雷風蘭，沈 碩*

(1.青海大學，青海 西寧 810016；2.青海省馬鈴薯育種重點實驗室，青海 西寧 810016；3.青藏高原生物技術教育部重點實驗室，青海 西寧 810016；4.西北馬鈴薯教育部工程研究中心，青海 西寧 810016)

雜草生長于田間時，會與農作物爭奪肥料和空間等，使農作物產量和質量下降，并容易引發(fā)農作物蟲害[1]，嚴重制約了現(xiàn)代農業(yè)的生產和發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計，我國農作物常年受雜草嚴重危害的面積達4500×104hm2，直接造成的經濟損失高達900多億元[2]?；瘜W除草劑以使用便捷、價格便宜、作用廣泛、經濟效益顯著等優(yōu)點被廣泛應用于各種地區(qū)有效除去雜草。然而隨著化學除草劑在田間長期大量的使用，造成了土壤污染和土質下降的后果[3]。同時雜草會產生抗藥性，抗藥性雜草快速生長和繁殖導致農田雜草危害更嚴重且更加難以治理[4]。微生物除草劑對目標雜草以外的植物影響小，環(huán)境負效應小，安全性高，往往具有廣譜、低毒、低殘留的特點，符合可持續(xù)農業(yè)的發(fā)展要求[5]。因此，利用分離篩選自然界中原有的微生物及其產生的含有生物活性的產物來研發(fā)新型生物防治除草劑已成為目前雜草治理研究中的熱門領域，其對目標雜草專一性高，選擇性強，而且具有改善土壤和環(huán)境的長期效益作用，對于促進現(xiàn)代農業(yè)生產的發(fā)展，具有極其重要的現(xiàn)實意義[6-8]。

酒糟菌糠含有大量營養(yǎng)物質包括蛋白質、氨基酸、微量元素、多糖、維生素和三萜等[9]，因此里面菌類豐富，具有極為特殊的生理結構和代謝機制，同時還產生了許多具有特殊性質的生物活性物質，對它的研究既具有理論意義，又有應用價值。

本研究以前期實驗室成員從青海省互助青稞酒廠采集的青稞酒糟樣品中分離到的酒糟菌菌株為對象，進行其抑制野燕麥種子萌發(fā)和幼苗生長的活性測定，對篩選到的活性酒糟菌株進行鑒定，研究結果為微生物源新型生物除草劑的開發(fā)提供新的菌株資源及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

20株酒糟菌菌株由課題組成員前期從青?；ブ囡茝S采集的青稞酒糟樣品中分離并保存至本實驗室；野燕麥(AvenafatuaL.)種子由青海省農林科學院提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

酒糟菌菌株培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.2。以不加瓊脂的培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 儀器

電子天平PL203(梅特勒—托利多儀器有限公司)，電熱恒溫干燥箱DHG-9240A(上海齊欣科學儀器有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵SHB-B型(鄭州長城科工貿有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS(上海申安醫(yī)療器械廠)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)，全溫搖瓶柜HYG-A(蘇州培英實驗設備有限公司)。

1.4 酒糟菌的活化

采用平板劃線法，用接種環(huán)上蘸取少量平板中培養(yǎng)的酒糟菌在平板上自上而下連續(xù)劃線，將接種后的培養(yǎng)基平板放置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h。

1.5 酒糟菌發(fā)酵液的制備

用接種環(huán)蘸取一定量的酒糟菌，接種至裝有牛肉膏蛋白胨液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶放置于全溫搖瓶柜中，在35℃下、以180r/min的轉速震蕩培養(yǎng)48h，收獲酒糟菌發(fā)酵液。

1.6 酒糟菌抑制雜草活性的測定

選取大小一致、顆粒飽滿的野燕麥種子，用4%的次氯酸鈉溶液浸泡，同時用磁力攪拌器攪拌10min，再用無菌水攪拌沖洗3次(每次3min)，吸水紙吸干，25℃的條件下催芽24h[10]。挑選露白一致的供試種子進行測定。在高壓滅菌后的玻璃培養(yǎng)皿(直徑9cm)中鋪雙層濾紙，分別加入過濾好的不同酒糟細菌菌株發(fā)酵液5.00ml，以清水、空白培養(yǎng)液為CK對照。每皿放置露白一致的供試種子10粒，按3-4-3排列，每個處理3次重復。將培養(yǎng)皿放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)3d，第4d開始培養(yǎng)箱內的光照周期為18L∶6D。培養(yǎng)期間加適量無菌水保持種子及幼苗生長所需要的水分。3d測定種子發(fā)芽率，種子發(fā)芽的標準為胚根突破種皮2mm，7d后同時測定根長、芽長、鮮質量、干質量并計算抑制率(%)[11]。試驗采用完全隨機試驗設計。

抑制率Gr(%)=(供試雜草種子總數(shù)-雜草發(fā)芽種子數(shù))/供試雜草種子總數(shù)×100

1.7 活性酒糟菌的分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

菌株DNA提取按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式細菌DNA提取試劑盒的程序操作。PCR擴增體系：10Buffer 2.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶(5U/L)0.2μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和引物P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′)(10 pmol/μl)各1μl，補水至25μl。反應條件為：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 80s，共30個循環(huán)；72℃ 10min。PCR反應條件：94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸75s，50μl反應體系30個循環(huán)。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將得到的16S rDNA序列在網站https://www.ezbio cloud.net/上進行序列對比，用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-Joining方法(Bootstrap值為1000次)繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹[12]。

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 24.0進行分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 酒糟菌菌株發(fā)酵液對野燕麥種子萌發(fā)的抑制作用

以20株酒糟菌發(fā)酵液對野燕麥種子進行發(fā)芽率抑制作用的實驗。由表1可知，菌株JZ1-1-9對野燕麥種子萌發(fā)的抑制活性最高，抑制率為100.00%，與對照差異顯著(圖1a-圖1c)。菌株JZ2-2-1、JZ3-1-6、JZ3-4-7、JZ3-2-5、JZ3-1-10對野燕麥種子萌發(fā)的抑制活性較高，抑制率分別為77.00%、73.00%、70.00%、70.00%、70.00%，與對照相比差異顯著(圖1a，1b，1d，1e，1f，1g，1h)。

表1 不同菌株對野燕麥發(fā)芽率的影響Table.1 The influence of difference strains on germination rate of A.fatua L.

注：a為空白對照；b為清水對照；c為菌株JZ1-1-9發(fā)酵液對野燕麥種子萌發(fā)的影響；d為菌株JZ2-2-1發(fā)酵液對野燕麥種子萌發(fā)的影響；e為菌株JZ3-1-6發(fā)酵液對野燕麥種子萌發(fā)的影響；f為菌株JZ3-4-7發(fā)酵液對野燕麥種子萌發(fā)的影響；g為菌株JZ3-2-5發(fā)酵液對野燕麥種子萌發(fā)的影響；h為菌株JZ3-1-10發(fā)酵液對野燕麥種子萌發(fā)的影響。圖1 不同菌株對野燕麥種子萌發(fā)的影響Fig.1 The influence of difference strains on the germination of A.fatua L.

2.2 酒糟菌菌株發(fā)酵液對野燕麥幼苗生長的影響

20株酒糟菌發(fā)酵液對野燕麥的芽長、根長、鮮質量、干質量均有不同程度的抑制作用(表2)。對芽長和根長抑制效果最強的為菌株JZ1-1-9，抑制率均為100.00%；對鮮質量抑制效果最強的為菌株JZ1-1-9和JZ2-4-15，抑制率均為76.50%(a，b，c，d，e)。

表2 20株酒糟菌發(fā)酵液對野燕麥種子幼苗生長的作用Table.2 Effect of 20 strains from distiller’s grain on growth of A.fatua L.

注：a為清水對照；b為空白對照；c為菌株JZ1-1-9發(fā)酵液對野燕麥幼苗生長的影響；d為菌株JZ2-2-1發(fā)酵液對野燕麥幼苗生長的影響；e為菌株JZ 2-4-15發(fā)酵液對野燕麥幼苗生長的影響圖2 不同菌株對野燕麥幼苗生長的影響Fig.2 The influence of different strains on growth of A.fatua L

2.3 活性菌株的分子生物學鑒定

通過對抑制雜草生長的活性酒糟菌進行篩選的結果表明：20株供試酒糟菌中，菌株JZ1-1-9、JZ2-2-1和JZ2-4-15對野燕麥種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制效果明顯。對上述3株活性酒糟菌菌株進行分子生物學鑒定。

將3株活性酒糟菌16S rDNA序列的測序結果在https://www.ezbiocloud.net /identify網站上進行比對，選擇相似性在99%以上的序列，用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、圖4、圖5)。結果表明，與菌株JZ1-1-9、JZ2-4-15和JZ2-2-1同源性達到99%的均為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。確定菌株JZ1-1-9和JZ2-4-15為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、菌株JZ2-2-1為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。

圖3 菌株JZ1-1-9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phyloginetic tree of strain JZ 1-1-9

圖4 菌株JZ2-2-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phyloginetic tree of strain JZ2-2-1

3 討論與結論

本研究通過20株酒糟菌發(fā)酵液對野燕麥的種子萌發(fā)和幼苗生長的影響試驗發(fā)現(xiàn)：菌株JZ1-1-9發(fā)酵液對野燕麥的種子萌發(fā)具有最顯著的抑制作用；同時，菌株JZ1-1-9發(fā)酵液對野燕麥芽長和根長也具有顯著的抑制作用；菌株JZ2-4-15和JZ1-1-9對野燕麥的鮮質量抑制效果最強。經鑒定，菌株JZ1-1-9和JZ 2-4-15為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，菌株JZ 2-2-1為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。這3株活性菌株可為生物源除草劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

21世紀以來，很多研究人員開始生物防治研究，對生防菌抑草的前景及存在的問題各國進行了研究，目前防止雜草主要依靠化學防治，但存在盲目用藥及3R[13]問題，降低化學藥劑的防治的防治效果。因此，對生態(tài)環(huán)境及人體無害的生防菌劑替代化學試劑，已經成為世界范圍內病、蟲、草防治的發(fā)展方向。常見的生防菌株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus siamensis)又稱暹羅芽胞桿菌，目前已有相關研究表明其對由鐮刀菌屬所引起赤霉病和腐爛病具有顯著的抑制效果，且通過產生蛋白類生物表面活性劑達到抑制目的[14-18]。但有關西姆芽孢桿菌對雜草進行防治的研究在國內還未見報道。目前短小芽孢桿菌的生防研究主要集中于草莓尖胞鐮刀菌、馬鈴薯炭疽病菌和水稻立枯絲核菌等植物病原真菌的拮抗研究以及代謝產物和微生態(tài)制劑的制備[19-22]。但關于抑草活性物質的探索以及機制機理需要進一步的研究。下一步我們擬針對3株活性菌株進行次級代謝產物的分離及作用機理的深入研究，以加快推進新型生物除草劑的應用進程。