魏日鳳，彭成彬,2，陳美霞，張政雄，阮俊峰，劉 偉,

（1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；3福建省科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地，福建 寧德 352100）

0 引言

柳葉蠟梅(Chimonanthus salicifoliusS.Y.Hu)是中國(guó)特有的樹種，屬于樟目蠟梅科蠟梅屬的木蘭類植物，多年生半常綠灌木，在森林群落生態(tài)系統(tǒng)中屬于優(yōu)勢(shì)灌木樹種[1]，生長(zhǎng)于福建省壽寧縣、安徽省黃山市、江西省修水縣、浙江省麗水市等地的山區(qū)[2]。柳葉蠟梅作為傳統(tǒng)畬藥制劑的應(yīng)用比較廣泛，具有抗氧化、消炎、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3-4]，其需求量在急劇增長(zhǎng)，野生的柳葉臘梅資源被不斷的開發(fā)利用，人工引種仿野生式的種植模式大面積推廣。種植環(huán)境的改變，導(dǎo)致次要病害在規(guī)?；耘喟l(fā)展后成為主要病害，威脅著柳葉臘梅種植業(yè)，制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。只有明確柳葉臘梅葉斑病的病原菌生物學(xué)特性，才能針對(duì)性措施去防控病害。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)柳葉蠟梅的植物學(xué)特性和藥理作用等有系列研究和報(bào)道[1-3]，但對(duì)柳葉臘梅病害的深入系統(tǒng)研究較少，相關(guān)可以參考柳葉臘梅病害資料不多，劉靜鶴[5]觀察發(fā)現(xiàn)臘梅葉斑病，其發(fā)生規(guī)律在高溫多雨季節(jié)，病斑呈褐色，致使葉片枯萎脫落。文獻(xiàn)資料沒有明確提出由哪種致病菌株引起該病害。彎孢霉是重要的植物病原真菌，在19世紀(jì)30年代被報(bào)道侵染水稻[6-7]，在后續(xù)發(fā)現(xiàn)其能侵染畫眉草[8]、高粱[8]、甘蔗[8]、香蕉[9]、番木瓜[10]、玉米[12]等植物，并引起葉斑等癥狀，對(duì)侵染植物病原菌分離鑒定。要精準(zhǔn)鑒定菌株，還需分析菌株基因型和表現(xiàn)型，以達(dá)到鑒定快速、結(jié)果準(zhǔn)確。利用核糖體DNA非轉(zhuǎn)錄區(qū)(18sRNA、28sRNA、5.8sRNA)的基因序列開發(fā)ITS(Internal Transcribed Spacer，ITS)標(biāo)記[13-14]和β-微管蛋白由β-tubulin 基因所編碼基因序列開發(fā)成β-tubulin 標(biāo)記[15]，二者的序列相識(shí)度較高且生物進(jìn)化具有高度保守基因片段，這2 種標(biāo)記已被諸多研究者進(jìn)行菌類鑒定的報(bào)道[16-17]。

由于侵染植物的病原菌種類繁多，本研究在結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法和分子方法ITS 序列和β-tub 序列對(duì)柳葉臘梅的病原菌進(jìn)行分離鑒定的同時(shí)，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。本試驗(yàn)對(duì)引起柳葉臘梅葉斑病病原菌分離，明確其病原菌種類，探究其生物學(xué)特性，旨在為科學(xué)有效防治柳葉臘梅葉斑病、抗性種質(zhì)資源篩選和抗病品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用致病菌來源分離自柳葉蠟梅葉部病斑，于2018年7月采集自寧德壽寧縣福瑞泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司的種植基地。經(jīng)室內(nèi)無菌條件下分離純化得到供試菌株1018-2。試驗(yàn)在寧德師范學(xué)院生命科學(xué)院分子研究實(shí)驗(yàn)室411，于2018 年7 月—2020 年12月份進(jìn)行病原菌分離純化后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

供試3 種培養(yǎng)基，包括PDA 瓊脂培養(yǎng)基，PD 液體培養(yǎng)基和查氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek Agar)。上述培養(yǎng)基參照植病研究方法配置[18]，置于115℃高壓滅菌20 min后備用。

1.3 方法

1.3.1 柳葉臘梅病斑致病菌分離純化 參照植病研究方法[18]，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行柳葉臘梅葉斑病病原菌的分離純化，分離純化5代后，即得到病原菌菌株。

1.3.2 致病性鑒定 將分離自柳葉臘梅病原菌株分別接種至PDA平板上，置于培養(yǎng)5天后，用無菌的5 mm的打孔器分別打取菌餅和空白瓊脂平板分別接入進(jìn)行離體柳葉臘梅葉片回接侵染。26℃保濕培養(yǎng)，逐日觀察葉片的發(fā)病情況，若發(fā)病，則對(duì)柳葉臘梅葉片發(fā)病部位再重新組織分離，得到與原始接種菌株真菌形態(tài)一致的菌株，則可確定為該病的病原菌。

1.3.3 致病菌鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

接種純化的1018-2菌株至PDA培養(yǎng)基中央，28℃黑暗條件下培養(yǎng)，定期觀察記錄菌落培養(yǎng)特征，通過顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)特征并拍照保存。根據(jù)菌落形態(tài)特征和分生孢子特征，查閱真菌鑒定手冊(cè)等相關(guān)資料確定病原菌種類[19]。

（2）分子鑒定

1018-2 病原菌基因組DNA 按照試劑盒提取的方法進(jìn)行（天根生化科技有限公司，北京），分別擴(kuò)增rDNA-ITS 序列和微管蛋白延伸因子(β-Tub)片段。2對(duì)引物序列分別為ITS1(5'- TCCGTAGGTGAA CCTGCGC-3')/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和β-TubF(5'-GACCCTTGGCCCAGTTGTTTCCAG-3')/β- TubR(5'- CAGAAAGCAGCACCGTTTTTGGTT-3')，引物合成委托福州鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。PCR 反應(yīng)體系擴(kuò)增程序見表1，分別取5 μL 上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V 15 min)，分析ITS 和Tub 的PCR 產(chǎn)物片段大小，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送到福州鉑尚生物技術(shù)有限公司委托進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)序列結(jié)果提交到NCBI 的GenBank 進(jìn)行BLAST 搜索比對(duì)，采用軟件MEGA 5.0 的Neighbour-Joining 法（簡(jiǎn)稱：NJ）分別構(gòu)建ITS和Tub序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

表1 ITS和β-Tub PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

1.3.4 不同條件下菌絲生長(zhǎng)影響

（1）溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

用無菌5 mm 直徑打孔器打取培養(yǎng)5 天的1018-2菌落邊緣菌餅備用，分別將菌餅接種置于PDA培養(yǎng)基中央（皿的直徑為9 cm，下同），分別置于5～40℃條件下（每5℃為一個(gè)梯度，共8 個(gè)不同溫度條件）恒溫培養(yǎng)，7 天后用十字交叉法分別測(cè)定1018-2 病原菌的菌落直徑。每處理重復(fù)3次。

（2）pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)配pH 3～12的PDA 培養(yǎng)基。菌餅獲取及接種方法同1.3.4(1)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，7 天后用十字交叉法測(cè)定分別測(cè)定1018-2病原菌的菌落直徑。每處理重復(fù)3次。

（3）光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌餅獲取及接種方法同1.3.4(1)，分別置于連續(xù)光照、12 h 明暗交替、完全黑暗3 種光照條件下，28℃恒溫培養(yǎng)，7 天后用十字交叉法測(cè)定1018-2 病原菌的菌落直徑，每處理3次重復(fù)。

（4）不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其中的蔗糖以葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、山梨醇、肌醇、木糖醇等量替換，即成含糖量相同而碳源不同的培養(yǎng)基，滅菌后接入5 mm菌餅，菌餅獲取及接種方法同1.3.4(1)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，7 天后用十字交叉法測(cè)定1018-2病原菌的菌落直徑，每處理3次重復(fù)。

（5）不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其中的硝酸鈉以硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉、尿素、氯化氨、甘氨酸和硫酸銨等量替換，即成含氮量相同而氮源不同的培養(yǎng)基，菌餅獲取及接種方法同1.3.4(1)，置于28℃恒溫培養(yǎng)，7 天后用十字交叉法測(cè)定1018-2 病原菌的菌落直徑，每處理3次重復(fù)。

（6）菌絲體的致死溫度測(cè)定

將5 mm 菌餅置于無菌試管中，加入2 mL 滅菌ddH2O。分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃水浴鍋中處理10 min 后，將試管內(nèi)菌絲塊置于PDA 培養(yǎng)基中央，置于28℃下培養(yǎng)，5天后觀察其生長(zhǎng)情況。每處理重復(fù)3次。

（7）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS 17.0 軟件對(duì)菌落直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，并利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳葉臘梅田間病斑和致病性測(cè)定

田間柳葉臘梅的葉片發(fā)病癥狀：表現(xiàn)為褐色病斑，略凹陷。多呈橢圓形，病斑部位略薄，病健界限明顯，邊緣有黃色圓圈，發(fā)病后期葉片脫落，田間采集病葉見圖1。采用常規(guī)組織法分離得到1株致病分離物，編號(hào)為1018-2，分別取5 mm 純化后的菌餅接種離體柳葉臘梅葉片，4 天開始發(fā)病，形成褐化病健界限明顯，結(jié)果見圖1。重新分離純化可得到相同的病原菌，完成科赫法則，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 菌落形態(tài)和致病性鑒定

2.2 形態(tài)特征觀察

1018-2分離物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天正面菌落灰色、褐色至黑色；中部扁平，氣生菌絲不致密，棉絮狀、絨毛狀；邊緣不整齊。背面黑褐色。倒卵形、接近寬紡錘狀形，大多4胞，具有3個(gè)硬質(zhì)隔膜，中間隔膜呈黃褐色的條帶，兩邊細(xì)胞膨大可見兩個(gè)黃褐色晶體，23～29(24)×12～17(15)μm，通過形態(tài)學(xué)觀察，比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)形態(tài)學(xué)描述結(jié)果相吻合[6-19]，初步判斷為彎孢霉。

2.3 PCR克隆及測(cè)序分析序列分析

分別提取病原菌株的基因組DNA 進(jìn)行特異性引物ITS和β-tub擴(kuò)增1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（120 V電壓下15～20 min），結(jié)果如圖2 可知擴(kuò)增的ITS 和β-tub條帶單一、清晰明亮、分子量分別在500～750 bp 和250～500 bp 與預(yù)期大小一致，由于另外一對(duì)引物擴(kuò)增與預(yù)期結(jié)果不一致，不再做分析。測(cè)序分析結(jié)果經(jīng)NCBI 比對(duì)，1018-2 菌株的ITS 序列與登錄號(hào)GU073102 為C.intermedia相似度達(dá)100%，β-tub 序列與登錄號(hào)KT021244.1 為C.hawaiiensis相似度達(dá)97.24%，下載同種屬序列，分別構(gòu)建NJ 進(jìn)化樹分別為圖3和圖4，結(jié)合形態(tài)學(xué)文獻(xiàn)資料判定1018-2為間型彎胞霉C.intermedia[12]。

圖2 PCR結(jié)果圖

圖3 基于ITS序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹

圖4 基于β-Tub序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹

2.4 不同條件下菌絲生長(zhǎng)影響

2.4.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)7天后測(cè)量菌落直徑，由圖6可知，病原菌在10～35℃均可生長(zhǎng)，當(dāng)溫度在5℃菌絲體生長(zhǎng)受到抑制，無法正常生長(zhǎng)；在10～30℃下，隨著溫度升高，病原菌菌落直徑增大；其中30℃時(shí)，1018-2 菌落直徑最大，為8 cm，顯著高于其他溫度下的菌落直徑；30℃后下隨著溫度升高，病原菌菌落直徑減小，菌絲體生長(zhǎng)受到抑制；且當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，病原菌生長(zhǎng)完全受到抑制。

2.4.2 pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)7 天后測(cè)量菌落直徑，由圖6可知，1018-2病原菌在pH 3～11下均可生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)范圍是pH 7～9 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較好，且當(dāng)pH 8時(shí)，菌絲直徑達(dá)到最大值8 cm。病原菌在弱酸到中性到弱堿環(huán)境下有利菌絲生長(zhǎng)，酸性或堿性過強(qiáng)都會(huì)抑制病菌的生長(zhǎng)。

圖5 不同溫度處理病原菌的菌落直徑

圖6 不同pH處理病原菌的菌落直徑

2.4.3 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌在連續(xù)光照、12 h光照12 h黑暗交替、完全黑暗，這3種光照條件下均可生長(zhǎng)，培養(yǎng)7天后測(cè)量菌落直徑均為8 cm，三者菌絲直徑差別不顯著。光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響不大。

2.4.4 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在碳源測(cè)定中，培養(yǎng)7 天的結(jié)果從圖7 可知，病原菌在不同碳源上均生長(zhǎng)，在供試的11種碳源中，該菌在以葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快其菌落直徑最大，為8 cm，極顯著高于其余碳源，病原菌以葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為最佳碳源。在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基，其菌落直徑最小，為4 cm，菌絲生長(zhǎng)較慢。

圖7 不同碳源處理病原菌的菌落直徑

2.4.5 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在氮源測(cè)定中，培養(yǎng)7天的結(jié)果從圖8可知，氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)（菌落直徑）的影響不顯著，在供試的8 種氮源中，其中，硝酸鉀、酵母粉和硝酸鈉的菌落直徑均為8 cm，以硫酸氨為氮源的培養(yǎng)基其菌絲生長(zhǎng)慢，菌落直徑為3.42 cm，對(duì)硫酸氨利用率低，尿素作為氮源不適合1018-2病原菌生長(zhǎng)。

圖8 不同氮源處理病原菌的菌落直徑

2.4.6 菌絲體的致死溫度測(cè)定5 mm 菌塊在40～50℃的水浴溫度處理后，病原菌1018-2仍然能在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，55～60℃，病原菌1018-2在PDA培養(yǎng)基上不再生長(zhǎng)，在51～54℃進(jìn)一步探究，5 mm 菌餅在52℃的水浴溫度處理后能在PDA培養(yǎng)基不生長(zhǎng)，表明病原菌1018-2致死溫度為52℃。

3 討論

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)柳葉臘梅病害防控的研究報(bào)道不多，最早由劉靜鶴[5]觀察發(fā)現(xiàn)臘梅葉斑病，致使葉片枯萎脫落，但文獻(xiàn)資料中沒有明確提出由哪種致病菌株引起該病害。壽寧地處閩東，多為山地，經(jīng)過公司近幾年的研究已建立一套適合柳葉蠟梅繁殖、生長(zhǎng)的體系，與茶葉拼配的黃金茶在市場(chǎng)上也頗受青睞，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)增收、鄉(xiāng)村振興做出了貢獻(xiàn)。隨著栽培面積的擴(kuò)大，發(fā)現(xiàn)有葉斑病病害，影響了品質(zhì)。因此本研究擬明確病害的主要病原菌及生長(zhǎng)特性，為準(zhǔn)確防治奠定基礎(chǔ)。

通過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，首次分離到間型彎孢霉C.intermedia是引起柳葉臘梅葉斑病的病原菌之一。彎孢霉屬真菌是自然界當(dāng)中重要的真菌類群，可對(duì)植物致病，亦可在腐質(zhì)土壤中腐生生活[20]。在19世紀(jì)30年代被報(bào)道侵染水稻[5-6]，后續(xù)發(fā)現(xiàn)其能侵染畫眉草[8]、高粱[8]、甘蔗[8]、香蕉[9]、番木瓜[10]、玉米[12]等多種植物，彎孢霉屬真菌主要寄主為禾本科植物，但在木本科植物柳葉臘梅尚屬首次發(fā)現(xiàn)，究其原因，隨著人工的仿野生種植環(huán)境發(fā)生改變，原本田間其他寄主病害開始迅速蔓延傳播至柳葉臘梅葉片，有研究者發(fā)現(xiàn)C.intermedia的寄主之一是禾本科的牛筋草(Eleusine indica(L.)Gaertn.)[21]，為世界十大惡性雜草之一[22]，在田間路邊隨處可見，多生長(zhǎng)于田間地頭及道路旁，而且柳葉臘梅苗木開展規(guī)?；N植，生態(tài)群落層次上留給農(nóng)田雜草生長(zhǎng)空間[23-24]，雖然對(duì)柳葉臘梅葉片光照光合作用不影響，但雜草爭(zhēng)奪種植苗木的土壤養(yǎng)分和水分，同時(shí)伴隨著傳播病害的威脅，雜草充當(dāng)傳播真菌病害的中間寄主，導(dǎo)致柳葉臘梅真菌病害發(fā)生，直接或間接影響著柳葉臘梅葉片產(chǎn)量和品質(zhì)。建議企業(yè)對(duì)于柳葉臘梅種植管理方面必須注意田間雜草清理，可從根源上防治病害傳播[25]。

本研究對(duì)于分離的病原菌1018-2 的β-tub 測(cè)序結(jié)果，在NCBI 數(shù)據(jù)庫里比對(duì)得到的結(jié)果是登錄號(hào)KT021244.1 為C.hawaiiensis相似度達(dá)97.24%，結(jié)果與ITS序列比對(duì)的C.intermedia不一致，推測(cè)由于用βtub 引物對(duì)于間型彎孢霉這一真菌分類的研究者較少。推測(cè)僅借助單一引物序列進(jìn)行鑒定，存在片段太小不足以反映菌株差異，導(dǎo)致準(zhǔn)確性較低。接下來擴(kuò)增ACT、CAL、LSU、CHS 等引物，通過多標(biāo)記聯(lián)合分析解析該菌的特征。

本研究對(duì)C.intermedia生物學(xué)特性進(jìn)行探究中，在氮源上受限制于玻璃培養(yǎng)皿的大小，在7 天的菌落培養(yǎng)情況硝酸鉀、酵母粉和硝酸鈉的菌落直徑均為8 cm，本研究發(fā)現(xiàn)這一結(jié)果與徐輝研究的同一屬真菌C.lunata的氮源上既有相同之處又有不同之處，推測(cè)原因可能是同屬不同種之間的生物學(xué)特性差異所致[7]，后續(xù)嘗試使用15 cm培養(yǎng)皿對(duì)它的氮源上進(jìn)行探究。柳葉蠟酶作為鄉(xiāng)土樹種，值得一提的是，柳葉蠟梅病害防治研究方面相對(duì)空缺，下一步工作將以此基礎(chǔ)上，展開防治該病害的相關(guān)工作，通過進(jìn)行化學(xué)和生物方法進(jìn)行防治該病原菌，以有效防治柳葉臘梅彎孢霉葉斑病的產(chǎn)生，為生產(chǎn)解決實(shí)際病害問題。

4 結(jié)論

本研究首次報(bào)道了壽寧縣柳葉臘梅的一種新病害，葉斑病病原菌經(jīng)形態(tài)特征觀測(cè)和rDNA-ITS 和TUB 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫的分析比對(duì)，鑒定為半知菌門、絲孢綱、彎孢屬間型彎孢C.intermedia。該病原菌的最適生長(zhǎng)條件最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適pH 8，最適碳源為葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，最適氮源為硝酸鉀、酵母粉和硝酸鈉，光照對(duì)該菌株的生長(zhǎng)沒有影響，菌絲體致死溫度為52℃?？蔀榱~臘梅葉斑病的綜合防治、抗性種質(zhì)資源篩選和抗病品種選育提供理論參考。