常 凱，那琬琳，劉晨霞，江忠勇，王艷艷，許宏宣，沈金蘭，劉 媛

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是人類主要的傳染病之一，目前經(jīng)食藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于治療乙型肝炎的藥物主要包括干擾素類及核苷酸類似物兩大類[1]。然而干擾素的副作用以及核苷酸類似物的耐藥性使得抗HBV的治療方法受到極大限制[2]。

阿維霉素又稱為卑霉素、阿維拉霉素，屬于正霉素族的寡聚糖類抗生素。主要是由綠色產(chǎn)色鏈霉菌Tü57發(fā)酵產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，呈無色針狀結(jié)晶，微溶于水，易溶于丙酮、丙醇、乙酸乙酯、苯和乙醚等有機(jī)溶劑[3]。已發(fā)現(xiàn)其具有抑制多種革蘭陽性菌的功效，如耐萬古霉素的腸球菌、耐甲氧苯青霉素的葡萄球菌等。然而其對(duì)革蘭陰性菌的抑制效果欠佳。臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究[4]發(fā)現(xiàn)，包含阿維霉素在內(nèi)的正霉素類抗生素是一種能夠有效作用于trGTPases的抑制劑。而trGTPases直接作用核糖體翻譯合成起始蛋白質(zhì)，參與病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制[5-6]。因此該研究旨在探討宿主細(xì)胞中阿維霉素對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細(xì)胞系 Hep3B，含HBV基因組，購(gòu)于成都諾和生物科技有限公司。阿維霉素(CAS11051-71-1)(加拿大多倫多研究化學(xué)品公司)，胎牛血清(新西蘭 Gibco公司)。DMEM培養(yǎng)基、PBS、青霉素鏈霉素雙抗購(gòu)于美國(guó)Gbico 公司；Cell Counting Kit(CCK-8)購(gòu)于日本同仁公司；細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購(gòu)于上海碧云天公司；總RNA提取試劑盒、乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)購(gòu)于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)和乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)購(gòu)于北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞Hep3B 培養(yǎng)基：DMEM 高糖培養(yǎng)基、1%青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清。培養(yǎng)條件：5% CO2，37 ℃，濕度為 36%。

1.2.2CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 Hep3B細(xì)胞按每孔1×104個(gè)細(xì)胞的濃度接種于 96 孔板，制備細(xì)胞懸液。經(jīng)18 h待細(xì)胞貼壁后，加入與配置好的含不同濃度阿維霉素的培養(yǎng)基200 μl(阿維霉素濃度分別為0、10、25、50 μg/ml)。加藥培養(yǎng)18、24、48 h 后吸出上清液，每孔加入10 μl CCK-8溶液，再加入90 μl培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm初的吸光度(optical density，OD)。各濃度阿維霉素對(duì)Hep3B細(xì)胞的抑制率=(對(duì)照組OD值-用藥組OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)[7]。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將人肝癌細(xì)胞Hep3B分別接種于6孔板中，接種濃度為 1×104個(gè)細(xì)胞/孔，待18 h細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度阿維霉素的培養(yǎng)基(0、10、25、50 μg/ml)。18 h 后處理消化和洗滌細(xì)胞，再加入5 μl AnnexinV-FITC，室溫，避光，輕輕混勻避光10 min；加入5 μl PI室溫避光孵育5 min，加入PBS適量，輕輕混勻后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用70%的冰乙醇固定 24 h，PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5ELISA法檢測(cè) 阿維霉素對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞上清液中的 HBsAg、HBeAg，qPCR 檢測(cè)阿維霉素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液 HBV DNA 的影響 將 Hep3B 置于T25培養(yǎng)瓶，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，分別添加阿維霉素濃度為0、10、25、50 μg/ml的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞18 h，收集上清液離心5 min(1 500 r/min)，收集上清液用于檢測(cè)HBV DNA、HBsAg和HBeAg。

1.2.6提取mRNA 應(yīng)用總RNA提取試劑盒提取總RNA，收集經(jīng)阿維霉素(濃度0、10、25、50 μg/ml)處理后的18 h的細(xì)胞及上清液，使用離心柱提取法提取RNA，應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)MTIF2基因和pgRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS v24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用表示。符合正態(tài)分布規(guī)律數(shù)據(jù)組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)間比較使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 阿維霉素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響阿維霉素對(duì)Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)未發(fā)現(xiàn)抑制作用，48 h內(nèi)也未表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性。表1顯示阿維霉素對(duì)Hep3B沒有生長(zhǎng)和活性抑制作用。

表1 阿維霉素對(duì)Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響(%)

2.2 阿維霉素對(duì)細(xì)胞死亡和凋亡影響阿維霉素對(duì)Hep3B細(xì)胞沒有促進(jìn)凋亡作用。在不同阿維霉素濃度0、10、25、50 μg/ml處理后，結(jié)果見表2。處理組與對(duì)照組之間不存在差異，表明阿維霉素對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B的凋亡和死亡沒有影響。

表2 阿維霉素對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響

2.3 阿維霉素對(duì)HBV毒力的影響阿維霉素處理Hep3B細(xì)胞18 h后，應(yīng)用Taqman引物qPCR檢測(cè)HBV DNA濃度顯示，不同濃度阿維霉素處理后均能降低HBV-DNA濃度，25 μg/ml降低幅度最大(F=4.03，P=0.005)。但HBV的pgRNA濃度均有不同程度增加，10 μg/ml阿維霉素處理后增加幅度最大(F=12.14，P=0.003)(圖1A、B)。

2.4 阿維霉素對(duì)宿主翻譯調(diào)控蛋白的影響不同濃度阿維霉素處理Hep3B細(xì)胞18 h，檢測(cè)宿主細(xì)胞翻譯調(diào)控蛋白R(shí)PL10和MTIF2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。顯示阿維霉素能夠使RPL10和MTIF2的mRNA表達(dá)水平增加，使RPL10在50 μg/ml的濃度(F=8.87，P=0.003)處理后增加最多，MTIF2增加最多的濃度也在50 μg/ml濃度(F=7.94，P=0.007)(圖1C、D)。

2.5 阿維霉素對(duì)病毒合成蛋白的影響檢測(cè)不同濃度阿維霉素處理后外泌HBV蛋白HBsAg和HBeAg的相對(duì)濃度，結(jié)果表明：不同濃度藥物處理后HBsAg和HBeAg均表現(xiàn)出降低(圖1E、F)。

2.6 阿維霉素對(duì)細(xì)胞外泌成分的影響經(jīng)不同濃度阿維霉素處理后顯示，Hep3B細(xì)胞外泌成分甲胎蛋白濃度降低。阿維霉素處理Hep3B細(xì)胞能夠提高谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)濃度，且具有濃度依賴性。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)濃度在阿維霉素處理后沒有規(guī)律。ALT在10 μg/ml阿維霉素處理后濃度增加(F=2.97，P=0.001)，但在25、50 μg/ml阿維霉素處理后其濃度降低(圖2)。

2.7 阿維霉素抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制應(yīng)用蛋白質(zhì)互作分析軟件STRING v11.0對(duì)宿主內(nèi)的RPL10和MTIF2蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，共有7個(gè)蛋白質(zhì)形成互作集團(tuán)，分別為RPL10、MTIF2、RPL19、RPL35、RPL18A、RPS12和RPS16(圖3A)。富集分析表明：7個(gè)蛋白質(zhì)主要具有參與核糖體結(jié)構(gòu)組成并影響翻譯起始的功能，7個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定位集中在細(xì)胞質(zhì)線粒體和細(xì)胞質(zhì)胞質(zhì)中，主要參與病毒mRNA翻譯和肽鏈的延伸信號(hào)通路。

圖1 阿維霉素對(duì)HBV毒力、宿主核糖體調(diào)控基因和外泌蛋白的影響

圖2 阿維霉素對(duì)Hep3B外泌蛋白的影響

基于該研究，課題組模擬了一個(gè)HBV在宿主細(xì)胞內(nèi)可能存在的復(fù)制機(jī)制，即HBV利用宿主細(xì)胞的核酸復(fù)制轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)形成一個(gè)共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA(cccDNA)。cccDNA以微型染色體形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，提供pgRNA在內(nèi)的所有病毒 mRNA 的轉(zhuǎn)錄模板。pgRNA和mRNA同時(shí)翻譯出多種用于病毒包裝的蛋白，在胞質(zhì)中組裝形成核衣殼復(fù)合體用于形成新的病毒中間體。在該過程中，RPL10和MRIF2分別參與核糖體大亞基的組成和翻譯起始。隨后一部分中間體裝配成成熟的病毒Dane顆粒釋放入血；另一部分重新補(bǔ)充核內(nèi)的cccDNA[8]。以此循環(huán)，大量增殖。該研究顯示經(jīng)阿維霉素處理，在翻譯步驟前的基因pgRNA、RPL10和MTIF2等出現(xiàn)累積，翻譯下游蛋白HBsAg、HBeAg和HBV-DNA濃度卻降低。表明阿維霉素的作用位點(diǎn)位于核糖體翻譯步驟(圖3B)。

3 討論

常見的正霉素類抗生素有阿維霉素和晚霉素等，其能夠結(jié)合rRNA的H89的小溝到H91的環(huán)區(qū)，通過rRNA的擾動(dòng)間接地賦予核糖體翻譯起始抗性[9-10]。晚霉素一般不抑制肽鍵的形成，也不與其他幾種抗生素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核糖體。阿維霉素則是通過干擾AA-tRNA與核糖體的結(jié)合影響翻譯進(jìn)程[11]。阿維霉素和晚霉素均被認(rèn)為是很好的翻譯起始抑制劑，它們以IF2依賴的方式抑制fMet的形成。然而抑制的確切步驟仍然不清楚。

MTIF2為翻譯起始因子IF-2，多存在與線粒體和細(xì)胞質(zhì)，是經(jīng)典翻譯因子GTPase家族中IF-2亞家族成員[12]。MTIF2是蛋白質(zhì)合成起始的基本成分之一，能夠保護(hù)甲硫酰-tRNA不被自發(fā)水解，并促進(jìn)其結(jié)合到30S核糖體亞基[13]。同時(shí)也參與GTP在70S核糖體復(fù)合物的水解。在本研究中使用翻譯起始抑制劑阿維霉素去抑制MTIF2功能，結(jié)果表明阿維霉素表現(xiàn)出對(duì)HBV組裝必需蛋白的翻譯抑制功能。

核糖體蛋白L10(RPL10)為核糖體大亞基的組成單元，然而在核糖體構(gòu)成中并非所有的核糖體蛋白成員均需參加[14-15]。在已有研究中，包括HIV在內(nèi)的多種病毒復(fù)制的翻譯調(diào)控均有RPL10有關(guān)，結(jié)合本次研究結(jié)果，課題組推斷宿主RPL10可能是特異性參與病毒翻譯的核糖體蛋白。

本研究應(yīng)用阿維霉素處理HBV細(xì)胞模型Hep3B，表明阿維霉素能夠有效調(diào)控MTIF2功能，通過抑制翻譯起始減少病毒組裝所需蛋白的翻譯，進(jìn)而影響HBV復(fù)制，反饋導(dǎo)致MTIF2、RPL10和pgRNA等上游基因表達(dá)量增加。該研究與正霉素類抗生素預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)于起始因子在核糖體上的結(jié)合位點(diǎn)相一致。

圖3 RPL10和MTIF2蛋白PPI分析和阿維霉素參與HBV復(fù)制的機(jī)制分析A：RPL10和MTIF2蛋白PPI分析圖；B：阿維霉素參與HBV復(fù)制的機(jī)制示意圖