潘 誠(chéng)，李志華，徐文正，陳 亮

肺癌是我國(guó)發(fā)病及死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤。其中，肺腺癌是肺癌主要病理亞型之一[1]。盡管薄層CT的普及使得更多早期肺癌病例得以發(fā)現(xiàn)，然而，我國(guó)肺癌患者總體5年生存率仍不足30%[2]。Ki-67由MKI67基因編碼，其表達(dá)量的高低能夠反映腫瘤細(xì)胞增殖能力。研究[3-4]表明，Ki-67表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及肺癌患者預(yù)后相關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變是肺癌最常見的基因突變之一[5]。既往已有數(shù)篇研究圍繞Ki-67表達(dá)與EGFR突變的相關(guān)性展開。然而，研究結(jié)果并不一致，存在樣本量低、分析簡(jiǎn)單、未進(jìn)一步分析Ki-67蛋白聯(lián)合EGFR突變?cè)诜蜗侔╊A(yù)后中的價(jià)值等不足。因此，該研究回顧性分析673例肺腺癌患者資料，探索Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性，并揭示其在肺腺癌預(yù)后中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性篩選2014年1月-2020年4月于本院接受手術(shù)治療的肺癌患者。主要納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①經(jīng)組織病理學(xué)確診的原發(fā)肺腺癌；②浸潤(rùn)性肺腺癌；③單發(fā)肺癌；④有明確的Ki-67蛋白表達(dá)及EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果。

1.2 Ki-67蛋白表達(dá)及EGFR基因突變檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺腺癌組織中Ki-67蛋白表達(dá)(Ki-67抗體，ab92742，上海Abcam公司)。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，采用DAB、蘇木精進(jìn)行染色。由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片，每張切片選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞核呈棕色顆粒)百分比。采用ADx-ARMS法或者PCR-Sanger法檢測(cè)EGFR 18-21外顯子突變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分別采用卡方檢驗(yàn)、Student’st檢驗(yàn)(或方差分析)比較分類變量、連續(xù)變量組間分布差異。采用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)(Spearman’s rho)評(píng)價(jià)Ki-67蛋白表達(dá)與EGFR基因突變相關(guān)性分析；采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)分析比較Ki-67表達(dá)、EGFR基因突變對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響。所有統(tǒng)計(jì)分析均基于R (v3.6.0)及GraphPad Prism (v6.01)完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象臨床病理特征本研究共納入673例浸潤(rùn)性肺腺癌病例。其中，男性222例(32.99%)，女性451例(67.01%)?；颊咂骄挲g(59.82±10.90)歲，平均腫瘤大小(19.24±9.94)mm。有76例(11.29%)患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究對(duì)象具體臨床病理特征見表1。

表1 研究對(duì)象基本特征

2.2 Ki-67表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性如表1所示，肺腺癌患者平均Ki-67表達(dá)為21.37±20.43(表達(dá)中位數(shù)15，四分位區(qū)間IQR: 6～30)既往對(duì)Ki-67表達(dá)高低分組標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，本研究分別以10和25為界對(duì)Ki-67表達(dá)進(jìn)行分組：Ki-67 ≤ 10vsKi-67 > 10；Ki-67<25vsKi-67 ≥ 25。如表2所示，相較于女性(18.84±18.17)、非吸煙患者(19.62±19.02)，男性(26.51±23.61)、吸煙患者(29.89±24.60)Ki-67表達(dá)增高(P<0.001)。隨著腫瘤大小增加，Ki-67表達(dá)逐漸升高(P<0.001)。并且，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本中Ki-67表達(dá)高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(42.14±22.35vs18.73±18.59,P<0.001)。

2.3 EGFR基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性673例肺腺癌組織中，共有462例(68.65%)檢測(cè)出EGFR突變。其中，外顯子21突變234例(50.65%)，外顯子19突變181例(39.18%)。如表3所示，相較于男性(突變率55.86%)、吸煙患者(突變率46.09%)，EGFR突變?cè)谂?突變率74.94%)、非吸煙肺腺癌患者(突變率73.30%)中更常見 (P<0.001)。EGFR突變與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)(P<0.05)。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本中EGFR突變率為56.58%，低于淋巴結(jié)陰性患者中的70.18%(P=0.023)。

2.4 Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性如表2及表4所示，EGFR突變患者Ki-67表達(dá)低于EGFR野生型患者(18.82±17.75vs26.97±24.45,P<0.001)。Ki-67表達(dá)≥25的樣本，EGFR突變率為57.0% (122/214)，低于Ki-67<25樣本的74.1%(340/459)。同樣，EGFR突變患者Ki-67表達(dá)>10的占比為50.9%，低于EGFR野生型患者(57.9%,P<0.001，表4)。發(fā)生19號(hào)外顯子突變的樣本(21.40±20.69)，其Ki-67表達(dá)略高于攜帶21號(hào)(17.31±15.42)或者其他外顯子突變(16.37±15.34)的樣本(P=0.041)。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)顯示，Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變存在較弱的負(fù)相關(guān)關(guān)聯(lián)(rho=-0.129,P<0.001)。

2.5 Ki-67表達(dá)與EGFR突變?cè)诜蜗侔┗颊哳A(yù)后中的意義673例患者中，共有623例術(shù)后時(shí)間超過1年。中位隨訪時(shí)間為29.1月。隨訪期間，有15例患者死亡，43例發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移?？紤]到死亡病例有限，本實(shí)驗(yàn)采用無病生存期DFS(Disease-Free Survival)作為主要結(jié)局指標(biāo)。如圖1a所示，Ki-67>10的樣本，其預(yù)后差于Ki-67≤10的樣本；并且，隨著Ki-67表達(dá)增高，效應(yīng)值呈增大趨勢(shì)。發(fā)生EGFR基因突變的樣本，其預(yù)后較EGFR野生型患者更好(圖1b)。聯(lián)合Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變可見：與Ki-67表達(dá)≤10并且攜帶EGFR突變的患者相比，Ki-67 > 10并且EGFR野生型的患者預(yù)后更差，且HR值達(dá)4.46(圖1c)

表2 Ki-67表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

表3 EGFR基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

3 討論

Ki-67表達(dá)及EGFR基因突變?cè)诜蜗侔┻M(jìn)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。然而，是否Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變存在相關(guān)性，既往研究結(jié)論并不統(tǒng)一。通過回顧性分析673例肺腺癌患者臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變呈負(fù)相關(guān)，二者在肺腺癌預(yù)后中可能發(fā)揮聯(lián)合作用。

此前研究表明,肺癌預(yù)后蛋白標(biāo)志物與EGFR突變相關(guān)[6-7]。徐佳佳 等[8]在120例肺腺癌組織中檢測(cè)Ki-67蛋白表達(dá)與EGFR突變情況，發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變與Ki-67蛋白表達(dá)正相關(guān)；這一結(jié)果與孫宇 等[9]、張煜坤 等[10]發(fā)現(xiàn)一致。然而，韓義明 等[11]在291例NSCLC樣本中發(fā)現(xiàn)Ki-67蛋白表達(dá)與EGFR突變無關(guān)，這一結(jié)果與金澄宇 等[12]、何鋒 等[13]報(bào)道一致。值得注意的是，韓義明 等[11]發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變率在Ki-67陰性組為59.0%，在Ki-67 陽(yáng)性組為46.5%，P值為0.083，邊緣陽(yáng)性；類似地，金澄宇 等[12]在172例肺腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)EGFR在Ki-67陽(yáng)性組突變率為36.8%，低于Ki-67陰性組的43.6%；而何峰 等[13]在140例肺腺癌中發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變相關(guān)系數(shù)為-0.102，但P值大于0.05。由此可見，既往研究已經(jīng)提示Ki-67表達(dá)可能與EGFR基因突變存在負(fù)相關(guān)關(guān)聯(lián)，但由于樣本量限制，差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。此外，分析方法不同、Ki-67高低表達(dá)(陽(yáng)性/陰性)劃分標(biāo)準(zhǔn)不一等皆可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。

表4 Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性[n(%)]

圖1 Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變?cè)诜蜗侔┗颊哳A(yù)后中的價(jià)值

既往研究[4]表明，相較于鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等其他NSCLC病理亞型，肺腺癌中Ki-67表達(dá)更低。并且，浸潤(rùn)性肺腺癌Ki-67表達(dá)較微浸潤(rùn)腺癌、原位腺癌更高[14]。為了排除病理亞型及浸潤(rùn)深度對(duì)Ki-67表達(dá)的影響，本研究針對(duì)浸潤(rùn)性肺腺癌樣本進(jìn)行分析，顯示Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變負(fù)相關(guān)，在男性、吸煙患者中更高，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，這一結(jié)果與既往多項(xiàng)研究結(jié)果一致[4]。與Ki-67特征相反的是，EGFR突變率在女性、非吸煙肺腺癌患者中更高；且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果也從側(cè)面提示：肺腺癌中，Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變可能負(fù)相關(guān)。

生存分析結(jié)果表明，與Ki-67低表達(dá)肺腺癌患者相比，Ki-67高表達(dá)患者預(yù)后更差。而相較于EGFR野生型患者，發(fā)生EGFR突變的患者預(yù)后更好。分析Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變顯示：與Ki-67表達(dá)≤10并且攜帶EGFR突變的患者相比，Ki-67 > 10并且EGFR野生型的患者預(yù)后更差，HR值達(dá)4.46，提示臨床應(yīng)該重視這部分患者的預(yù)后。然而，肺腺癌中Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變相關(guān)的潛在生物學(xué)機(jī)制尚有待闡明。

肺腺癌中，Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變存在負(fù)相關(guān)關(guān)聯(lián)。與Ki-67低表達(dá)并且發(fā)生EGFR突變的肺腺癌患者相比，Ki-67高表達(dá)并且EGFR野生型患者預(yù)后較差。Ki-67表達(dá)與EGFR基因突變?cè)诜蜗侔╊A(yù)后中可能發(fā)揮聯(lián)合作用。