王凱月，李強(qiáng)峰，李玲霞

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

山生柳(SalixoritrephaSchneid.)屬楊柳科柳屬直立矮小灌木[1],高10～120 cm，是我國(guó)特有物種[2]。以山生柳為建群種或優(yōu)勢(shì)種構(gòu)成的灌木林，是青海等高寒地區(qū)灌叢的主要類型之一[3]。山生柳灌叢主要分布于我國(guó)四川、青海東南部、甘肅東南部、西藏東部[4]。山生柳具有生長(zhǎng)迅速、無病蟲害等優(yōu)點(diǎn)，在涵養(yǎng)水源、保持水土、防沙治沙等方面起著重要作用[5]。青海位于中國(guó)西部，全省屬高原大陸性氣候[6]，平均海拔3 500 m以上，年均氣溫-3.7～6.0 ℃[7]，在青海地區(qū)，低溫成為限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素之一。國(guó)內(nèi)外對(duì)山生柳的研究較少，主要集中在山生柳的群落分布特征[8-10]、遺傳多樣性[11]、藥理分析及成分分析[12-15]、扦插繁育[16]等方面的研究。Gao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，山生柳能夠廣泛生存在高海拔干旱地區(qū)。Kang等[18]通過嫁接等無性系選育方法，對(duì)山生柳進(jìn)行繁育，并將這種技術(shù)應(yīng)用于退化草原的恢復(fù)。以上研究表明，山生柳在高寒植被群落中具有較高的生態(tài)系統(tǒng)功能地位、遺傳多樣性及藥用價(jià)值，并在適宜的條件下可進(jìn)行扦插繁殖。但是針對(duì)山生柳優(yōu)良無性系抗寒性的相關(guān)研究相對(duì)較少。為了篩選出耐寒性更強(qiáng)的山生柳無性系，更好地發(fā)揮山生柳的生態(tài)效益，本文對(duì)青海不同地區(qū)初選出的11個(gè)山生柳無性系進(jìn)行抗寒性差異研究，通過對(duì)山生柳無性系抗寒性比較分析得出抗寒性較強(qiáng)的山生柳無性系，為青海高海拔地區(qū)城鎮(zhèn)植樹提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從2018年開始在野外進(jìn)行優(yōu)樹選擇確定50個(gè)山生柳無性系，通過生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定，以生長(zhǎng)迅速為選育的主要目標(biāo)，最終確定了11個(gè)優(yōu)良無性系，分別標(biāo)記為山生柳T10、T15、G25、T11、Q43、T3、G23、T20、T17、G21、G24，所選試驗(yàn)材料的采集分布情況見表1。其中同一林分的不同山生柳無性系是依據(jù)優(yōu)勢(shì)木對(duì)比法，通過測(cè)定株高、冠幅、地徑、葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積、一年生新枝生長(zhǎng)量、分枝角度等指標(biāo)，分析各個(gè)選優(yōu)指標(biāo)變異系數(shù)來確定的。

表1 11個(gè)山生柳優(yōu)良無性系林分分布表Tab.1 Distribution of 11 superior Salix oritrepha Schneid.clones

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取11個(gè)山生柳無性系一年生扦插苗截取插穗，于2020年4月上旬扦插于直徑為30 cm、高為30 cm的塑料花盆內(nèi)，每盆1株，盆中裝入8 kg耕作土(田間持水量為30%)。盆栽苗木放置于青海大通植物園溫室大棚中，保證11個(gè)山生柳無性系苗木正常生長(zhǎng)。2020年8月5日進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)，每個(gè)山生柳無性系隨機(jī)選取3株，通過人工氣候箱模擬連續(xù)降溫過程。設(shè)置20(CK)、15、10、4 ℃四個(gè)溫度梯度，每個(gè)溫度恒溫處理3天后依次降到下一溫度梯度，分別測(cè)定不同溫度處理下植株葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性、可溶性蛋白(SP)含量、丙二醛(MDA)含量生理指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次。采用隸屬函數(shù)法對(duì)11個(gè)山生柳無性系抗寒適應(yīng)性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[19]；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[20]；MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸顯色法[21]。

1.4 數(shù)學(xué)模型及數(shù)據(jù)分析方法

11個(gè)山生柳無性系的葉片生理指標(biāo)數(shù)據(jù)采用模糊隸屬函數(shù)法[22]進(jìn)行綜合評(píng)判，用隸屬度公式對(duì)試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換，再將各指標(biāo)隸屬函數(shù)值取平均進(jìn)行無性系間相互比較。

隸屬函數(shù)公式為：

Xij=(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)

(1)

Xij=(xjmax-xij)/(xjmax-xjmin)

(2)

式中：Xij為i樹種j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，xij為i樹種的j性狀值，xjmin為各樹種j性狀的最小值，xjmax為各樹種j性狀的最大值。當(dāng)j性狀與植物的耐寒性成正相關(guān)時(shí)用(1)式，成負(fù)相關(guān)時(shí)用(2)式。

通過Excel 2010對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，運(yùn)用SPSS23.0軟件分析各指標(biāo)和耐寒性之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 11個(gè)山生柳無性系葉片SOD活性變化

從圖1可以看出，隨著脅迫溫度的降低，11個(gè)山生柳無性系的SOD活性除T10、T20、T3外均表現(xiàn)為先上升后降低再上升的變化趨勢(shì)。由于試驗(yàn)材料抗寒能力的不同，其SOD活性的變化幅度存在差異。除Q43、G24、T3外，其他山生柳無性系的SOD活性都在4 ℃出現(xiàn)最大值，與20 ℃(CK)相比，增加幅度最大的是山生柳T11，增幅為19.37%。山生柳G25和T3的SOD活性在整個(gè)低溫脅迫過程中均處于較高水平，說明其抗寒性較強(qiáng)。

圖1 低溫處理下11個(gè)山生柳無性系SOD活性變化折線圖Fig.1 Line diagram of SOD activity changes in 11 clones of Salix oritrepha Schneid treated at low temperature

對(duì)11個(gè)山生柳無性系在不同溫度處理下SOD活性的均值作顯著性分析(表2)。低溫處理下不同無性系間SOD活性無顯著差異。根據(jù)SOD活性平均值得出11個(gè)山生柳無性系抗寒性強(qiáng)弱：G25>T3>T10>T11>G24>G23>T20>T15>G21>T17>Q43。

表2 低溫處理下11個(gè)山生柳無性系SOD活性顯著性分析表Tab.2 Significance analysis of SOD activity of different clones at low temperature

2.2 11個(gè)山生柳無性系葉片可溶性蛋白含量變化

如圖2所示，在整個(gè)低溫脅迫過程中山生柳Q43、G21、G24的可溶性蛋白含量表現(xiàn)為先降低后升高再降低的變化趨勢(shì);其他山生柳無性系的可溶性蛋白含量則表現(xiàn)為在20(CK)～10 ℃升高，在10～4 ℃降低的趨勢(shì)。Q43、G21、G24可溶性蛋白含量在低溫處理初期降低的原因可能是開始的低溫沒有激起植物體內(nèi)的抗寒性生理調(diào)節(jié)機(jī)制，但又降低了植物體內(nèi)酶的活性，從而阻礙了蛋白質(zhì)的合成。山生柳無性系的可溶性蛋白含量在20(CK)～ 15 ℃處理中升高或降低的幅度都比較緩慢，而在15～10 ℃的低溫脅迫過程中，所有試驗(yàn)材料的可溶性蛋白含量都出現(xiàn)不同程度的升高，其中T10、T17、Q43增幅最為明顯，其他山生柳無性系的可溶性蛋白含量的增幅相對(duì)較低。可見，在低溫脅迫過程中可溶性蛋白含量的增加對(duì)植物抗寒性起到了關(guān)鍵作用。

圖2 低溫處理下11個(gè)山生柳無性系可溶性蛋白含量變化折線圖Fig.2 Line chart of soluble protein content variations of 11 Salix oritrepha Schneid.clones under low temperature

對(duì)低溫處理下11個(gè)無性系葉片可溶性蛋白含量的均值進(jìn)行顯著性分析(表3)。山生柳T17與T3、T15、G25的可溶性蛋白含量達(dá)到了差異顯著水平(P<0.05)。根據(jù)可溶性蛋白含量平均值分析得出11個(gè)山生柳無性系抗寒性強(qiáng)弱：T17>T10>Q43>T20>G23>T11>G21>G24>T3>T15>G25。

表3 低溫處理下11個(gè)山生柳無性系可溶性蛋白含量顯著性分析表Tab.3 Significance analysis of soluble protein content of different clones under low temperature

2.3 11個(gè)山生柳無性系葉片MDA含量變化

如圖3所示，隨著處理溫度的逐漸降低，11個(gè)無性系的MDA含量除T10、Q43、G21和G25外，整體變化趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)。其中T15、T20、Q43在10 ℃低溫下MDA含量達(dá)到最小值，T11、T17、T3、G23、G24在15 ℃時(shí)MDA含量最低。山生柳T10、Q43和G21的MDA含量在20(CK)～15 ℃的溫度處理過程中逐漸升高，在15～10 ℃的溫度處理過程中逐漸下降，在10～4 ℃下T10和G21的MDA含量變化趨于平緩。山生柳G25在整個(gè)降溫處理過程中表現(xiàn)為一直降低的趨勢(shì)，說明植物體內(nèi)的抗氧化酶一直處于較高水平，阻止了MDA含量的升高，證明該無性系抗寒能力較強(qiáng)。另外，通過圖3可以看出，T15在整個(gè)低溫脅迫處理過程中MDA含量一直處于較低水平，說明其抗寒能力很強(qiáng)。

圖3 低溫處理下11個(gè)山生柳無性系丙二醛含量變化折線圖Fig.3 Line chart of malondialdehyde content variations in 11 Salix oritrepha Schneid.clones under low temperature

由表4得出，山生柳G24、T17與T15葉片中的MDA含量達(dá)到了差異極顯著水平(P<0.01)。山生柳G23、T3、T20、T10、T11、G25、Q43之間MDA含量差異不顯著。由于植物體內(nèi)的MDA含量與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，MDA含量越高，表明其抗寒性越差；MDA含量越低則抗寒性越強(qiáng)。根據(jù)供試材料的MDA含量分析比較可以得出11個(gè)山生柳無性系抗寒性強(qiáng)弱：T15>Q43>G25>T11>T10> T20>T3>G23>G21>T17>G2。

表4 低溫處理下11個(gè)山生柳無性系MDA顯著性分析表Tab.4 Significance analysis of MDA of different clones under low temperature

2.4 11個(gè)山生柳無性系抗寒性綜合評(píng)價(jià)

植物在低溫脅迫過程中，是多個(gè)因子共同作用下引發(fā)的一系列結(jié)構(gòu)及生理變化，所以單一指標(biāo)具有一定的局限性和片面性[23]。因此，采用隸屬函數(shù)法得出各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及各材料的平均隸屬度，各無性系耐寒性指標(biāo)的隸屬平均值越大則表明該種無性系抗寒性越強(qiáng)。由表5可知11個(gè)山生柳無性系抗寒性排序:T10>T15>G25>T11>Q43>T3>G23>T20>T17>G21>G24。

表5 溫度處理下11個(gè)山生柳無性系抗寒性綜合評(píng)價(jià)Tab.5 Comprehensive evaluation of cold resistance of 11 Salix oritrepha Schneid.clones treated with temperature

2.5 相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS23.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)SOD活性、可溶性蛋白(SP)含量、MDA含量進(jìn)行相關(guān)性分析，見表6。

表6 11個(gè)山生柳無性系抗寒性指標(biāo)相關(guān)系數(shù)Tab.6 Correlation coefficient of cold resistance index of 11 Salix oritrepha Schneid.clones

由表6可知，MDA含量與其他兩個(gè)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，11個(gè)山生柳無性系抗寒適應(yīng)力的3個(gè)指標(biāo)間未達(dá)到顯著水平，說明各個(gè)指標(biāo)之間相對(duì)獨(dú)立。

3 討論與結(jié)論

植物在低溫脅迫下會(huì)發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，例如代謝異常、生理脫水、光合作用減弱、細(xì)胞硬化等[24]。SOD是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一，SOD的活性可以間接證明植物抗寒性的強(qiáng)弱，SOD活性的上升證明了低溫脅迫下其清除自由基的能力增強(qiáng)[25]。本研究中，在低溫脅迫初期，所有山生柳無性系除T10、T20外均表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，其中G25和T3葉片SOD的活性較高，證明其耐寒性較強(qiáng)。在植物遭受低溫脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量的變化存在兩種觀點(diǎn)：一種觀點(diǎn)認(rèn)為低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞中可溶性蛋白含量增加；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為植物細(xì)胞中可溶性蛋白含量的增加與植物抗寒性的增強(qiáng)沒有因果關(guān)系[26]。在本試驗(yàn)低溫處理過程中，11個(gè)無性系葉片可溶性蛋白含量的變化分為兩種：一種是先升高后降低，另一種表現(xiàn)為先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)。其中T10可溶性蛋白含量與20 ℃對(duì)照相比，增幅較明顯且耐寒性較強(qiáng)，這與上述第一種觀點(diǎn)相符合；此外，11個(gè)山生柳無性系在低溫脅迫處理后葉片的MDA含量變化規(guī)律為除T10、Q43、G21和G25外，其他整體變化趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)。該研究結(jié)果與王斌[27]對(duì)其他植物的研究結(jié)果基本一致。在低溫脅迫下三個(gè)生理指標(biāo)所得出的山生柳無性系耐寒性具有一定的差異，說明植物的耐寒性是一種復(fù)合性狀，單用一個(gè)抗寒指標(biāo)很難說明其耐寒性。通過隸屬函數(shù)法以及生理指標(biāo)的相關(guān)性分析得出，11個(gè)山生柳優(yōu)良無性系的綜合抗寒性從高到低依次為山生柳T10、T15、G25、T11、Q43、T3、G23、T20、T17、G21、G24。

植物往往因原產(chǎn)地的不同從而產(chǎn)生內(nèi)在種質(zhì)的差異，進(jìn)而形成植物種質(zhì)資源抗寒性的不同[28]。林木的地理變異是因?yàn)殚L(zhǎng)期在不同的環(huán)境條件下，基因交流受到限制，所以在適應(yīng)生態(tài)環(huán)境過程中林木種內(nèi)性狀發(fā)生遺傳分化[29]。本研究11個(gè)山生柳無性系中來自高海拔地區(qū)的G25、T11、Q43耐寒性比低海拔地區(qū)的T3、T20、T17較強(qiáng)，這基本符合Neilsen等[30]發(fā)現(xiàn)高海拔種源比低海拔種源及沿海種源更耐寒這一規(guī)律，且同一區(qū)域的無性系耐寒性指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值相差不大。通過無性系葉片生理指標(biāo)隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)分析得出，大通寶庫南山的T10、大通陽山毛亥托口的T15以及班瑪縣賽格段G25的耐寒性較強(qiáng)，可作為青海省高海拔地區(qū)城鎮(zhèn)綠化的優(yōu)選種質(zhì)材料。

本研究只是對(duì)一年生山生柳苗木進(jìn)行了低溫脅迫下部分生理生化指標(biāo)的測(cè)定，并不能完全反映11個(gè)山生柳無性系的抗寒性。但本研究所有試驗(yàn)材料均在相同處理、同一條件下測(cè)定，結(jié)果具有可對(duì)比性，可以體現(xiàn)出11個(gè)山生柳無性系抗寒性的相對(duì)強(qiáng)弱。