吳雪莉，馮 曉，郝 杰，易 旭

酗酒是世界范圍內(nèi)肝臟疾病的主要原因之一。大量乙醇攝入會(huì)加速肝臟脂肪生成、促進(jìn)脂肪酸從血液進(jìn)入肝臟，使脂蛋白滯留肝臟，肝細(xì)胞線粒體對(duì)脂肪酸的氧化功能減退、肝臟對(duì)脂肪消耗減少等不良作用，進(jìn)而引起肝臟細(xì)胞損傷，導(dǎo)致酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)。

課題組經(jīng)過長(zhǎng)期臨床積累，根據(jù)AFLD辯證論治、遣方用藥的經(jīng)驗(yàn)加以歸納總結(jié)，自擬出由葛花、葛根、白茯苓、綿茵陳、小青皮、甘草、決明子、山楂和明礬組成的葛花解酒滌脂湯，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1-2]已表明該方對(duì)酒精性脂肪肝有明顯的治療作用。但由于中藥成分的多樣性和作用機(jī)制多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)等特點(diǎn)，葛花解酒滌脂湯治療AFLD的主要作用機(jī)制仍不明確。與中醫(yī)整體觀念一致的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能系統(tǒng)地、整體地揭示疾病-疾病、疾病-靶點(diǎn)蛋白、靶點(diǎn)蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯(lián)系。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被逐漸應(yīng)用中醫(yī)藥研究中，對(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)、探索分子作用機(jī)制和闡釋其科學(xué)內(nèi)涵具有重要的價(jià)值[3]。該研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初探葛花解酒滌脂湯治療酒精性脂肪肝的潛在活性化合物及其可能的作用靶點(diǎn)，以期為葛花解酒滌脂湯后續(xù)的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥-化合物數(shù)據(jù)集的建立自中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)百科全書(the encyclopedia of traditional chinese medicine，ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/)和SymMap(https://www.symmap.org)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)葛花解酒滌脂湯中所含9味中藥進(jìn)行化合物篩選。化合物的篩選條件為：ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中“Druglinkness Grading”為“Moderate”或“Good”；SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)中口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%。選取符合條件的化合物作為候選化合物，建立中藥-化合物數(shù)據(jù)集。

1.2 化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集的建立根據(jù)1.1中篩選得到的候選化合物的CAS號(hào)或PubChem ID，于PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找化合物對(duì)應(yīng)的“Canonical SMILES”結(jié)構(gòu)。將化合物的該結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch)，限定物種為人(Homo sapiens)，依據(jù)成分的“Canonical SMILES”結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，選取“Probability”大于0的靶點(diǎn)作為化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，建立葛花解酒滌脂湯化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 疾病數(shù)據(jù)集建立以“alcoholic fatty liver”為檢索詞，于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)獲取AFLD相關(guān)靶點(diǎn)，建立AFLD靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.4 藥物-靶點(diǎn)-疾病數(shù)據(jù)集建立通過Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，將1.2中化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集與1.3中AFLD靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行映射，得到葛花解酒滌脂湯治療AFLD的作用靶點(diǎn)。

1.5 葛花解酒滌脂湯-靶點(diǎn)-AFLD的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將映射后獲得的葛花解酒滌脂湯治療AFLD作用靶點(diǎn)經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)分析獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置最低相互作用閾值為“High confidence(0.900)”，其它參數(shù)均保持默認(rèn)設(shè)置。隨后將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape(3.6.0)軟件構(gòu)建葛花解酒滌脂湯靶點(diǎn)-AFLD的PPI網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape軟件中Network Analyzer分析葛花解酒滌脂湯-靶點(diǎn)-AFLD PPI網(wǎng)絡(luò)的自由度，根據(jù)自由度篩選核心靶點(diǎn)，將自由度>50的靶點(diǎn)納入篩選范圍。

1.6 核心靶點(diǎn)生物功能和通路富集分析運(yùn)用Cytoscape(3.6.0)軟件中的ClueGo插件對(duì)篩選得到的葛花解酒滌脂湯治療AFLD核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集，以了解方藥可能的功能涉及。再結(jié)合KEGG通路富集分析，擬獲得方藥治療AFLD的相關(guān)信號(hào)通路。富集條件均設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 葛花解酒滌脂湯中候選化合物及其作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果根據(jù)候選化合物的篩選條件，在ETCM和SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到的葛花解酒滌脂湯中候選化合物數(shù)量分別如下：葛花、葛根、白茯苓、綿茵陳、小青皮、甘草、決明子、山楂、明礬中分別有74、6、6、33、13、49、15、4、1個(gè)候選化合物。共計(jì)201個(gè)候選化合物。

在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出201個(gè)候選化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，依據(jù)成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去除重復(fù)項(xiàng)后篩選出900個(gè)靶點(diǎn)作為葛花解酒滌脂湯的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將所得的葛花解酒滌脂湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的3 763個(gè)AFLD相關(guān)靶點(diǎn)相映射，篩選出葛花解酒滌脂湯治療AFLD的候選作用靶點(diǎn)575個(gè)(圖1)。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及葛花解酒滌脂湯治療AFLD潛在活性化合物篩選結(jié)果將葛花解酒滌脂湯治療AFLD的575個(gè)候選作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。此網(wǎng)絡(luò)共有575個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 841條邊，網(wǎng)絡(luò)平均節(jié)點(diǎn)數(shù)13.4。通過Cytoscape軟件，對(duì)該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其中自由度>50的靶點(diǎn)共有17個(gè)，選取這17個(gè)靶點(diǎn)作為葛花解酒滌脂湯治療AFLD的核心預(yù)測(cè)靶點(diǎn)(表1)。其中自由度>80的靶點(diǎn)為PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP，該結(jié)果表明葛花解酒滌脂湯治療AFLD主要涉及PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP四個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。這四個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及葛花解酒滌脂湯中的66個(gè)候選化合物，中藥-候選化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。但這66個(gè)候選化合物中，因部分化合物暫無法分離得到單體，因此葛花解酒滌脂湯治療AFLD的潛在活性化合物共有19個(gè)(表2)。

2.3 核心靶點(diǎn)的生物功能和通路富集分析運(yùn)用Cytoscape(3.6.0)軟件中的ClueGo插件對(duì)篩選得到的葛花解酒滌脂湯治療AFLD核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，見圖4、5。在GO功能富集分析結(jié)果中，共確定了46個(gè)條目，其中與分子功能(molecular function)相關(guān)的有6條，涉及蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化、胰島素受體底物結(jié)合、Tau蛋白結(jié)合等分功能；與生物學(xué)過程(biological process)相關(guān)的有40條，其中排名前十的生物學(xué)過程主要涉及吞噬過程中免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、吞噬過程中Fc-γ受體信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、星形膠質(zhì)細(xì)胞分化等方面。通過KEGG通路富集分析，共得到23條相關(guān)通路，其中炎癥相關(guān)通路有7條，激素相關(guān)通路4條；該結(jié)果提示葛花解酒滌脂湯治療AFLD可能是通過炎癥相關(guān)通路、激素相關(guān)通路、自噬、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂解等信號(hào)通路調(diào)控。

表2 葛花解酒滌脂湯治療AFLD的潛在活性化合物

3 討論

在我國(guó)，酒精性肝病成為僅次于非酒精性脂肪肝的第二大導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌相關(guān)死亡的原因。脂肪肝是90%以上酗酒者對(duì)過量飲酒最早的反應(yīng)，是酒精性肝病發(fā)展為AFLD的重要因素。

圖3 GO功能富集氣泡圖

圖4 KEGG通路富集氣泡圖

課題組前期研究已表明[1-2]葛花解酒滌脂湯對(duì)酒精性脂肪肝小鼠具有顯著的治療作用，但其治療AFLD的活性物質(zhì)不清且作用機(jī)制不明。如果繼續(xù)沿用傳統(tǒng)的“一個(gè)靶點(diǎn)，一種疾病，一個(gè)藥物”的研究模式，已很難系統(tǒng)、整體地闡明葛花解酒滌脂湯治療AFLD的作用機(jī)制，并且還會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間、精力。隨著現(xiàn)代科技進(jìn)入大數(shù)據(jù)時(shí)代，系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)等交叉學(xué)科的快速興起，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始從復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的角度探索疾病與藥物的系統(tǒng)性研究方式，“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”這一新學(xué)科由此開端并得到快速發(fā)展。它基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)，通過分析基因網(wǎng)絡(luò)庫(kù)、蛋白網(wǎng)絡(luò)庫(kù)、疾病網(wǎng)絡(luò)庫(kù)、藥物網(wǎng)絡(luò)庫(kù)等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的信息資料，結(jié)合從實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)，利用專業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，系統(tǒng)、整體的揭示疾病-疾病、疾病表型-靶點(diǎn)蛋白、靶點(diǎn)蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯(lián)系。且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)注重藥物作用網(wǎng)絡(luò)及生物網(wǎng)絡(luò)的整體性和系統(tǒng)性，關(guān)注基因、蛋白等在生物網(wǎng)絡(luò)中的生物學(xué)地位和動(dòng)力學(xué)過程，而并非對(duì)其作用單一靶標(biāo)，認(rèn)為藥物作用的是疾病病理網(wǎng)絡(luò)，以多維視角理解疾病和分析疾病，這一理念與中醫(yī)整體觀念一致。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能較好、較全面地運(yùn)用于中藥治療疾病作用機(jī)制的研究，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索葛花解酒滌脂湯治療AFLD的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，葛花解酒滌脂湯可能通過炎癥反應(yīng)相關(guān)通路、激素相關(guān)通路、凋亡相關(guān)信號(hào)通路等信號(hào)通路防治AFLD。

本研究中KEGG富集到葛花解酒滌脂湯干預(yù)AFLD的相關(guān)炎癥通路共有7條，分別為Chemokine信號(hào)通路、C-type lectin receptor信號(hào)通路、Sphingolipid信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、TNF信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路。此外，還富集到凋亡、自噬和脂質(zhì)代謝等通路，這些通路都可通過炎癥反應(yīng)發(fā)揮其在AFLD中的作用[4-5]，因此，課題組認(rèn)為葛花解酒滌脂湯治療AFLD主要是通過抗炎發(fā)揮其藥效作用。已有研究表明AFLD患者體內(nèi)炎癥水平很高[6]，而改善腸道菌群是治療AFLD的手段之一[7]，且這種治療手段主要是通過抗炎發(fā)揮療效[8]。故而作者認(rèn)為抗炎在葛花解酒滌脂湯治療AFLD中發(fā)揮了重要作用。

另外，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)葛花解酒滌脂湯抗AFLD的潛在活性化合物進(jìn)行初探。結(jié)果顯示，葛花解酒滌脂湯中有19個(gè)化合物涉及PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP四個(gè)核心靶點(diǎn)，所以作者認(rèn)為這19個(gè)化合物可能是葛花解酒滌脂湯治療AFLD的潛在活性化合物，而其中喬松素[9]、柚皮素[10]、大黃酚、決明蒽醌和大黃素甲醚[11]、槲皮素[12]、山奈酚[13]、異甘草素[14]、染料木素[15]9個(gè)潛在活性化合物的抗ALFD活性已被相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)。余下10個(gè)化合物的抗ALFD活性有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從理論上不僅肯定了葛花解酒滌脂湯治療AFLD的有效性，還揭示了葛花解酒滌脂湯抗AFLD的潛在活性化合物。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究AFLD發(fā)生及葛花解酒滌脂湯干預(yù)作用機(jī)制提供指導(dǎo)依據(jù)。