曾令霜，張晨晨，張 敬，徐 彬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,江蘇 南京 210095）

多年生黑麥草(Lolium perenne)原產(chǎn)于歐洲、北非和亞洲西南部，是全球溫帶地區(qū)種植最為廣泛的多年生冷季型禾草[1-2]，可作為草坪草與飼草兼用的草種，具有成坪速度快、抗病能力強、飼草營養(yǎng)品質(zhì)高等特點[3]。多年生黑麥草是我國氣候過渡帶及以南地區(qū)秋冬季草坪交播用草種[4]，也是我國暖溫帶及南方草山草坡的主栽牧草[5]。目前，多年生黑麥草商業(yè)品種均為國外引進，隨著我國草地改良和綜合開發(fā)以及草坪業(yè)發(fā)展，開展多年生黑麥草的種質(zhì)創(chuàng)新以及新品種選育勢在必行。

多年生黑麥草自交不親和，種質(zhì)資源多為二倍體(2n=2x=14，基因組約2 034 Mb)，少數(shù)為四倍體[6-7]。群體選育是多年生黑麥草育種的常規(guī)手段，對種質(zhì)資源的遺傳背景分析是育種親本材料選擇及新品種鑒定的前提條件。多年生黑麥草種質(zhì)間僅依靠表型區(qū)分難度大，且表型差異往往與遺傳距離差異的匹配度低[8]。分子標(biāo)記輔助育種是區(qū)分種質(zhì)資源并判斷各種質(zhì)間遺傳距離的有效手段[9]。簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)可靠性和多態(tài)性高，具有共顯性遺傳及多等位基因特性，已成為植物分子標(biāo)記輔助育種的常規(guī)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析、品種鑒定、物種進化、遺傳連鎖圖譜及QTL 基因定位等方面的研究中[8,10-11]。在多年生黑麥草中，SSR 遺傳圖譜已被用于抗逆性遺傳位點鑒定工作[12-14]。例如，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪團隊利用SSR 標(biāo)記鑒定出與多年生黑麥草耐熱性相關(guān)生理指標(biāo)相關(guān)顯著的29 個遺傳位點[15]。

自2013年始，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪團隊引進了320 個多年生黑麥草種質(zhì)資源，并通過小群體育種培育出10 余個多年生黑麥草品系。為明晰各種質(zhì)資源和選育品系間的遺傳關(guān)系，本研究利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對具有代表性的85 份二倍體多年生黑麥草種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，以了解各種質(zhì)間的親緣關(guān)系及群體結(jié)構(gòu)，為合理利用及評價多年生黑麥草種質(zhì)資源和品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料共計85 份多年生黑麥草，其中75 份來自23 個國家收集的多年生黑麥草種質(zhì)，其余10 份為自主選育(中國)，85 份材料中15 份來自于非洲，25 份來自于亞洲，21 份材料來自于歐洲，23 份來自于北美洲，1 份來自于大洋洲(表1)。

表1 供試多年生黑麥草種質(zhì)材料來源Table 1 Source of used perennial ryegrass germplasm

1.2 DNA 的提取與檢測

當(dāng)幼苗長至3～4 葉期時，各種質(zhì)隨機取約20株幼嫩葉片混樣[16]，利用植物基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN，Cat.DP320-02)提取黑麥草基因組DNA，具體步驟如下：取黑麥草新鮮葉片約1 g 剪碎后在液氮中充分研磨；加400 μL 緩沖液LP1 和6 μL RNase A (10 mg·mL-1)，旋渦振蕩1 min，室溫放置10 min；加130 μL 緩沖液LP2，充分混勻，旋渦振蕩1 min，12 000 r·min-1離心5 min，將上清移至新的離心管中；加1.5 倍體積的緩沖液LP3，混勻后將溶液全部加入吸附柱CB3 中，12 000 r·min-1離心30 s，棄廢液；加漂洗液PW 600 μL，12 000 r·min-1離心30 s，棄廢液，重復(fù)一次漂洗步驟；室溫放置2 min 以徹底晾干柱內(nèi)漂洗液；將吸附柱CB3 轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 離心管中，加60 μL TE 緩沖液，室溫放置2 min，12 000 r·min-1離心2 min，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR 引物及分子標(biāo)記

參考文獻[15]，選用多態(tài)性信息含量(PIC)≥0.4的26 對引物(表2)。使用Applied Biosystems Veriti ?PCR 熱循環(huán)儀以85 份多年生黑麥草種質(zhì)材料基因組DNA 為模板進行擴增反應(yīng)。PCR 擴增程序為94 ℃預(yù)變性1 min；55～58 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5 次。94 ℃變性1 min，57～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；最終再進行72 ℃延伸10 min，降溫至4 ℃，終止反應(yīng)。具體PCR體系為：2×PCR Mix (北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Cat.No：PR1002) 10 μL，ddH2O 8 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，50 ng·μL-1的DNA 模板1 μL。以9%聚丙烯酰胺凝膠進對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。

表2 SSR 引物序列Table 2 Sequences of SSR primers

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)電泳圖上清晰且重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”(出現(xiàn))或“0” (缺失)，建立原始矩陣。統(tǒng)計不同引物擴增所產(chǎn)生的基因型數(shù)據(jù)，根據(jù)不同軟件格式要求進行轉(zhuǎn)換。運用PopGen 3.2 軟件計算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon 信息指數(shù)(I)、觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)。用Powermaker 2.3計算各引物的PIC，運用NTSYS-pc 軟件根據(jù)試驗統(tǒng)計的“1”、“0”原始矩陣計算供試材料的遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA 法進行聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖，利用Gen Alex 6.41 進行居群間的分子方差分析(AMOVA)，計算居群內(nèi)和居群間的遺傳變異分布，運用Structure 2.3 軟件進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)Evanno 等[17]的ΔK法確定最佳分組K值。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

85 份多年生黑麥草種質(zhì)材料在26 對SSR 引物下共檢測到131 個條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為91 條，多態(tài)性比率為69.5%，可用于85 份多年生黑麥草種質(zhì)之間的遺傳多樣性分析。26 對SSR 標(biāo)記下檢測到Ho 的變化范圍為0.161～0.769，平均值為0.501。He的變化范圍在0.188～0.894，平均值為0.541；Shannon信息指數(shù)的分布范圍在0.243～1.050，平均值為0.650，表明85 份種質(zhì)資源材料的遺傳分化程度及多態(tài)性較高。各引物揭示供試種質(zhì)材料的PIC 范圍為0.156 (rv0757)～0.722 (LP20a)，平均值為0.455。本試驗中，高度多態(tài)性引物為11 對(PIC＞0.5)，中度多態(tài)性引物為14 對(0.25＜PIC＜0.5)，低多態(tài)性引物1 對(PIC＜0.25)?；蛄?Nm)的范圍在0.347 (引物PR24)～3.818 (引物L(fēng)pHCA17C6)，平均為1.940(表3)，表明供試材料間基因流較大，基因的交流將很大程度上阻止遺傳漂變引起的群體間遺傳分化[18]。

表3 SSR 引物擴增多態(tài)性信息Table 3 Polymorphic information of SSR primers

2.2 多年生黑麥草的遺傳變異

通過GenAlex 6.41 軟件分析得出(表4)，5 個群體的有效等位變異范圍較大，其中亞洲類群的有效等位基因數(shù)最高，為2.082，Shannon 信息指數(shù)(I)為 0.785，期望雜合度(He)為0.482。歐洲類群的有效等位基因數(shù)第二高，為2.015，Shannon 信息指數(shù)(I)為0.764，期望雜合度(He)為0.467。而大洋洲類群的有效等位基因數(shù)最低，為1.346，Shannon 信息指數(shù)(I)為 0.240，期望雜合度(He)為0.173。AMOVA分子方差分析表明(表5)，供試多年生黑麥草種質(zhì)資源的變異具極顯著差異(P＜0.01)，其中94%和6%的變異分別發(fā)生在群組內(nèi)部和群組間，這表明供試種質(zhì)資源的遺傳變異主要集中在群組內(nèi)部的各材料間。

表4 群組多態(tài)性信息Table 4 Polymorphic information of different groups

表5 群組遺傳變異的分子方差分析Table 5 Analysis of molecular variance of different groups

2.3 聚類分析

在SSR 數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，計算85 份種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)，并用UPGMA 法聚類分析各種質(zhì)間的遺傳距離(圖1)。85 份種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)在0.70～0.90，變幅為0.20。其中自選品種R2-4 與R2-8 之間的相似系數(shù)最高，均達到了0.90，可認(rèn)為它們親緣關(guān)系最近。當(dāng)遺傳系數(shù)為0.738 時可將材料分5 個大類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，Ⅰ類包括PI 221570、PI 601738 和PI 231577 等共68 份種質(zhì)資源，主要來自 非洲(15 份)、亞 洲(12 份)、歐洲(18 份)及 北美洲(23 份)。Ⅱ類包括9 份自選品種及PI 601738等共10 份來自亞洲(9 份)及大洋洲(1 份)的種質(zhì)資源。Ⅲ類PI 220178、PI 502413 等4 份種質(zhì)資源，來自亞洲(3 份)和歐洲(1 份)，Ⅳ類包括來自亞洲的PI 222572 及來自歐洲的PI 675317 兩份種質(zhì)資源，Ⅴ只包括來自歐洲的一份種質(zhì)資源(PI 598432)。

圖1 基于SSR 標(biāo)記的UPGMA 遺傳聚類Figure 1 Clustering result based on SSR markers

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

運用Structure 2.3 軟件及根據(jù)Evanno 等[17]的方法對供試材料進行群體結(jié)構(gòu)分析，通過ΔK來確定最佳分組(圖2)。結(jié)果顯示，當(dāng)K=3 時，ΔK具有明顯最高峰值，故將K=3 視為最佳分組。結(jié)合群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖3)與供試材料地理來源來看，群組1 包含28 份材料，其中來源于亞洲的有11 份材料，來源于歐洲的有7 份材料，剩下的分別來源于非洲(6 份)及北美洲(4 份)；群組2 包含20 份種質(zhì)材料，其中有10 份材料都為自選品種，剩下的包括來源于非洲(6 份)、北美洲(3 份)及大洋洲(1 份)；群組3 包含37 份材料，其中來源于北美洲的有16 份種質(zhì)材料，來源于歐洲14 份材料，剩下的包括非洲(3 份)及亞洲(4 份)。

圖2 基于ΔK 確定最佳居群數(shù)Figure 2 Rational K value of group number was estimated by ΔK

圖3 85 份材料群體遺傳結(jié)構(gòu)分析(K=3)Figure 3 Population structure analysis of 85 germplasm materials (K=3)

3 討論與結(jié)論

多年生黑麥草在地理分布和物種多樣性等方面存在較大差異[8]。分子標(biāo)記技術(shù)可為多年生黑麥草的種質(zhì)資源提供充分的遺傳背景，對其品種改良開發(fā)與利用具有重要的現(xiàn)實意義?，F(xiàn)今，SNP[19]、SSR[8,15,20-21]、RAPD[22]和SRAP[23]等都已應(yīng)用于多年生黑麥草中。本研究選擇利用SSR 分子標(biāo)記是因為SSR 標(biāo)記具有穩(wěn)定性強、多態(tài)性高和共顯性等特點，更有利于遺傳定位品種鑒定及知識產(chǎn)權(quán)保護。本研究從50 對引物中篩選出了26 對多態(tài)性的引物，各引物揭示了種質(zhì)間多態(tài)性信息含量范圍為0.156～0.722，群體的期望雜合度的平均值為0.541，Shannon 信息指數(shù)平均值為0.650，表明供試材料的遺傳分化程度及多態(tài)性較高。本研究共擴增出131條清晰明亮的條帶，其中多態(tài)性條帶為91 條，所占比例為69.5%，低于利用RAPD 分子標(biāo)記的89.95%[22]和SRAP 分子標(biāo)記的78.95%[23]，這可能由于分子標(biāo)記類型的不同對于不同群體大小的試驗材料其擴增效率不同所造成的結(jié)果。

本研究中AMOVA 分子方差分析結(jié)果顯示，供試種質(zhì)中94%的遺傳變異存在于群組內(nèi)部，表明供試多年生黑麥草種質(zhì)資源的遺傳變異主要分布在組群內(nèi)部的各材料之間[20,24]。本研究表明85 份供試材料居群間的基因流Nm值為1.94，大于1，表明影響多年生黑麥草遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素是居群內(nèi)個體間的差異[18]，這可能是由于人類活動及地理生境導(dǎo)致的結(jié)果。例如，大洋洲和美洲并沒有野生多年生黑麥草，參考多年生黑麥草在畜牧業(yè)和草坪產(chǎn)業(yè)中的重要地位，推測早期歐洲移民和近百年的黑麥草育種工作開展是導(dǎo)致不同地區(qū)多年生黑麥草種質(zhì)資源地區(qū)間交流的重要原因。

根據(jù)遺傳聚類圖，在遺傳系數(shù)為0.738 時可將材料分5 個大類，Ⅰ類主要來自非洲(15 份)、亞洲(12 份)、歐洲(18 份)及北美洲(23 份)，Ⅱ類主要來自亞洲(9 份自選品種)及大洋洲(1 份)共10 份種質(zhì)資源，Ⅲ類主要來自亞洲(3 份)和歐洲(1 份)，Ⅳ類來自亞洲(1 份)及歐洲(1 份)，Ⅴ類只有來自歐洲的1 份材料。值得一提的是9 個自選品種與大洋洲(PI 601 738 份)聚為一類，說明這10 份材料之間的親緣關(guān)系較近，而與歐洲和北美等種質(zhì)資源遺傳距離較遠(yuǎn)；1 個自選品種(R2-9)與來自北非摩洛哥的種質(zhì)資源親緣關(guān)系較近；自選品種中，R2-4 與R2-8之間的相似系數(shù)高達0.90，親緣關(guān)系最近，與其選育親本材料遺傳相似度較高有關(guān)。

本研究中聚類分析將85 份供試材料分為5 大類，而群體結(jié)構(gòu)分析將供試材料劃分為3 個亞群，二者劃分結(jié)果并不一致，其原因可能是聚類分析以遺傳相似系數(shù)為劃分依據(jù)，反映材料間的親緣關(guān)系，而Structure 分析以組群是否達到數(shù)學(xué)模型為標(biāo)準(zhǔn)進行Q 值計算后劃分亞群[25]，更多地反映材料祖先起源與材料之間的親緣關(guān)系[20]。聚類分析及群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果均表示多年生黑麥草居群的遺傳多樣性與地理分布無直接關(guān)聯(lián)，暗示多年生黑麥草組群的遺傳分化不符合Wright 的距離分化模型[26]，表明影響多年生黑麥草種群遺傳分化并非是單一因素，可能是其生境及人類引種馴化等多種因素作用的結(jié)果[27]。本研究應(yīng)用兩種方法對供試材料的遺傳多樣性進行聚類劃分，揭示了多年生黑麥草的遺傳多樣性，為今后多年生黑麥草種質(zhì)資源的評價及利用提供了重要依據(jù)。