★ 李養(yǎng)學(xué) 曾志浩 袁家鑫 李素梅 鐘惠嫻 黃華靖 江潔怡（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510095；.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 51005；.中山大學(xué)新華學(xué)院 廣州 510520）

芪丹滋腎顆粒是廣東省第二中醫(yī)院的驗(yàn)方，對(duì)慢性腎炎有較好的臨床療效。本制劑適用于脾腎兩虛，尤其是氣陰兩虛導(dǎo)致的慢性腎小球腎炎，通過(guò)滋養(yǎng)脾腎、潤(rùn)養(yǎng)脾腎來(lái)治療脾腎兩虛之癥。芪丹滋腎顆粒由黃芪、丹參、大黃炭、墨旱蓮、熟地黃、白術(shù)、赤芍、當(dāng)歸、川芎、牡丹皮和炙甘草共十一味藥組成，諸藥合用，共奏益氣補(bǔ)腎、活血化瘀、利水消腫的功效。方中黃芪為君藥，有文獻(xiàn)報(bào)道黃芪甲苷能鎮(zhèn)痛抗氧化、保護(hù)脾腎，能有效降低血壓［1］，通常作為含黃芪復(fù)方中藥制劑的指標(biāo)成分作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考［2］。丹參、大黃炭、墨旱蓮、熟地黃為臣藥，具有抗炎抑菌等作用［3-6］，佐以白術(shù)、赤芍、當(dāng)歸、川芎和牡丹皮，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎等作用［7-11］，炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥。諸藥合用共奏滋養(yǎng)脾腎、潤(rùn)養(yǎng)脾腎之功。

醫(yī)院制劑由所屬醫(yī)院制備并僅于本院臨床使用，沒(méi)有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而制劑品質(zhì)關(guān)系到患者的生命安全和醫(yī)院的正常運(yùn)營(yíng)［12］，因此建立醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尤為重要。本試驗(yàn)采用TLC法對(duì)方中君藥黃芪，臣藥丹參、大黃炭和墨旱蓮進(jìn)行定性鑒別；HPLC-ELSD法對(duì)方中的黃芪甲苷進(jìn)行定量測(cè)定，建立了芪丹滋腎顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，使其成為安全有效、穩(wěn)定可控的中藥制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 薄層色譜自動(dòng)點(diǎn)樣儀（TLC SAMPLER 4,瑞士），薄層成像系統(tǒng)（REPROSTAR 3,瑞士）；高效液相色譜儀（Agilent 1200,美國(guó)）；超聲波清洗器（KQ5200DE,昆山）；電子分析天平（XS205DU,瑞士）；超純水機(jī)（Milli-Q A10,美國(guó)）。

1.2 試藥 甲醇（MT）、乙酸乙酯（EAC）、正丁醇（NBA）等分析純?cè)噭┵?gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；乙腈（ACN）等色譜純購(gòu)自德國(guó)默克，液相用水為屈臣氏蒸餾水經(jīng)純水機(jī)制得的超純水。

芪丹滋腎顆粒（批號(hào)：20190527、20190528、20190529）來(lái)源于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院；黃芪甲苷對(duì)照品、黃芪、丹參、墨旱蓮、大黃等對(duì)照藥材（批號(hào)分別為：110781-201616、120974-201612、120923-201615、120958-201407、121249-201304）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪的薄層鑒別 取芪丹滋腎顆粒，研細(xì)，取3 g，加入甲醇30 mL后進(jìn)行30 min超聲處理，濾紙濾過(guò)，濾液置水浴鍋蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙猓簝纱斡盟柡驼〈既芤赫駬u提取，30 mL每次，收集正丁醇液，并用現(xiàn)配的氨試液分2次洗滌，30 mL每次，分取正丁醇液，置水浴蒸干，用1 mL甲醇使溶解，制成芪丹滋腎顆粒黃芪供試品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品1 mg，用1 mL甲醇溶解，作為對(duì)照品溶液。取黃芪對(duì)照藥材1 g，加水50 mL，煮沸，文火保持30 min后快速過(guò)濾，濾液自“水液兩次用水飽和正丁醇液振搖提取”起，同法制成黃芪對(duì)照藥材溶液。再取已制備的黃芪陰性樣品，同芪丹滋腎顆粒黃芪供試品溶液制備方法制成缺黃芪的陰性對(duì)照樣品溶液。參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液、黃芪對(duì)照藥材溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照樣品溶液各2μL，用硅膠G薄層板點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為正丁醇（NBA）-乙酸乙酯（EAC）-稀氨水（1→10）（4∶1∶5）10 ℃以下放置的上層溶液，雙槽展開(kāi)缸并用氨蒸汽飽和30 min后展開(kāi)，取出，通風(fēng)廚晾干，用10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色，并用105 ℃加熱至薄層斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。在與黃芪甲苷對(duì)照品及黃芪對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品有清晰的熒光斑點(diǎn)，并且黃芪陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪薄層色譜圖

2.1.2 丹參的薄層鑒別 取芪丹滋腎顆粒，研細(xì)，取3 g，加入甲醇30 mL后進(jìn)行30 min超聲處理，濾紙濾過(guò)，濾液置水浴鍋蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙?，調(diào)節(jié)pH（稀鹽酸）值至2～3，水液再兩次用乙酸乙酯振搖提取，20 mL每次，收集乙酸乙酯液，置水浴蒸干，用1 mL甲醇使溶解，制成芪丹滋腎顆粒丹參供試品溶液。取丹參對(duì)照藥材0.5 g，加水50 mL，煮沸，文火保持30 min后快速過(guò)濾，濾液自“調(diào)節(jié)pH（稀鹽酸）值至2～3”起，同法制成丹參對(duì)照藥材溶液。再取已制備的丹參陰性樣品，同芪丹滋腎顆粒丹參供試品溶液制備方法制成缺丹參的陰性對(duì)照樣品溶液。參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，吸取丹參對(duì)照藥材溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照樣品溶液各5 μL，用硅膠G薄層板點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為丙酮（DMK）-乙酸乙酯（EAC）-甲酸（FA）（2.5∶1∶0.4），雙槽展開(kāi)缸并用氨蒸汽飽和5 min后展開(kāi)，取出，通風(fēng)廚晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。丹參對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品有清晰的熒光斑點(diǎn)，并且丹參陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 丹參薄層色譜圖

2.1.3 墨旱蓮、大黃炭的薄層鑒別 取芪丹滋腎顆粒，研細(xì)，取5 g，加入30 mL甲醇后進(jìn)行30 min超聲處理，濾紙濾過(guò)，濾液置水浴鍋蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙?，水液兩次用乙醚振搖提取，20 mL每次，收集乙醚液，通風(fēng)廚揮干，用1 mL甲醇使溶解，制成芪丹滋腎顆粒墨旱蓮、大黃炭供試品溶液。再取墨旱蓮、大黃對(duì)照藥材各0.5 g，分別煎煮，各加水50 mL，煮沸，文火保持30 min后快速過(guò)濾，濾液自“分兩次用乙醚振搖提取”起，同法分別制成墨旱蓮、大黃對(duì)照藥材溶液。再分別取已制備的墨旱蓮、大黃炭的陰性樣品，同芪丹滋腎顆粒墨旱蓮、大黃碳供試品溶液制備方法分別制成缺墨旱蓮、大黃炭的陰性對(duì)照樣品溶液。參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，吸取墨旱蓮、大黃對(duì)照藥材溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照樣品溶液各10 μL，用硅膠G薄層板點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為石油醚I（PE I）-乙酸乙酯（EAC）-甲酸（FA）（9∶1∶0.1），雙槽展開(kāi)缸展開(kāi)，取出，通風(fēng)廚晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。墨旱蓮、大黃對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品有明顯相對(duì)應(yīng)的黃綠色、橙色熒光斑點(diǎn)，并且墨旱蓮、大黃碳陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

圖3 墨旱蓮薄層色譜圖

2.2 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.2.1 黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品25.50 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.993 48 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。

2.2.2 芪丹滋腎顆粒供試品溶液的制備 將芪丹滋腎顆粒研細(xì)并過(guò)四號(hào)篩，取約4 g，置200 mL具塞錐形瓶中，精密稱定，用單標(biāo)移液管加甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)回?fù)p失的質(zhì)量，搖勻，用定量濾紙過(guò)濾，再用單標(biāo)移液管量取續(xù)濾液50 mL于蒸發(fā)皿，水浴蒸干，用水20 mL少量多次將殘?jiān)芙猓核拇斡盟柡驼〈家赫駬u提取，20 mL每次，收集正丁醇液，用氨試液兩次洗滌，40 mL每次，分取正丁醇液，水浴蒸干，用甲醇少量多次使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，定容，搖勻，即得。

2.2.3 芪丹滋腎顆粒陰性對(duì)照溶液的制備 取已制備的芪丹滋腎顆粒黃芪陰性對(duì)照樣品約4 g，置200 mL具塞錐形瓶中，同芪丹滋腎顆粒供試品溶液的制備方法制得黃芪陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為T(mén)hermo ODS-2 HypersilTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（32∶68）為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；色譜柱溫度25 ℃；氣流1.5 L/min；漂移管溫度45 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.5 陰性干擾試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、黃芪甲苷對(duì)照品溶液（298.044 μg/mL）和缺黃芪陰性對(duì)照溶液三種溶液各20 μL，分別注入色譜儀中。結(jié)果顯示，芪丹滋腎顆粒供試品色譜中與黃芪甲苷對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間均出現(xiàn)色譜峰，而缺黃芪陰性對(duì)照品溶液色譜峰與黃芪甲苷對(duì)照品色譜峰相同保留時(shí)間內(nèi)未顯示色譜峰，結(jié)果表明該色譜條件下測(cè)定黃芪甲苷的含量可靠。見(jiàn)圖4。

圖4 芪丹滋腎顆粒HPLC-ELSD圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取黃芪甲苷貯備溶液1、2、3、4、5、6 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，得到濃度為每1 mL中分別含黃芪甲苷99.348、198.696、298.044、397.392、496.740、596.088 μg的對(duì)照品溶液。分別吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液20 μL，進(jìn)行色譜測(cè)定，并以峰面積對(duì)數(shù)（Y）和進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 1.626 5X+3.809 2（r=0.999 0）；結(jié)果表明黃芪甲苷在1.986 96～11.921 76 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取上述已制備的芪丹滋腎顆粒（批號(hào)：20190527）供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)6次進(jìn)樣并進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得峰面積對(duì)數(shù)RSD為0.63%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試 驗(yàn)取上述已制備的芪丹滋腎顆粒（批號(hào)：20190527）供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定，分別在0、1、2、3、4、5、10、18 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得峰面積對(duì)數(shù)RSD為0.65%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取芪丹滋腎顆粒（批號(hào)：20190527），分別取6份，按照上述供試品溶液制備方法分別制得供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積對(duì)數(shù)RSD為1.04%，表明所建立的含量測(cè)定方法重復(fù)性較好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取上述已計(jì)算含量的芪丹滋腎顆粒9份，每份分別精密加入適量的黃芪甲苷對(duì)照品，按芪丹滋腎顆粒的制備與測(cè)定方法，進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果黃芪甲苷的平均回收率為100.14%。見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=9）

2.2.11 含量測(cè)定 分別取3批芪丹滋腎顆粒（批號(hào)：20190527、20190528、20190529），各平行處理2份，按照芪丹滋腎顆粒供試品溶液制備方法制備，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算得到每批芪丹滋腎顆粒樣品中黃芪甲苷的含量。見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2） mg/袋

3 討論

中藥制劑中的藥味鑒別不同于單味藥材鑒別，不少藥味的成分會(huì)相互影響導(dǎo)致陰性干擾，如處方中的赤芍含有芍藥苷，牡丹皮的有效成分也包括芍藥苷［11］，對(duì)于這種存在相互干擾的藥味，可以采用雙陰性鑒別；且在制備過(guò)程中成分的損失可能導(dǎo)致藥典的薄層鑒別方法在該制劑中未必適用。雖然存在上述問(wèn)題，薄層鑒別依舊是最經(jīng)濟(jì)、快速、便捷的鑒別方法。本試驗(yàn)對(duì)方中各藥味進(jìn)行薄層鑒別方法摸索，建立了方中黃芪、丹參、大黃炭和墨旱蓮4味藥材的薄層鑒別方法并進(jìn)行方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)所建立的方法便捷可行，而其余藥味的鑒別有陰性干擾，故未列入標(biāo)準(zhǔn)。

黃芪含有多種三萜皂苷成分，黃芪甲苷為其中之一。有文獻(xiàn)報(bào)道［13］比色法、熒光法、薄層色譜掃描法和液相色譜法常用于測(cè)定黃芪中黃芪甲苷的含量。在進(jìn)行比色法測(cè)定時(shí)，黃芪甲苷會(huì)受到其他的三萜皂苷的影響，導(dǎo)致測(cè)定誤差較大，不能準(zhǔn)確測(cè)定含量；而使用熒光法進(jìn)行測(cè)定，同樣因?yàn)槿圃碥疹惓煞址倍嗲医Y(jié)構(gòu)類似，分離難度大，易有干擾；薄層色譜掃描法雖然直觀，但是預(yù)處理繁瑣，結(jié)果容易受到外界因素的干擾；而液相色譜法可根據(jù)檢測(cè)器類型分成多種方法，如紫外、質(zhì)譜、蒸發(fā)光散射、電噴霧和脈沖安培等檢測(cè)器。黃芪甲苷的紫外光譜吸收波長(zhǎng)在200 nm左右有最大吸收，但是容易受雜質(zhì)、溶劑和其他三萜皂苷成分干擾，需要進(jìn)行繁雜的預(yù)處理排除干擾，并不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的快捷準(zhǔn)確。本試驗(yàn)采用的HPLC-ELSD法適用于檢測(cè)沒(méi)有紫外末端吸收的成分，靈敏度高、干擾少，符合質(zhì)量控制的要求。

本研究所建立的質(zhì)量控制方法穩(wěn)定、可靠，重現(xiàn)性好，能較好地對(duì)芪丹滋腎顆粒進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，可用于芪丹滋腎顆粒的質(zhì)量控制。