李佳歡，王曉慧，姜明國，宋福強，常 偉

（1黑龍江大學(xué)生命學(xué)院/黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室，哈爾濱 150080；2廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西多糖材料與改性重點實驗室，南寧 530008）

0 引言

印度梨形孢(Serendipita indica)是1998 年Verma等人從印度西北部塔爾沙漠地區(qū)的灌木叢根部上分離得到的根內(nèi)生真菌[1]，可以與宿主植物建立共生關(guān)系。共生體會促進(jìn)植物生長、養(yǎng)分吸收，提高植物抗病性和耐脅迫能力，增加植物的生物量等[2]。

已有研究表明，以S.indica生物量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法(Response surface methodology, RSM) 對S.indica液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)條件是初始pH值為6.02、培養(yǎng)溫度為27.55℃[3]。2019年舒珊等[4]報道發(fā)現(xiàn)V8 培養(yǎng)基是S.indica的最適培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天后，已接近長滿整個平板，且加入一定量的蔗糖有助于促進(jìn)S.indica的生長。Swetha 等[5]報道通過篩選培養(yǎng)基成分能提高S.indica中淀粉酶和蛋白酶的產(chǎn)生。此外，接種S.indica可促進(jìn)金柑(Fortunella japonica)、甘 薯(Ipomoea batatas)和 黑 麥 草(Lolium perenne)的生長發(fā)育[6-8]；提高煙草(Nicotiana tabacum)、棉花(Gossypiumspp.)和玉米(Zea mays)的抗旱性[9-11]，以及蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、紫花苜蓿(Medicago sativa)和核桃(Juglans regia)的耐鹽性[12-14]；增強植物的抗病性[15-16]；還可以促進(jìn)水稻(Oryza sativa)、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)和生菜(Lactuca sativaL.var.ramosaHort.)對磷素的吸收[17-19]，減輕重金屬對植物的毒害作用[20-22]。

S.indica具有與叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)類似的生物學(xué)功能，但AMF不能在人工培養(yǎng)基上純培養(yǎng)極大制約了其在生物技術(shù)基礎(chǔ)研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。S.indica不存在這一問題，由于可以在合成培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)并且完成生活史，使其在可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，并取得了一定的研究成果[2]。碳源、氮源、各種無機鹽等培養(yǎng)基成分對微生物細(xì)胞的生長、孢子的產(chǎn)生和代謝產(chǎn)物的積累有著強烈的影響[5]。目前，S.indica的培養(yǎng)通常采用的是Kafer 培養(yǎng)基與PDA 培養(yǎng)基，只適合于實驗室小型試驗階段，由于生長速度較慢，繼代周期長，需要通過有效手段加快S.indica在培養(yǎng)基上的生長速率[23]。因此，培養(yǎng)基成分的篩選及其優(yōu)化是實現(xiàn)S.indica生物肥料規(guī)?；a(chǎn)的重要前提和基礎(chǔ)。

本研究通過對S.indica培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，探究培養(yǎng)基種類、溫度、PH 值、碳源、氮源和無機鹽共六種影響因子對S.indica生長的影響，并利用RSM設(shè)計三因素三水平試驗，對S.indica培養(yǎng)基響應(yīng)面分析試驗結(jié)果進(jìn)行分析，建立以S.indica生長速率為響應(yīng)值的三元二次回歸方程，通過回歸分析對S.indica培養(yǎng)基進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化，有效提高S.indica生長速率，為下一步對其進(jìn)行田間應(yīng)用試驗，以及作為環(huán)保型生物菌劑的商品化開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

S.indica菌株由長江大學(xué)園藝園林學(xué)院吳楚教授贈送；培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機鹽均為市售產(chǎn)品，分析純。試驗在黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室，于2019年3月—2020年12月份進(jìn)行。

1.2 單因素試驗設(shè)計

1.2.1 培養(yǎng)基 在溫度28℃、pH 6.9條件下，將菌種接種到PDA 培養(yǎng)基、綜合PDA 培養(yǎng)基、MMN 等培養(yǎng)基測定菌種的生長狀況，配方如表1[24]。在培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14天，每日用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌落生長狀況，每個試驗下3組重復(fù)。

表1 供試培養(yǎng)基配方

1.2.2 溫度 以MMN 固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定單因素試驗中溫度的梯度范圍，分別為22、25、28、31、34、37℃，如表2 所示，在pH 6.9 條件下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，每日用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌落生長狀況，每個試驗下3次重復(fù)。

1.2.3 pH 以MMN 固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定單因素試驗中pH的梯度范圍，分別為6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3，如表2所示，在溫度31℃條件下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，每日用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌落生長狀況，每個試驗下3次重復(fù)。

1.2.4 碳源 以MMN 固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定單因素試驗中碳源分別為牛肉膏、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、秸稈，并以無碳培養(yǎng)基作對照，氮源和無機鹽不變，如表2所示，進(jìn)行培養(yǎng)，每日用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌落生長狀況，每個試驗下3次重復(fù)。

1.2.5 氮源 以MMN 固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定單因素試驗中氮源分別為尿素、硝酸鈉、蛋白胨、磷酸氫二銨、酵母浸粉，并以無氮培養(yǎng)基作對照，碳源和無機鹽不變，如表2 所示，進(jìn)行培養(yǎng)，每日用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌落生長狀況，每個試驗下3次重復(fù)。

表2 培養(yǎng)條件的的選擇

1.2.6 無機鹽 以MMN 固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定單因素試驗中無機鹽分別為硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鈣和氯化鐵，并以無鹽培養(yǎng)基作對照，碳源和氮源不變，如表2 所示，進(jìn)行培養(yǎng)，每日用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌落生長狀況，每個試驗下3次重復(fù)。

1.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗確定各試驗因素后結(jié)果，利用RSM 優(yōu)化S.indica培養(yǎng)基，以S.indica的生長速率為響應(yīng)值，采用Design Expert 10 軟件中的Box-Behnken design 設(shè)計原理。在單因素基礎(chǔ)上選擇硫酸鎂、磷酸二氫鉀和硝酸鈉3個因素為自變量設(shè)計三因素三水平試驗。各取3個水平，以(-1，0，1)編碼，設(shè)計了3因素3水平試驗的響應(yīng)面分析。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取第2 組的添加量作為中心組合設(shè)計試驗的零水平，各因素所代表的參數(shù)、水平如表3所示。

表3 中心組合設(shè)計試驗

1.4 響應(yīng)面模型驗證

根據(jù)Design Expert 10 軟件所給出的各個成分的取值，配制培養(yǎng)基進(jìn)行驗證試驗，做3 次重復(fù)，以檢測培養(yǎng)基成分對S.indica生長速率的影響。將試驗所得實際值與軟件分析所得預(yù)測值進(jìn)行比較，來驗證模型的可靠性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

上述各試驗均做3 次重復(fù)，采用Design Expert 10軟件輔助完成試驗設(shè)計、模型建立和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同培養(yǎng)基對印度梨形孢生長速率的影響 由圖1 可知，將S.indica接種至6 種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其在MMN培養(yǎng)基上生長最快，培養(yǎng)8天后，已接近長滿整個平板；其次是PDA 和PDMA 培養(yǎng)基，培養(yǎng)9天后菌絲體也長滿整個平板；再次是KM 培養(yǎng)基和改良MMN 培養(yǎng)基；在綜合PDA 培養(yǎng)基上生長最慢，生長至8 天時直徑只有4.42 cm。因此，本研究選擇MMN培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)RSM試驗。

2.1.2 溫度、pH 對S.indica生長速率的影響 如圖1 所示，S.indica菌株最適溫度在31℃左右，此時S.indica菌株生長速率最快，在28℃～34℃內(nèi)菌落都能生長，但在22℃和37℃的時候菌落在直徑2.5 cm左右就停止生長。且該菌適合中性環(huán)境生長，其最適pH為6.9左右，此時S.indica菌株生長速率最快，菌落為無色，透明。從圖中可知，pH 6.1～7.3時培養(yǎng)基上的菌落均能生長，但生長速率存在顯著差異。因此，選擇31℃為后續(xù)響應(yīng)面條件；選擇pH 6.9為最佳條件。

圖1 培養(yǎng)基種類、溫度和pH值對印度梨形孢生長速率的影響

2.1.3 不同碳源對S.indica生長速率的影響 如圖2 所示，S.indica在麥芽糖、蔗糖和葡萄糖作為碳源的MMN 培養(yǎng)基上均生長迅速，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速率最快，培養(yǎng)8天后，已長滿整個平板。初期該菌落為白色，近透明，外圍有菌絲蔓延，比無碳培養(yǎng)基顏色較深；而以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長的菌落顏色微黃，較致密，生長速率較好；以秸稈為碳源的培養(yǎng)基上生長的菌落在直徑為4.5 cm 左右停止生長。因此，將蔗糖作為最佳碳源。

2.1.4 不同氮源對S.indica生長速率的影響 如圖2 所示，S.indica能夠利用多種氮源，在尿素、硝酸鈉和酵母浸粉作為氮源的MMN 培養(yǎng)基上均生長迅速，在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上生長速率最快，培養(yǎng)8天后，已長滿整個平板。該菌落無色透明，比其他培養(yǎng)基顏色較淺，在不同供試氮源的培養(yǎng)基上菌落基本都能生長，僅生長速率存在差異，除無氮作對照之外，其他培養(yǎng)基上菌落生長狀況差異不大，可看出S.indica對氮源利用范圍廣泛。因此選擇硝酸鈉為最佳氮源。

2.1.5 不同無機鹽對S.indica生長速率的影響 如圖2

圖2 碳源、氮源和無機鹽對S.indica生長速率的影響

所示，S.indica在以硫酸鎂和磷酸二氫鉀為無機鹽的MMN 培養(yǎng)基中均生長迅速，在以硫酸鎂為供試無機鹽的培養(yǎng)基上生長速率最快，培養(yǎng)8天后，已接近長滿整個平板。初期該菌落為白色，長勢較好。而以氯化鐵為無機鹽的培養(yǎng)基上的菌落在直徑為4.3 cm左右停止生長。因此選擇硫酸鎂為最佳無機鹽。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鈉進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，以接種菌株S.indica的生長速率大小作為響應(yīng)值。試驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 試驗結(jié)果，采用Design Expert 10軟件對結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到等高線和響應(yīng)面圖，如圖3、圖4和圖5所示。

從圖3、圖4和圖5可知，等高線圖均為橢圓形，表示3 個因素兩兩交互作用顯著；曲線圖均呈現(xiàn)凸面且開口向下，響應(yīng)面中心點處于變量范圍內(nèi)，說明S.indica的生長速率在兩因素交互作用中有最大值。

圖3 硫酸鎂和磷酸二氫鉀交互影響S.indica生長速率的曲面圖和等高線圖

圖4 硫酸鎂和硝酸鈉交互影響S.indica生長速率的曲面圖和等高線圖

圖5 磷酸二氫鉀和硝酸鈉交互影響S.indica生長速率的曲面圖和等高線圖

采用Design Expert 10 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)式，得到回歸方程式(1)。

由表5可知，回歸模型值為P＜0.0001，說明該模型極顯著。一次項X1、X2、X3，二次項X12、X22、X32和交互項X1X2呈現(xiàn)為極顯著，X2X3呈現(xiàn)為顯著。其中失擬項P=0.1873＞0.05 不顯著，表明該模型可信度和擬合度較好，相對誤差較小，可以很好的分析數(shù)據(jù)。通過對方程求解，得到S.indica的最佳培養(yǎng)基配方為：MgSO4·7H2O 為0.824 g/L、KH2PO4為1.118 g/L、NaNO3為1.055 g/L。

表5 方差分析表

2.3 試驗結(jié)果驗證

進(jìn)行3 次重復(fù)驗證試驗，檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確性，S.indica的平均生長速率為1.8083 cm/d，與預(yù)測值1.914 cm/d 比較接近，這表明模型之間有較好的擬合性，優(yōu)化模型可行性好。

3 討論

通過研究顯示，應(yīng)用RSM 優(yōu)化培養(yǎng)基多有報道，但利用此方法對S.indica進(jìn)行優(yōu)化研究卻少見報道[26]。2018 年，張玲秀等[3]采用RSM 對S.indica液體發(fā)酵技術(shù)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以生物量為響應(yīng)值，得到最佳pH 6.02、培養(yǎng)溫度為27.55℃，轉(zhuǎn)速178.2 r/min，與本研究通過固體平板培養(yǎng)S.indica所得結(jié)果存在差異。2019年，舒珊等[4]報道在V8培養(yǎng)基中加入蔗糖有助于S.indica的生長，而本研究將蔗糖作為唯一碳源，與其他碳源相比，對S.indica生長的效果更好。此外，目前大多數(shù)S.indica常用的培養(yǎng)基是PDA 培養(yǎng)基，將S.indica菌株接種在PDA平板上，在28℃下14天長滿平板[25]，與本試驗進(jìn)行單因素優(yōu)化時，在相同條件下所得結(jié)果基本一致，而本研究通過RSM優(yōu)化S.indica培養(yǎng)基后，接種的S.indica菌株生長速率提高了近兩倍。

本試驗的局限性在于僅應(yīng)用RSM 對培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機鹽等成分進(jìn)行優(yōu)化，未應(yīng)用RSM 對培養(yǎng)條件如溫度、pH和接種量等進(jìn)行優(yōu)化。后續(xù)可通過進(jìn)一步優(yōu)化溫度和pH，更精確S.indica的培養(yǎng)條件，提高S.indica的生長速率。此外，本試驗的局限性還在于僅通過菌落直徑來反映S.indica的生長速率，不能說明菌落直徑大其生物量和孢子數(shù)也同樣多。后續(xù)可通過液體培養(yǎng)測定S.indica的干重，與菌落直徑共同作為反映S.indica的生長速率大小的指標(biāo)，可靠性更強，更利于生產(chǎn)應(yīng)用。

本研究結(jié)果表明，RSM 可用于作為確定S.indica優(yōu)化培養(yǎng)基配方的方法。應(yīng)用RSM 最后對模型進(jìn)行驗證，試驗所得S.indica的生長速率與預(yù)測值基本一致，說明模型能較好地預(yù)測S.indica生長速率的實際情況，具有較好的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。通過RSM 對S.indica培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)4天后，S.indica已接近長滿平板，實際生長速率可達(dá)到1.8083 cm/d，遠(yuǎn)大于原MMN 培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)的平均生長速率。因此，本研究可為S.indica下一步在田間試驗中大量擴繁提供理論參考。

4 結(jié)論

基于響應(yīng)面Box-Behnken Design中心組合設(shè)計優(yōu)化印度梨形孢(Serendipita indica)培養(yǎng)基，最佳配方為：MgSO4·7H2O為0.824 g/L、KH2PO4為1.118 g/L、NaNO3為1.055 g/L、NaCl 為0.03 g/L、CaCl2為0.05 g/L、蔗糖為10 g/L；最適生長溫度在31℃左右，最適pH在6.9左右；在此條件下，S.indica的平均生長速率最快。本研究利用RSM 篩選得到的最適培養(yǎng)條件，為后續(xù)S.indica液體發(fā)酵條件優(yōu)化以及對其進(jìn)行生物菌劑規(guī)模化生產(chǎn)提供了實驗基礎(chǔ)和理論參考。