夏雨， 丁海麗， 傅澤鋌

·短篇論著·

大負荷運動后時鐘基因調控骨骼肌線粒體結構功能的作用機制*

夏雨， 丁海麗△， 傅澤鋌

（成都體育學院運動醫(yī)學與健康研究所，四川 成都 610041）

探討大負荷運動后大鼠骨骼肌時鐘基因節(jié)律振蕩變化及其對線粒體結構功能的調控作用。將156只成年SD大鼠隨機分為對照組和運動組，運動組予以一次大負荷運動訓練。每6 h取各組大鼠腓腸肌，使用RT-qPCR檢測各時相時鐘基因的mRNA水平，并用余弦分析軟件CircaCompare（R Packages）獲取擬合余弦曲線參數，分析時鐘基因的mRNA表達節(jié)律性振蕩情況，透射電鏡下觀察每周期始末（ZT0、ZT24、ZT48和ZT72）骨骼肌線粒體的形態(tài)學變化，Western blot檢測Bmal1和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）的蛋白表達，ELISA測定ATP和ADP含量，以及線粒體氧化呼吸鏈酶細胞色素C氧化酶復合物亞單位Ⅱ（subunits Ⅱ of cytochrome C oxidase complex，COX Ⅱ）和COX Ⅳ的活性。運動組Bmal1的mRNA表達在ZT0～ZT24時節(jié)律出現(xiàn)紊亂（>0.05），ZT24～ZT48和ZT48～ZT72時節(jié)律恢復（<0.05）。大負荷運動后運動組線粒體形態(tài)于ZT0出現(xiàn)腫脹、嵴結構損傷等異常，于ZT24和ZT48時有所恢復，ZT72時損傷基本消失。與對照組相比，運動組Bmal1、PGC-1α的蛋白表達于ZT0時顯著升高（<0.05），ATP和ADP含量分別于ZT0時顯著下降和升高（<0.05），COX Ⅱ和COX Ⅳ活性于ZT0時顯著升高和下降（<0.05），在ZT24時二者活性下降至最低（<0.05）。大負荷運動可誘發(fā)骨骼肌時鐘基因的節(jié)律紊亂，可能參與調控了線粒體的結構功能異常。

大負荷運動；時鐘基因；過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α；線粒體；骨骼肌

自2017年美國科學家發(fā)現(xiàn)生物鐘基因及調控機制的過程而榮獲諾貝爾獎之后，有關生物節(jié)律的研究也引起了運動醫(yī)學和運動生理學領域研究人員的廣泛關注。生物鐘是生物體內無形的“鐘表”，可調節(jié)機體行為、生理和生化反應，是生物體內一種普遍存在的分子振蕩器，控制和調節(jié)大量行為和生理現(xiàn)象的生物節(jié)律［1］。哺乳動物的生物鐘包括位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的中樞生物鐘［2］和位于骨骼肌、心、腎等外周組織器官的外周生物鐘［3］。中樞生物鐘可通過神經、體液等方式直接或間接調控外周生物鐘，使外周生物鐘同步，且已有研究發(fā)現(xiàn)，外周生物鐘也可受行為（如進食、運動等）的影響而產生獨立的生物節(jié)律［4］。與運動關系最為密切、研究最為廣泛的是晝夜節(jié)律，其能夠影響運動能力及運動水平的發(fā)揮，而運動作為一種信號輸入也能影響晝夜節(jié)律［5］。骨骼肌作為外周組織，自身也擁有組織特異性節(jié)律表達，其在能量代謝、肌發(fā)生等生理功能中發(fā)揮著重要作用［6］。

生物節(jié)律與能量代謝之間能相互影響。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）是整合外周生物時鐘和能量代謝的重要蛋白分子［7］。線粒體是真核細胞進行生物氧化和能量代謝的主要場所，機體所需絕大部分能量由位于線粒體內膜上的線粒體呼吸鏈提供，被稱之為“細胞動力工廠”。有研究證實線粒體生物活性具有振蕩節(jié)律，核心時鐘基因可調控骨骼肌線粒體形態(tài)、蛋白表達以及蛋白翻譯后修飾過程，從而引起線粒體代謝功能改變［8］。但在運動誘發(fā)的骨骼肌線粒體生理功能異?；虿±磉^程中，的調控機制及作用途徑尚不明確。本研究擬通過在體動物實驗，觀察一次大負荷運動對骨骼肌核心時鐘基因振蕩節(jié)律及線粒體結構功能的影響，并分析二者時相變化關系與特征，以期探究運動后骨骼肌能量代謝變化的生物節(jié)律效應機制。

材料和方法

1　實驗動物

156只健康8周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200～230 g，購自成都達碩生物科技有限公司，許可證號為SCXK（川）2020-030。所有大鼠在成都體育學院SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，自由攝食與飲水。實驗環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度67%～70%，光照與黑暗時間12 h交替，ZT（zeitgeber time）0，即光照起始時間，為早8：00開燈；ZT12，即光照結束時間，為晚20：00熄燈；ZT24則為下一周期的光照起始時間，24 h為一個節(jié)律周期。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只。本實驗大鼠飼養(yǎng)流程及實驗方法均遵循我國現(xiàn)行的涉及實驗動物倫理研究的相關政策法規(guī)，且經成都體育學院倫理委員會批準。

2　主要試劑

RNA Trizol Reagent購自合肥博美生物科技有限公司，異丙醇購自上海生工生物工程技術服務有限公司；PrimeScript RT reagent Kit購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；抗Bmal1抗體購自于Sigma；抗PGC-1α和GAPDH抗體，細胞色素C氧化酶復合物亞單位Ⅱ（subunit Ⅱ of cytochrome C oxidase complex，COX Ⅱ）和COX Ⅳ ELISA檢測試劑盒，HRP標記的兔抗山羊IgG H&L和生物素化山羊抗兔IgG（H+L）均購自Abcam；大鼠三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP） ELISA檢測試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司；動物組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）購自上海雅酶醫(yī)藥生物科技有限公司；Bradford法蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

3　主要方法

3.1實驗分組及運動方案正式實驗前大鼠進行適應性喂養(yǎng)3 d，隨后按隨機數字表法分為對照（control，Con）組和運動（exercise，Exe）組，各組根據運動后不同取材時相（ZT0、ZT6、ZT12、ZT18、ZT24、ZT30、ZT36、ZT42、ZT48、ZT54、ZT60、ZT66和ZT72）分為13個亞組，共26組，每組6只。測定各亞組腓腸肌Bmal1的mRNA表達，每周期始末（ZT0、ZT24、ZT48和ZT72）測定線粒體形態(tài)、Bmal1和PGC-1α的蛋白表達等指標。運動干預前，Exe組大鼠先進行２ d低負荷、短時間適應性跑臺訓練［9］，第3天休息，第4天于光照開始時間ZT0前按照Armstong等［10］的經典離心運動方案進行一次大負荷下坡跑運動，坡度-16°，速度16 m/min，時間90 min，跑完即刻與ZT0時相相同。Con組大鼠正常飼養(yǎng)，不進行運動干預。

3.2動物取材及線粒體提取實驗結束后，兩組大鼠按照對應時相進行取材。先稱重后麻醉，按3.5 mL/kg體重注射10%水合氯醛，斷頸處死，迅速取雙側腓腸肌。隨后用冰冷生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，剔除結締組織，分段備用。其中左側取中段約2 mm×3 mm×3 mm大小的組織存入2.5％戊二醛固定液中，制備電鏡樣品，其余組織用錫箔紙包裹保存于液氮中，后續(xù)移至-80 °C冰箱保存，用于RT-qPCR及Western bolt測定。右側切取100 mg腓腸肌放入離心管內，按照線粒體分離試劑盒說明書差速離心法提取骨骼肌線粒體，隨即加入適量線粒體儲存液，重懸線粒體，先置于液氮速凍后再放入-80 ℃冰箱待測呼吸鏈復合物活性，剩余組織剪碎后勻漿，用于ELISA測定。

3.3Bmal1 mRNA表達的測定采用RT-qPCR檢測Bmal1 mRNA的表達，首先分別提取各亞組總RNA，隨后進行逆轉錄反應，用于測定其表達情況的引物由上海生工生物工程管理技術發(fā)展服務有限公司進行設計合成，并以ULTRAPAGE純化。Bmal1的上游引物序列為5'-TGCCACCAATCCATACAC-3'，下游引物序列為5'-TTCCCTCGGTCACATCCTAC-3'；β-actin的上游引物序列為5'-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3'，下游引物序列為5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。隨后進行實時熒光定量PCR，使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct值，最后通過2-ΔΔCt法計算相對mRNA表達水平。

3.4骨骼肌線粒體形態(tài)學的檢測采用透射電鏡觀察大鼠腓腸肌線粒體形態(tài)，取每周期始末（ZT0、ZT24、ZT48和ZT72）電鏡樣品，經3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，用丙酮逐級脫水，脫水劑濃度梯度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100% 濃度處理換3次），再用環(huán)氧樹脂包埋，采用超薄切片機制備約50 nm厚的超薄切片，用醋酸鈾染色后再用枸櫞酸鉛染色，室溫下染色15～20 min，采用JEM-1400 FLASH透射電鏡觀察腓腸肌線粒體形態(tài)結構。

3.5Western bolt檢測Bmal1和PGC-1α的蛋白表達取適量每周期始末肌肉樣本，經過裂解、低溫離心收集上清液，用Bradford法蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，并進行蛋白變性處理。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）制膠，上樣：40 μg（10 g/L）蛋白；電泳：穩(wěn)定電壓100 V，15 min；轉膜：200 mA轉膜1～2 h；封閉PVDF膜2 h。孵育Ⅰ抗的濃度分別為：Bmal1和PGC-1α，1∶1 000； β-actin，1∶100 000。Ⅱ抗孵育稀釋濃度為1∶5 000。將PVDF膜平鋪到曝光板上，利用ECL發(fā)光液顯影、定影，最后用天能GIS機箱控制軟件2.0對條帶進行曝光掃描，結果以目的蛋白相對表達量表示。

3.6線粒體COX Ⅱ和COX Ⅳ活性的測定采用Abcam ELISA分析試劑盒測定COX Ⅱ和COX Ⅳ的活性，取適量每周期始末肌肉樣本，實驗測定步驟分別按照試劑盒說明書進行。最后按照公式：Rate（/min）=（1-2）/time （min）=（1-2）/Δ，計算出COX Ⅱ和COX Ⅳ活性，單位mOD/min。為排除實驗環(huán)境及操作的誤差對線粒體復合物活性的影響，本實驗采用相對活性表示各組各時相活性值。

3.7ATP和ADP含量的測定應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠ATP和ADP的含量，取適量每周期始末肌肉樣本，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，最后用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值，通過標準曲線計算樣品中指標濃度。

4　統(tǒng)計學處理

數據采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行處理，計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。利用獨立樣本檢驗分析數據，符合正態(tài)分布時，根據方差齊性不同分別選用檢驗（方差齊）或近似檢驗（方差不齊），不符合正態(tài)分布時選用秩和檢驗，以<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

應用余弦分析軟件CircaCompare（R Packages）獲取擬合余弦曲線參數，分析時鐘基因的mRNA表達節(jié)律性，擬合的余弦函數方程為Y=Mesor+Amplitude×cos（TimeRadians-φ），其中Mesor為基線/中值，Amplitude為節(jié)律震蕩的振幅，φ為峰值相位，TimeRadians為時間所對應的弧度值，以<0.05表示具有顯著節(jié)律性。

結果

1　大負荷運動對核心時鐘基因Bmal1 mRNA表達及節(jié)律的影響

1.1大負荷運動對骨骼肌核心時鐘基因mRNA表達的影響RT-qPCR測定Bmal1的mRNA表達結果顯示，與Con組相比，Exe組于大負荷運動后72 h內，其Bmal1的mRNA表達呈先升高后下降的變化趨勢。在ZT0～ZT24期間，Exe組于Bmal1的mRNA水平在ZT0時顯著上調個，明顯高于Con組，并于ZT6、ZT12及ZT18仍保持明顯升高狀態(tài)（<0.05），在ZT24時Exe組Bmal1的mRNA水平較前有所降低，與Con組比較差異無統(tǒng)計學顯著性（>0.05），在隨后兩天內Exe組各時相Bmal1的mRNA水平與Con組相比差異均無統(tǒng)計學顯著性（>0.05），見圖1。

Figure 1.Changes of relative mRNA expression of Bmal1 at different phases after heavy load exercise. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

1.2大負荷運動對核心時鐘基因的mRNA節(jié)律的影響余弦分析軟件分析所得數據結果顯示，ZT0～ZT24期間，Con組Bmal1的mRNA表達水平在ZT0～ZT12時下降，于ZT12開始升高，隨后回升至ZT24完成一個周期節(jié)律振蕩（<0.05），在之后2 d中，其變化趨勢與ZT0～ZT24相似，72 h內共呈現(xiàn)3個完整節(jié)律性周期。ZT0～ZT24期間，Exe組Bmal1的mRNA未呈節(jié)律性表達（>0.05），之后兩天均恢復節(jié)律性（<0.05），見圖2、表1。

Figure 2.Rhythmic changes of fitting cosine function of Bmal1 mRNA expression after heavy load exercise. The samples were collected every 6 h within 72 h. A： ZT0～ZT72； B： ZT0～ZT24； C： ZT24～ZT48； D： ZT48～ZT72. n=6.

表1　R package分析大負荷運動后Bmal1 mRNA表達的晝夜節(jié)律參數值

2　大負荷運動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中骨骼肌線粒體形態(tài)學的影響

透射電鏡結果顯示，Con組大鼠Z線流暢，線粒體均勻分布于Z線兩側，呈長線形或卵圓形，嵴結構清晰；Exe組于ZT0時，Z線不規(guī)整，線粒體分布不均，形狀不規(guī)整，大小不一，開始腫脹，嵴結構不清晰；ZT24時，線粒體形態(tài)有所恢復，消失的嵴結構開始出現(xiàn)；ZT48時，部分線粒體形狀恢復，呈細長桿狀或橢圓形，線粒體損傷減輕；ZT72時，線粒體形態(tài)已基本恢復至正常水平，見圖3。

Figure 3.Morphological observation of skeletal muscle mitochondria by electron microscopy at ZT0，ZT24，ZT48 and ZT72.

3　大負荷運動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中骨骼肌Bmal1和PGC-1α蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與Con組相比，Exe組的Bmal1和PGC-1α蛋白表達在ZT0時顯著升高（<0.05），隨后表達逐漸下降，于ZT24、ZT48、ZT72時與Con組相比差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05），見圖4。

Figure 4.Changes of Bmal1 and PGC-1α protein expression in the skeletal muscle at ZT0，ZT24，ZT48 and ZT72. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

4　大負荷運動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中線粒體COX Ⅱ和COX Ⅳ活性的影響

ELISA結果顯示，Con組COX Ⅱ與COX Ⅳ相對活性值為1.000±0.000，與Con組相比，Exe組COX Ⅱ相對活性值在ZT0時顯著升高（<0.05），在ZT24時最低，較Con組顯著下降（<0.05），在ZT48和ZT72時與Con組比較差異無統(tǒng)計學顯著性（>0.05）。Exe組COX Ⅳ相對活性值在ZT0和ZT24時較Con組顯著降低（<0.05），在ZT48和ZT72時與Con組比較差異無統(tǒng)計學顯著性（>0.05），見圖5。

Figure 5.Changes of mitochondrial COX Ⅱ and COX Ⅳ activity （relative activity） at ZT24，ZT48 and ZT72. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

5　大負荷運動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中骨骼肌ATP和ADP含量的影響

ELISA結果顯示，與Con組相比，Exe組ATP含量于ZT0時顯著下降（<0.05），在ZT24、ZT48及ZT72時與Con組比較差異無統(tǒng)計學顯著性（>0.05）。Exe組ADP含量于ZT0時顯著升高（<0.05），于ZT24、ZT48及ZT72時與Con組比較差異無統(tǒng)計學顯著性（>0.05），見圖6。

Figure 6.The content of ATP and ADP in skeletal muscle at ZT24，ZT48 and ZT72. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

討論

運動作為一種授時因子可與時鐘基因相互調控，研究發(fā)現(xiàn)跨時區(qū)產生的時差變化可影響運動表現(xiàn)能力［11］。在中樞時鐘基因正常的情況下，運動類型、強度、時間以及運動時間段可作為外來輸入信號引起骨骼肌核心時鐘基因發(fā)生相移，導致節(jié)律基因表達紊亂［4，7］。Kemler等［9］證實小鼠在一天中非活動時間運動可引起骨骼肌核心時鐘基因mRNA表達發(fā)生變化。Zambon等［12］通過人體實驗發(fā)現(xiàn)，受試者下肢經過一次30～45 min的大負荷抗阻運動之后（包括向心運動和離心運動），結果顯示運動后6 h和18 h股外側肌Bmal1的mRNA表達顯著上調，且晝夜節(jié)律發(fā)生相移。另有報道提出骨骼肌為運動時機體主要的能量代謝器官，很多參與調控能量代謝的基因具有晝夜節(jié)律特點，同時能量代謝與時鐘基因能相互影響，從而引起骨骼肌時鐘基因發(fā)生節(jié)律紊亂及表達改變［13］。實驗結果顯示，Con組大鼠骨骼肌核心時鐘基因mRNA呈晝夜節(jié)律表達，此結果與國外文獻報道相符［14］。Exe組Bmal1的mRNA表達于ZT0、ZT6和ZT18時顯著上升，運動后的第１天（ZT0～ZT24）失去振蕩節(jié)律，第２天（ZT24～ZT48）和第３天（ZT48～ZT72）基本恢復振蕩節(jié)律，每周期始末Bmal1的蛋白表達于ZT0時顯著升高，隨后下降恢復至正常水平，與其基因表達趨勢相吻合。該結果變化與上述報道相符，提示一次大負荷急性運動可影響核心時鐘基因的mRNA、蛋白表達及振蕩節(jié)律，但其具體作用機制仍需進一步探索。

線粒體是機體進行能量代謝的主要場所，為細胞的生命活動提供能量，其結構及功能狀態(tài)決定了能量供應效率。線粒體結構變化主要是由于其分裂、融合以及自噬而引起的形態(tài)和大小的改變，位于線粒體內膜上的線粒體呼吸鏈提供了細胞生存所需絕大部分能量，其活性及ATP和ADP含量是反映線粒體氧化合成功能的重要指標。線粒體結構功能由多種功能蛋白調控，近年來PGC-1α被認為是一種調節(jié)能量代謝的轉錄共激活因子，為線粒體質量控制體系最主要的調控者，在調節(jié)線粒體功能、氧化應激和多種組織代謝途徑等方面發(fā)揮著重要作用，且受時鐘基因調控呈節(jié)律性表達［15］，也是整合生物鐘和能量代謝晝夜節(jié)律振蕩器的關鍵組成部分［16］。

在以上透射電鏡觀察腓腸肌線粒體超微結構的結果中，Exe組在ZT0時Z線不規(guī)整，線粒體出現(xiàn)分布不均，大小不一，空泡樣改變，腫脹及嵴結構消失，ZT24時開始恢復，嵴結構重新出現(xiàn)，ZT48時線粒體損傷減輕，形態(tài)有所恢復，ZT72時形態(tài)基本恢復。有實驗證明非習慣的大負荷運動，尤其是離心運動可引起骨骼肌線粒體超微結構變化［17］。本研究Exe組進行的運動干預為一次大負荷下坡跑運動，腓腸肌做離心收縮，因此可引起骨骼肌線粒體超微結構改變。此外，時鐘基因對線粒體結構維持具有重要作用，當晝夜節(jié)律紊亂時，骨骼肌可發(fā)生線粒體體積和氧化呼吸減少、纖維型移位、肌節(jié)結構改變和肌肉功能受損［18］。且有研究證實-/-小鼠的腓腸肌線粒體可出現(xiàn)體積減小或缺失、腫脹、嵴破裂等形態(tài)學改變，同時PGC-1α表達顯著下降、節(jié)律性顯著改變［8］。大負荷運動后結果顯示Exe組Bmal1和PGC-1α蛋白表達于ZT0時明顯升高，72 h內線粒體形態(tài)結構變化與Bmal1振蕩節(jié)律及每周期始末Bmal1和PGC-1α蛋白表達趨勢相符，提示大負荷運動后核心時鐘基因可能通過調控PGC-1α蛋白表達從而影響骨骼肌線粒體結構。

COX Ⅱ和COX Ⅳ是反映線粒體功能的標志性酶，其活性增強，呼吸鏈傳遞電子的效率提高，組織的氧利用能力隨之增強，有利于組織有氧代謝，標志著細胞內能量即ATP合成增多。本實驗中COX Ⅱ的活性于ZT0時升高，ZT24時下降至最低，COX Ⅳ活性于ZT0和ZT24時顯著下降。ATP和ADP含量分別于ZT0時顯著下降和升高，隨后恢復至正常。COX Ⅱ的活性變化與Tonkonogi等［19］研究結果相似。受試者在進行急性高強度運動之后，股外側肌線粒體產生ATP的能力下降并未即刻出現(xiàn)在運動后，而在恢復期才開始。有學者認為大強度跑臺運動后即刻COX Ⅱ活性顯著升高，可能與長時間運動對能量供應的需求增加，中間代謝產物增多，使以琥珀酸為底物的COX Ⅱ的活性升高，是一種代償性變化［20］。COX Ⅳ活性變化與王瑩［21］的研究結果相符，一次力竭運動可導致骨骼肌線粒體COX Ⅳ活性顯著下降。ATP和ADP含量變化結果與丁巖等［22］的報道相一致，本研究采用的運動方案為急性高強度運動，骨骼肌劇烈收縮可導致細胞內的ATP和ADP水平分別下降和升高。

上述一次大負荷運動后骨骼肌線粒體氧化合成功能變化同樣也與基因振蕩節(jié)律及Bmal1和PGC-1α蛋白表達趨勢相吻合。Popov等［23］檢測受試者大強度自行車運動后各時相股外側肌時鐘基因和基因表達，發(fā)現(xiàn)均顯著上調，并提出高強度運動后基因表達變化可能是受到晝夜節(jié)律調控的。PGC-1α是調控線粒體功能的關鍵因子，在骨骼肌、肝臟及心臟等高能量需求組織中表達會明顯增強，能促進呼吸鏈復合物的表達［24］。因此可推測骨骼肌核心時鐘基因可通過調控PGC-1α表達從而參與大負荷運動后線粒體氧化合成功能的發(fā)展與轉歸。

綜上所述，大鼠骨骼肌核心時鐘基因呈晝夜節(jié)律振蕩趨勢，一次大負荷運動可誘發(fā)該基因節(jié)律紊亂，其時相變化與骨骼肌線粒體形態(tài)及呼吸鏈氧化合成功能病理變化相一致，推測核心時鐘基因可調控PGC-1α從而影響線粒體結構和功能，但關于基因是通過何種途徑來調控PGC-1α的，其分子機制仍有待進一步的研究驗證。

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Effects of clock geneon the the structure and function of skeletal muscle mitochondria after heavy load exercise

XIA Yu，DING Hai-li△，F(xiàn)U Ze-ting

（，，610041，）

To investigate the effection of skeletal muscle clock geneon mitochondrial structure and function after heavy load exercise in rats.156 adult SD rats were randomly divided into control group and exercise group. The gastrocnemius muscle of each group were isolated in every 6 h，and the Bmal1 mRNA levels were detected by RT-qPCR. The parameters of fitting cosine curve were obtained by using the cosine analysis software CircaCompare （R Packages），and the rhythmic oscillation of clock genemRNA expression was analyzed. Morphological changes of skeletal muscle mitochondria at zeitgeber time（ZT） 0，ZT24，ZT48 and ZT72 were observed by transmission electron microscopy. Protein levels of Bmal1 and peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α （PGC-1α） were detected by Western bolt，contents of ATP and ADP and the activity of enzymes involved in the mitochondrial respiratory chain such as subunit Ⅱ of cytochrome C oxidase complex （COX Ⅱ） and COX Ⅳ were determined by ELISA.（1） The expression of Bmal1 mRNA was disturbed in ZT0～ZT24 （>0.05），and recovered in ZT24～ZT48 and ZT48～ZT72 （<0.05）. （2） After heavy load exercise，the morphology of mitochondria in exercise group showed swelling，crest damage at ZT0～ ZT24，recovered at ZT24～ ZT48 and ZT48～ ZT72. （3） Compared with control group，the protein levels of Bmal1 and PGC-1α in exercise group were significantly increased at ZT0 （<0.05）. （4） Decreased ATP and increased ADP in exercise group were observed at ZT0 （<0.05），the stimulated COXⅡ and decreased COXⅣ were measured at ZT0，and both decreased to the lowest at ZT24 （<0.05）.Heavy load exercise induce the rhythm disorder of skeletal muscle clock gene，which may be linked to the abnormal mitochondrial structure and function.

Heavy load exercise； Clock gene； PGC-1α； Mitochondria； Skeletal muscle

R318； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.017

1000-4718（2022）02-0325-08

2021-10-12

2021-11-26

［基金項目］國家重點研發(fā)計劃（No. 2018YFF0300604）；國家自然科學基金資助項目（No. 81904318）；運動醫(yī)學四川省重點實驗室暨國家體育總局運動醫(yī)學重點實驗室資助項目（No. 2021-A021）

Tel： 028-85051087； E-mail： dinghaili@cdsu.edu.cn

（責任編輯：宋延君，余小慧）