(yè)化，年產(chǎn)Rh2皂苷300 kg，證明酶轉(zhuǎn)化法可以生產(chǎn)中草藥的有效成分[5,11]。β-糖苷酶水解人參二醇皂苷Rb1和Rb2的糖基生成抗癌人參皂苷Compound K。可提高免疫力，增加白血球等藥效[10]。

硅基磁性納米材料 Fe3O4SiO2 (Hb) 肌紅蛋白具有過氧化物酶活性[9]。重組菌不對(duì)稱催化合成手性環(huán)氧化物和手性鄰位二醇產(chǎn)物 R-對(duì)氯苯二醇和R-對(duì)氯苯乙二醇[10]。聚酮合酶是自然界最小，但功能最強(qiáng)大的合成工廠，催化合成抗生素次級(jí)產(chǎn)物，正在進(jìn)行結(jié)構(gòu)域研究[5,10]。

長鏈二元酸是10個(gè)以上碳原子的脂肪族二羧酸，是化工合成高性能尼龍、麝香香料、潤滑油、油漆、粘合劑、新型醫(yī)藥和農(nóng)藥的精細(xì)化工原料，長鏈二元酸的生物合成是中國獨(dú)有的原創(chuàng)性新菌種、新工藝專利技術(shù)，已經(jīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，只有中國能應(yīng)用這種技術(shù)生物合成生產(chǎn)一系列長鏈二元酸，并壟斷了西方所沒有的 7種長鏈二元酸，每年產(chǎn)值有十幾億人民幣，榮獲多項(xiàng)國家重大成果獎(jiǎng)[4]。

3 生物傳感器

生物傳感器應(yīng)用于各類重要生化物質(zhì)快速分析，我國已研制成功 101種以上不同種類、臺(tái)套的生物傳感器，包括電極型、化學(xué)光敏型、場(chǎng)效應(yīng)晶體管型、等離子體諧振型、光波導(dǎo)型、光纖型、壓電晶體型、微懸臂列陣型、雙分子質(zhì)脂仿生型、橢扁光型、絲網(wǎng)印刷型，大多數(shù)采用酶膜、組織、微生物、受體蛋白、抗原抗體、葉綠體、DNA探針作為探頭，測(cè)定物質(zhì)為乳酸、谷氨酸、血糖、尿素氨、尿酸、腎功能、青霉素、次黃嘌呤、谷氨酰胺、維生素C、轉(zhuǎn)氨酶、有機(jī)磷、BOD、丙酮酸、黃曲霉毒素、海洛因、酚、苯丙氨酸、膽固醇、細(xì)菌總數(shù)、乙醇、抗原抗體、嗅覺、硫化物、微生物、環(huán)境監(jiān)測(cè)、二氧化碳、鉀離子、膽堿、β-羥丁酸、農(nóng)藥、DNA等。十個(gè)研究所組成的中國科學(xué)院國家傳感聯(lián)合開放實(shí)驗(yàn)室及全國院校做出了許多成果，微型血糖儀已商品化，山東省科學(xué)院生物研究所制備了一系列 SBA-30乳酸分析儀、SBA-40谷氨酸葡萄糖雙功能分析儀、SBA單電極分析儀、SBA60四電極在線分析儀、SBA70血糖乳酸自動(dòng)分析儀及可檢測(cè)糖化酶、魚蝦鮮度、轉(zhuǎn)氨酶、尿素氨、維生素C的生物傳感器，已經(jīng)形成了商品化，實(shí)際應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室的實(shí)用檢驗(yàn)。最近，還研制了NADH生物傳感器[6]。

經(jīng)過多年的科研積累，我國酶工程研究已形成了許多有特色的科研隊(duì)伍和領(lǐng)路人，建立了許多技術(shù)平臺(tái)，中國科學(xué)院在北京、天津、上海建立了酶工程共性的技術(shù)平臺(tái)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院構(gòu)建了飼料酶技術(shù)開發(fā)平臺(tái)，北京化工大學(xué)建立了脂肪酶化學(xué)品合成技術(shù)平臺(tái)，華東理工大學(xué)建立了脂肪酶工業(yè)應(yīng)用平臺(tái)，福州師范大學(xué)構(gòu)建了微生物脂肪酶產(chǎn)業(yè)化技術(shù)平臺(tái)，中國藥科大學(xué)建立了氧化還原酶研發(fā)技術(shù)平臺(tái)，江南大學(xué)建立了氧化還原催化體系技術(shù)平臺(tái)，廈門大學(xué)建立了氧化還原酶檢測(cè)平臺(tái)，清華大學(xué)建立了生化工程技術(shù)平臺(tái)，華南理工大學(xué)構(gòu)建了酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)平臺(tái)。山東大學(xué)建立了微生物工業(yè)技術(shù)平臺(tái)，合肥學(xué)院建立了生物與環(huán)境技術(shù)平臺(tái)，吉林大學(xué)建立了分子酶學(xué)與進(jìn)化技術(shù)平臺(tái)。

我國酶工程研究開發(fā)團(tuán)隊(duì)做出了許多突出的成果與貢獻(xiàn)，獲得了多項(xiàng)國家獎(jiǎng)勵(lì)。榮獲國家科學(xué)技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)的有：姚斌研究員、孫志浩教授、鄭裕國教授、陳堅(jiān)教授、徐巖教授、楊立榮教授、譚天偉院士、陳國強(qiáng)教授。榮獲國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)的有：黃日波教授、金鳳燮教授、曲音波教授、陳遠(yuǎn)童研究員。此外，高培基教授榮獲教育部科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎(jiǎng)。在會(huì)議上，榮獲酶工程貢獻(xiàn)獎(jiǎng)的有：孫志浩教授、金鳳燮教授、黃日波教授、許建和教授、馮雁教授。曾先后參加過酶工程會(huì)議的院士有：鄒承魯院士、張樹政院士、范云六院士、歐陽平凱院士、楊勝利院士、沈寅初院士、趙國屏院士、王志珍院士、田波院士和譚天偉院士。酶工程已成為我國十分重視的現(xiàn)代生物技術(shù)。

4 我國酶制劑工業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀

據(jù)中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2014年，我國酶制劑商品產(chǎn)量21.9萬t，產(chǎn)值28億元人民幣 (不包括外資企業(yè))。

我國酶制劑工業(yè)起步于 20世紀(jì) 60年代，但真正得到發(fā)展是在 20世紀(jì) 80年代初改革開放后，特別是進(jìn)入新世紀(jì)初，企業(yè)由地方國營改制為股份制或民營企業(yè)。改制后企業(yè)推行 GMP管理，引進(jìn)人才，采用新工藝新設(shè)備，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，并與大專院校、科研院所合作或委托開發(fā)新產(chǎn)品。擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域，使酶制劑工業(yè)快速發(fā)展。

表2 我國酶制劑產(chǎn)量、產(chǎn)值 (不包括外資企業(yè))[13]Table 2 The production and the output value of enzyme preparation production in China (not including foreign capital enterprises)

近10年，在市場(chǎng)激烈競(jìng)爭(zhēng)中，行業(yè)中一些規(guī)模很小又無特點(diǎn)的企業(yè)逐漸邊緣化，有的被淘汰出局。同時(shí)，出現(xiàn)了一些規(guī)模較大具有發(fā)展?jié)摿Φ钠髽I(yè)，引人關(guān)注。如：山東隆大生物工程有限公司[14]，這家企業(yè)目前已擁有發(fā)酵總?cè)莘e3 000 m3，生產(chǎn)高溫α-淀粉酶 (普通、酸性)、中溫 α-淀粉酶、真菌淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶、復(fù)合糖化酶、纖維素酶 (酸性、中性)、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶 (酸性、中性、堿性)、風(fēng)味蛋白酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、果膠酶 (酸性、堿性) 近20種。應(yīng)用于多個(gè)行業(yè)，并有較大出口量，是行業(yè)中生產(chǎn)品種最多的企業(yè)。2014年產(chǎn)值5億元人民幣。該企業(yè)2014年還投入專項(xiàng)資金1 000多萬元用于完善治理生產(chǎn)中產(chǎn)生污染環(huán)境的三廢(廢水、廢渣、廢氣)。廣東溢多利生物科技有限公司[14]是行業(yè)中最早生產(chǎn)飼料酶的企業(yè)，除在珠海建有國內(nèi)最大的固體發(fā)酵生產(chǎn)基地，并在內(nèi)蒙托克托建有液體發(fā)酵生產(chǎn)線，生產(chǎn)多種產(chǎn)品。近年來產(chǎn)品應(yīng)用已由飼料延伸至食品、紡織、造紙等領(lǐng)域。2014年產(chǎn)值4億元人民幣。該企業(yè)已成功上市。這兩家企業(yè)，加上湖北新華揚(yáng)生物股份有限公司、湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司、湖南尤特爾生化有限公司、北京挑戰(zhàn)飼料科技集團(tuán)、山東康地恩生物科技有限公司、北京昕大洋科技發(fā)展有限公司、江蘇博立生物制品有限公司，共9家企業(yè)，2014年總產(chǎn)值24.5億元，占全國酶制劑企業(yè)當(dāng)年產(chǎn)值28億元的87.5%。企業(yè)發(fā)展規(guī)?；殉哨厔?shì)。

根據(jù)海關(guān)統(tǒng)計(jì)：2014年進(jìn)口酶產(chǎn)品14 578 462 kg，金額為2.327億美元，出口酶產(chǎn)品86 593 934 kg，金額3.369億美元[15]。

上述酶制劑產(chǎn)品進(jìn)出口包括國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)、在我國獨(dú)資生產(chǎn)的諾維信、杰能科、帝斯曼、天野等公司、合資企業(yè)蘇州宏達(dá)酶制劑有限公司以及在我國設(shè)辦事處做貿(mào)易的一些國外公司。我國酶制劑生產(chǎn)企業(yè)出口酶制劑金額約占我國酶制劑出口總金額的1/3。

酶制劑出口產(chǎn)品中，國內(nèi)企業(yè)出口的品種依次為：糖化酶、植酸酶、堿性蛋白酶、堿性脂肪酶、高溫α-淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶等。糖化酶數(shù)量最多，年出口約3.0萬t，其次為植酸酶，年出口約1.0萬t。

植酸酶：植酸酶研發(fā)項(xiàng)目 (包括禽類、魚類、豬等專用植酸酶)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所姚斌研究員負(fù)責(zé)的課題組承擔(dān)[13]，列入國家“863”計(jì)劃，于1998年取得重大突破，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，是用基因工程菌畢赤酵母生產(chǎn)。2005年研究又取得重大進(jìn)展，開發(fā)出新一代高比活植酸酶，處于國際領(lǐng)先地位。2010年，該產(chǎn)品生產(chǎn)銷售超過15 000 t，產(chǎn)值超過3億元人民幣，占據(jù)國內(nèi)植酸酶市場(chǎng) 90%以上。據(jù)我國飼料行業(yè)統(tǒng)計(jì)，由于飼料中添加了植酸酶，年節(jié)約飼料原料磷酸氫鈣20萬t以上，節(jié)約飼料成本約9億元，并使動(dòng)物糞便中排出的可污染環(huán)境的磷減少了約30萬t，創(chuàng)造了較大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。主要生產(chǎn)企業(yè)：北京挑戰(zhàn)飼料科技集團(tuán)、湖北新華揚(yáng)、廣東溢多利、四川禾本生物等。

纖維素酶：主要生產(chǎn)企業(yè)為湖南尤特爾生化有限公司、山東隆大生物工程有限公司、湖南利爾康生物科技有限公司等。酸性纖維素酶是用基因工程菌里氏木霉生產(chǎn)，由畢業(yè)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)的留美李新良博士研制，2001年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品的性價(jià)比居國內(nèi)領(lǐng)先地位。

高溫 α-淀粉酶 (普通、酸性)：主要生產(chǎn)企業(yè)為山東隆大生物工程有限公司、江蘇博立生物制品有限公司。

普魯蘭酶：該產(chǎn)品可水解液化淀粉中的α-1,6-D糖苷鍵產(chǎn)生 α-1,4-D直鏈多聚糖，用于與糖化酶配合生產(chǎn)高含量葡萄糖，與 β-淀粉酶配合生產(chǎn)麥芽糖含量高于 70%的麥芽糖漿主要生產(chǎn)企業(yè)：山東隆大生物工程有限公司。

α-乙酰乳酸脫羧酶：該產(chǎn)品可降解雙乙酰的前驅(qū)物 α-乙酰乳酸，減少雙乙酰的生成，確保啤酒中低水平雙乙酰含量，對(duì)提高啤酒質(zhì)量有重要作用。該產(chǎn)品研發(fā)項(xiàng)目由廣西大學(xué)生物技術(shù)有限試驗(yàn)中心研究[13]，課題負(fù)責(zé)人為留英歸國黃日波博士，項(xiàng)目列入國家“863”計(jì)劃，通過基因工程菌重組構(gòu)建，發(fā)酵工藝優(yōu)化，酶的提取分離純化等技術(shù)攻關(guān)，1999年取得突破，實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。主要生產(chǎn)企業(yè)：南寧邦爾克生物技術(shù)有限公司。邦爾克生產(chǎn)的該產(chǎn)品2014年占據(jù)國內(nèi)市場(chǎng)50%以上，并出口歐美和亞洲。

啤酒復(fù)合酶：主要生產(chǎn)企業(yè)為寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司[16]，該產(chǎn)品于2000年研究成功，投入生產(chǎn)。該產(chǎn)品含有β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶、細(xì)菌中性蛋白酶、淀粉酶等。糖化時(shí)添加，用量為麥芽干重的0.03%–0.05%?？山档望溨扯?，提高過濾速度，澄清麥汁，增加收率，提高氨基氮含量，有利酵母生長。

脂肪酶：主要生產(chǎn)企業(yè)為深圳市綠微康生物工程有限公司，生產(chǎn)菌種擴(kuò)展青霉，由福建師范大學(xué)生物工程學(xué)院吳松剛教授提供。北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，菌種假絲酵母，由北京化工大學(xué)譚天偉院士提供。此外還有百圣龍生物工程有限公司，四川禾本生物技術(shù)有限公司和山東隆大生物工程有限公司 (國外引進(jìn)，菌種黑曲酶)。

截至2014年，我國酶制劑行業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品已有 20多個(gè)原酶品種 (糖化酶、植酸酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、β-淀粉酶、真菌淀粉酶、普魯蘭酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、乳糖酶、凝乳酶、角質(zhì)酶等)。五大酶種占酶制劑總產(chǎn)量82%，其中糖化酶為30%、植酸酶為22%、淀粉酶為 14%、蛋白酶為 7%，纖維素酶為6%[17]。產(chǎn)品應(yīng)用于淀粉糖工業(yè)、紡織工業(yè)、飼料工業(yè)、酒精工業(yè)、啤酒工業(yè)、果汁果酒工業(yè)、面食制品加工、皮革工業(yè)、造紙工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。

行業(yè)存在的主要問題：酶的品種還比較單一，由不同原酶組成具有不同用途的復(fù)合酶制劑發(fā)展滯后，不能滿足市場(chǎng)的需要；一些產(chǎn)品的性價(jià)比不高，發(fā)酵酶活力較低，有些產(chǎn)品提取工藝和裝備水平落后，產(chǎn)品還是粗制品，缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力；酶制劑生產(chǎn)過程存在三廢對(duì)環(huán)境的污染問題，比如生產(chǎn)1 t液體糖化酶 (100 000 U/mL)可產(chǎn)生COD (化學(xué)需氧量) 高達(dá)5 000 mg/L以上的廢水10 t。酶制劑生產(chǎn)企業(yè)必須推行國家清潔生產(chǎn)政策，投入專業(yè)資金，做好自身的環(huán)境控制。重視這些問題的解決，將推動(dòng)我國酶制劑工業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

致謝：感謝中國食品科技學(xué)會(huì)酶制劑分會(huì)侯炳炎先生提供我國酶制劑工業(yè)發(fā)展?fàn)顩r數(shù)據(jù)。

[1] Enzyme 2. Engineering XIV 1997, Beijing.

[2] 全國首次酶工程學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編,1991, 威海.

[3] 吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 特刊, 第二次全國酶工程學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集, 1993, 長春.

[4] 第三次全國酶工程學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集,2000, 成都.

[5] 第四屆中國酶工程學(xué)術(shù)交流討論會(huì)論文集,2003, 無錫.

[6] 第五屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集, 2005,?？?

[7] 第六屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集, 2007,昆明.

[8] 第七屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集,2009, 合肥.

[9] 第八屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集, 2011,廣州.

[10] 第九屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集,2013, 南寧.

[11] 生物工程學(xué)報(bào), 酶工程?？? 2009.

[12] 生物工程學(xué)報(bào), 酶工程專刊, 2012.

[13] 孟廣震. 中國生物工程學(xué)會(huì)組織. 新中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展史略. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2013: 47–50.

[14] 侯炳炎. 結(jié)緣酶制劑工業(yè)四十年. 第四屆全國酶制劑研究開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研討會(huì)論文集. 無錫,2014, 10: 13–14.

[15] 中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)主辦. 發(fā)酵工業(yè), 2015,2: 42–44.

[16] 段鋼, 姜錫瑞, 周紅偉. 酶制劑應(yīng)用技術(shù)問答.北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2008: 163.

[17] 石維忱. 持續(xù)推進(jìn)我國酶制劑工業(yè)健康發(fā)展.無錫第四屆全國酶制劑研究開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研討會(huì)論文集, 2014, 10: 1–2.