王子玥，劉凌云，劉 曼，常智慧

（北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院,北京 100083）

葦狀羊茅(Festuca arundinacea)是禾本科羊茅屬的多年生草本植物，是高度自交不親和的異源六倍體(2n=6x=42)植物，染色體為PPG1G1G2G2[1]。因其冬季高產(chǎn)，耐粗放管理，成坪效果好，同時具有能儲存重金屬等優(yōu)良特性，在牧草生產(chǎn)、草坪綠化、生態(tài)修復(fù)等方面被應(yīng)用廣泛[2]。

種質(zhì)資源是作物育種的基礎(chǔ)，開展種質(zhì)資源的遺傳背景研究、多樣性分析對遺傳育種和種質(zhì)資源收集、鑒定具有重要的意義[3]。與傳統(tǒng)評價方法相比，DNA 標(biāo)記由于受環(huán)境影響較小，更加能夠反映真實的遺傳多樣性[4]。SSR 標(biāo)記根據(jù)來源可分為基因組SSR 和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR (EST-SSR)[5]。ESTSSR 是基于表達(dá)序列標(biāo)簽開發(fā)微衛(wèi)星的一種新型分子標(biāo)記[6]。目前EST-SSR 標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究[7]，比如研究者[8]采用RAPD 和EST-SSR兩種標(biāo)記探究36 份葦狀羊茅的遺傳多樣性，其中RAPD 和SSR 都顯示出高多態(tài)性。從株高、分蘗、粗蛋白等農(nóng)藝性狀結(jié)合EST-SSR 標(biāo)記，探究115 份葦狀羊茅的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)其中100 份供試材料的遺傳多樣性水平較低[9]。

種子大小與幼苗競爭能力、休眠、萌發(fā)、出土生長率、植物幼苗大小、花的大小、植物壽命以及植物發(fā)育過程都密切相關(guān)[10]。目前關(guān)于植物種子大小遺傳規(guī)律的研究，主要在黃瓜(Cucumis sativus)、花生(Arachis hypogaea)、大豆(Glycine max)等作物中[11-13]。葦狀羊茅相關(guān)的遺傳分析，多采用分子標(biāo)記或者將分子標(biāo)記與生長發(fā)育習(xí)性、植物學(xué)特性、品質(zhì)性狀等指標(biāo)結(jié)合。但針對草種形態(tài)的研究鮮有報道。

隨著生態(tài)建設(shè)的推進(jìn)，葦狀羊茅育種的目標(biāo)越發(fā)多元化，其遺傳背景與分類工作顯得尤為重要。為了解不同來源葦狀羊茅種質(zhì)的親緣關(guān)系，以及開展不同種質(zhì)資源的科學(xué)評價，本研究結(jié)合原產(chǎn)地差異、EST-SSR 標(biāo)記對36 份葦狀羊茅進(jìn)行遺傳多樣性分析，并根據(jù)其種子表型性狀進(jìn)行聚類分析，以期探究36 份不同來源葦狀羊茅的遺傳差異，進(jìn)而為葦狀羊茅遺傳資源的鑒定、核心種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)資源的收集

試驗共收集到36 份葦狀羊茅(25 份野生品種，10 份引進(jìn)品種，1 份地方品種)為材料，其中35 份由全國畜牧總站提供，另外1 份為商業(yè)品種，由北京正道種業(yè)有限公司提供(表1)。36 份材料分別來自17 個國家涵蓋了歐洲(芬蘭、波蘭、羅馬尼亞、荷蘭、法國、摩納哥、捷克、挪威、保加利亞、南斯拉夫、希臘)、大洋洲(新西蘭)、亞洲(中國、哈薩克斯坦)、非洲(突尼斯)、北美洲(加拿大、美國)。其中中國的13 份材料分別來自北京、新疆、江蘇、青海、貴州、云南、四川、甘肅8 個地區(qū)。

表1 36 份葦狀羊茅種質(zhì)信息表Table 1 Information of 36 tall fescue germplasms

1.2 種子特征的測定

測定方法參考《NYT 2127-2012 牧草種質(zhì)資源田間評價技術(shù)規(guī)程》[14]。種子長、寬、厚：以風(fēng)干后的成熟飽滿干籽粒為觀測對象，分別隨機抽取10 粒干種子，測量最長、最寬、最厚處的距離。千粒重：由于初始種子數(shù)量較少，隨機選取種子50 粒稱重，重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)保留兩位小數(shù)。

1.3 基因組DNA 的提取和EST-SSR 標(biāo)記

每份供試材料選取15 粒種子，于2020年9月10日在培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)與預(yù)培養(yǎng)[25 ℃/20 ℃，16 h/8 h(光照/黑暗)，光強24 000 lx，濕度65%]。3 周后，各挑選10 株以30 cm 固定行間距移栽至三頃園苗圃(40°00′24″N，116°19′60″E)。2020年11月13日，每份材料隨機選擇5 棵單株，以相同量生長良好的嫩葉進(jìn)行混合，液氮充分研磨[15]。采用Omega 試劑盒提取DNA。提取完的DNA 使用Nanodrop 2000 檢測濃度，其OD260/OD280均在1.7～2.0，并使用2%瓊脂糖電泳凝膠檢測純度。最后將試樣濃度稀釋至30 ng·μL-1，在3 個離心管中各分裝100 μL 液體，-20 ℃保存，用于PCR 反應(yīng)。

EST-SSR 引物由文獻(xiàn)[16]設(shè)計的157 條引物中隨機挑選20 條(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成)，其中14 條引物擴(kuò)增效果良好(表2)。10 μL PCR反應(yīng)體系含有5 μL 2×Taq Master Mix (KT205，北京天根有限公司)，0.2 μmol·L-1各引物，2 μL 樣品DNA和2.6 μL 無菌水[17]。利用Bio-Rad T100 PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序94 ℃初變性3 min，94 ℃變性30 s，特定溫度退火30 s 和72 ℃延伸60 s，進(jìn)行34 個循環(huán)，在72 ℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物在8.0%聚丙烯酰胺非變性凝膠上分離并通過銀染法顯現(xiàn)，使用Bio-Rad 全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存，用于后續(xù)分析[18]。

表2 14 對葦狀羊茅 EST-SSR 標(biāo)記信息Table 2 Information of 14 pairs EST-SSR markers in Tall fescue

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

由于供試材料多為六倍體且取樣為多個單株混合取樣，標(biāo)記的一個位點可能在6 個亞基因組中出現(xiàn)多條條帶，故無法按照二倍體共顯性標(biāo)記，記錄基因型[19]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物只能在某一位點上按“有”或“無”進(jìn)行統(tǒng)計，有條帶的標(biāo)記為“1”，無條帶記為“0”。

種子特征數(shù)據(jù)采用SPSS 23 進(jìn)行方差分析，R 4.04 繪制方差分析圖和K 均值聚類圖；遺傳距離和聚類分析采用NTSYS 軟件分析[20]；遺傳信息中，觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon 信息指數(shù)(I)采用POPGEN 32 計算[21]；引物的多態(tài)性信息含量(PIC)采用公式：

式中：PICi為標(biāo)記i的多態(tài)信息量；fi為第i種等位基因占總基因數(shù)的比率；1 -fi是缺少的基因頻率[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR 條帶分析

使用表2 中20 條引物對36 份葦狀羊茅進(jìn)行了EST-SSR 標(biāo)記的擴(kuò)增。結(jié)果表明，14 對引物共擴(kuò)增140 條帶，多態(tài)性條帶總數(shù)為133 條，多態(tài)性條帶百分率95%；平均每對引物擴(kuò)增出10 個條帶，14 對引物所擴(kuò)增出的多態(tài)條帶數(shù)在8 個(NFA021)～13 個(NFA035)之間，平均多態(tài)條帶數(shù)為9.5 個(圖1)。36份參試葦狀羊茅資源的多態(tài)信息Na、Ne、H和I平均值分別為1.966、1.446、0.271 和0.420 (表3)。說明各葦狀羊茅樣品之間的遺傳多樣性處于較高水平。計算其遺傳距離與遺傳相似性，平均遺傳距離為0.576，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各樣品之間的遺傳多樣性處于較高水平，遺傳基礎(chǔ)較寬。PIC值最大為0.346，平均值為0.27，這表明引物具有很好的有效性。

表3 36份葦狀羊茅遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity index of 36 tall fescue germplasms

圖1 引物NFA047 對36 份葦狀羊茅種質(zhì)的擴(kuò)增條帶Figure 1 Amplified bands of 36 tall fescue germplasms by primer NFA047

2.2 UPGMA 聚類分析

對36 份葦狀羊茅材料的SSR 分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行UPGMA 聚類分析，得到UPGMA 聚類圖(圖2)，其相關(guān)性系數(shù)為r=0.913，說明聚類結(jié)果可靠。在遺傳距離為0.63 時，可將36 份葦狀羊茅分為主要3 類和1 個混合群體。其中T1 和T13 被聚為一類，T15、T16、T17 和T18 被聚為一類。T8 和T9 的遺傳距離相同，遺傳距離最高為0.85。當(dāng)遺傳距離為0.46 時T23 被單獨聚為一類。

圖2 36 份葦狀羊茅資源的UPGMA 聚類Figure 2 UPGMA dendrogram of 36 tall fescue germplasms

2.3 種子表型的K-均值聚類

測定36 份供試材料的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，36 份種子長度在5.39～7.67 mm，寬度在0.87～1.29 mm，厚度在0.33～0.74 mm，千粒重在1.53～3.55 g (表4)，四者的變異系數(shù)分別為8.72%、10.43%、18.72%和19.18%。

表4 36份葦狀羊茅種子特征數(shù)據(jù)Table 4 Data on the seed characteristics of 36 tall fescue germplasms

采用R (版本4.04)對36 份種子的表型性狀測量數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析(圖3)，在K=4 時，種子特征為短、窄、薄、千粒重小的T6、T22 和T33，3 個品系被聚為一類，這與遺傳距離在0.54 時的UPGMA 聚類結(jié)果相同。T21 和T3 等品系則因為種子長度長、寬度寬、厚度厚、千粒重大的特點被歸為另一大類。

圖3 36 份葦狀羊茅種子表型的系統(tǒng)聚類分析Figure 3 System cluster analysis of 36 tall fescue germplasms

2.4 不同地理區(qū)劃的葦狀羊茅種子特征平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)

受樣本數(shù)限制，本研究取亞洲群體、歐洲群體和北美洲群體共計33 份材料，探究不同地理區(qū)劃的葦狀羊茅種子特征平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(表5)。其中亞洲群體的種子的長、寬、高以及千粒重數(shù)據(jù)均最大，但是長、寬、高數(shù)據(jù)在3 個群體內(nèi)均不存在顯著性差異(P＞0.05)。歐洲群體的平均千粒重為2.36 g，低于亞洲、北美洲群體，且差異顯著(P＞0.05)。另外北美群體4 個種子特征的變異系數(shù)最小范圍為2.04%～5.65%，歐洲群體種子高度和千粒重變異系數(shù)最大，分別達(dá)到了25.02%和23.35%。

表5 不同區(qū)劃種子特征上的差異Table 5 Differences in seed characteristics between zones

3 討論

我國目前育成的草種新品種，品種間差異小、同質(zhì)化等問題比較突出[23]，擴(kuò)大種質(zhì)地理來源的跨度以及開展多角度種質(zhì)資源評價是直接、有效的方法。遺傳多樣性分析是作物改良計劃的一個重要步驟[24]。目前，針對葦狀羊茅種質(zhì)的遺傳分析已經(jīng)做了許多研究，但是卻忽略了草種子特征的差異。有研究表明，大粒種子比小粒種子擁有較大的胚乳或子葉，能夠為幼苗提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，在苗期能忍受更大的環(huán)境壓力，對后代幼苗貢獻(xiàn)較大[25]。2019年，劉加文等[23]指出提高國產(chǎn)草種供給質(zhì)量和效率，保障有力的國產(chǎn)草種有效供給，才能加快發(fā)展中國草種，贏得產(chǎn)業(yè)發(fā)展主動權(quán)。種子質(zhì)量是草種業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵，因此種子特征研究顯得尤為重要。本研究以36 份來自17 個國家的種質(zhì)為對象，從地理區(qū)劃、EST-SSR 標(biāo)記、種子特征3 個方面探究種質(zhì)資源的差異。

EST-SSR 是分析葦狀羊茅遺傳多樣性的有利工具。研究結(jié)果顯示，36 份種質(zhì)高度異質(zhì)，遺傳距離0.29～0.85，高于李家麗等[26]、Shahabzadeh 等[27]對不同葦狀羊茅品種(系)的分析結(jié)果。在Shahabzadeh等[27]的研究中，引物NFA037 具有最高的多態(tài)性，但是在本研究中，PIC值最高的是NFA021，而NFA037處于中等水平。這種現(xiàn)象可能是種質(zhì)來源差異導(dǎo)致的，Shahabzadeh 等[27]的材料全部收集自伊朗，而本研究的材料來自于17 個不同國家。Lou 等[28]使用90 對葦狀羊茅SSR 標(biāo)記對115 份葦狀羊茅進(jìn)行遺傳分析，共得到1 010 個等位基因，平均基因多樣性指數(shù)(H)為2.55，平均引物多態(tài)性(PIC)為0.211，本研究中H、PIC較上述研究略高，說明供試材料遺傳背景豐富。UPGMA聚類結(jié)果有一定的地域性趨勢，但是不明顯。比如歐洲群體的T3、T4、T5、T20 被聚為了一類，亞洲群體的T15、T16、T17、T18 被聚為一類。但位于同一地域，比如新疆的葦狀羊茅居群并沒有完全聚在一類，這與李倩等[18]用EST-SSR 標(biāo)記對新疆黃花苜蓿野生資源的評價結(jié)論一致。一些居群的獨立聚類表明它們具有遺傳特異性，不同地區(qū)的葦狀羊茅有些聚為一類，表明其親緣關(guān)系較近，可能是不同地區(qū)種質(zhì)材料進(jìn)化來源相同[29]，也有可能是不同種質(zhì)在長期的自然選擇過程中存在基因交流的現(xiàn)象。其中T23 草種的遺傳距離為0.24 差異最大，而它的種子形態(tài)卻沒有大差異。葦狀羊茅和黑麥草曾經(jīng)劃分為羊茅族[30]，它與屬內(nèi)草種乃至黑麥草屬(Lolium)草種高度親和，比如目前國審的“Johnstone” 葦狀羊茅就是由“G1-316”和“G1-307”兩個無性系培育，這些無性系均是通過一年生黑麥(Lolium multiflorum)與多年生黑麥草(Lolium perenne)的雜交后代與葦狀羊茅再雜交而來[31]。因此這份草種可能在授粉過程中出現(xiàn)雜交的情況，該材料可能具有更大的研究價值。

本研究中，使用K 均值聚類法將36 份材料的種子特征分為4 大類。T6、T22、T33 被聚為一類，它們均具有短、窄、薄、千粒重小的特點，這與遺傳距離在0.56 時的聚類結(jié)果相似，進(jìn)一步佐證了SSR 數(shù)據(jù)的置信度。但是，K均值結(jié)果與UPGMA 結(jié)果并不完全相同。比如T15 和T29、T13 和T27 等遺傳距離較遠(yuǎn)的草種卻被聚為一類，可能是種子特征一般受多基因控制[32]。所以在今后研究中，有必要在構(gòu)建高密度飽和遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，對控制種子大小性狀的相關(guān)基因或主效數(shù)量性狀基因座(QTL)進(jìn)行精細(xì)定位。此外，本研究表明，歐洲群體的千粒重顯著低于亞洲以及北美洲群體，其原因可能是，歐洲的典型氣候是溫帶海洋氣候，絕大部分地區(qū)氣候具有溫和濕潤的特征[33]，有利于種子的萌發(fā)，在長期的進(jìn)化過程中，其養(yǎng)分儲存需求逐降低。相反，種子的長、寬、高3 個指標(biāo)在地理上并不存在顯著差異，一方面可能是異花授粉作物存在廣泛的基因交流，另一方面可能是本研究樣本數(shù)較少，比如北美洲群體只有3 個樣本，不具有代表性。

4 結(jié)論

從地理區(qū)劃、EST-SSR 標(biāo)記、種子特征3 個方面對36 份葦狀羊茅進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，種質(zhì)高度異質(zhì)，是良好的育種材料。3 種分類結(jié)果各有異同，植物遺傳背景需要從多角度分析。另外，以種子特征探究葦狀羊茅的遺傳差異是可行且必要的。