李浩田， 李夢麗， 張臣， 張春禮

基于AMPK/mTOR信號通路介導的自噬途徑研究黃芪多糖對急性放射性腸炎大鼠腸黏膜的保護作用*

李浩田1， 李夢麗1， 張臣1， 張春禮2△

（1鄭州市第九人民醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450053；2鄭州人民醫(yī)院普外二科，河南 鄭州 450053）

探究基于AMP活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路介導的自噬途徑研究黃芪多糖（APS）對急性放射性腸炎大鼠腸黏膜的保護作用。對SD大鼠進行12 Gy單次照射，制備急性放射性腸炎模型，隨機分為模型組、APS（2 g/kg）組、AMPK抑制劑compound C（CC，0.2 mg/kg）組和APS（2 g/kg）+CC（0.2 mg/kg）組，每組12只；另取12只大鼠不做處理，設為對照組。以藥物分組干預處理后，檢測大鼠一般情況，做臨床癥狀評分；HE染色觀察大鼠腸黏膜病理形態(tài)；試劑盒檢測大鼠血清白細胞介素17（IL-17）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、腸型脂肪酸結合蛋白（I-FABP）、細胞間黏附分子1（ICAM-1）和二胺氧化酶（DAO）水平；Western blot法檢測大鼠腸黏膜組織自噬相關蛋白（beclin-1和LC3-II/LC3-I）及AMPK/mTOR通路相關蛋白（p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR）水平。與對照組相比，模型組大鼠腸黏膜組織出現(xiàn)嚴重病理損傷，腸黏膜組織beclin-1、LC3-II/LC3-I和p-AMPK/AMPK水平顯著降低（<0.05），臨床癥狀評分，血清IL-17、IL-1β、TNF-α、I-FABP、ICAM-1和DAO水平，以及腸黏膜組織p-mTOR/mTOR水平顯著升高（<0.05）；分別與模型組和APS+CC組比較，APS組大鼠腸黏膜組織病理損傷減輕，腸黏膜組織beclin-1、LC3-II/LC3-I和p-AMPK/AMPK水平顯著升高（<0.05），臨床癥狀評分，血清IL-17、IL-1β、TNF-α、I-FABP和DAO水平，以及腸黏膜組織p-mTOR/mTOR水平顯著降低（<0.05）；CC組大鼠腸黏膜組織病理損傷加重，各項指標趨勢與APS組相反（<0.05）。APS可通過激活AMPK/mTOR信號通路增強自噬，減輕急性放射性腸炎大鼠腸黏膜炎癥損傷，保護腸道功能。

黃芪多糖；急性放射性腸炎；自噬；AMPK/mTOR信號通路

放射性腸炎是對腹膜、盆腔和腹腔部位惡性腫瘤進行放療引發(fā)的消化道并發(fā)癥，可引起直腸、結腸和小腸黏膜損傷，導致腹瀉、膿血或膿液便、腹痛等臨床癥狀，病變嚴重時可造成腸梗阻及腸壞死，威脅患者生命安全［1-2］。射線照射可誘導炎癥因子過量表達并釋放，引發(fā)強烈炎癥反應，損害腸黏膜功能；自噬作為清除降解細胞受損結構的生理過程，在放射性腸炎病情進展過程中起到關鍵作用，激活自噬可抑制氧化應激和炎癥反應，減輕輻射所致腸黏膜損傷［3-4］。黃芪多糖（polysaccharide，APS）具有抗炎、抗輻射和抗氧化等藥理作用，可減輕潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜炎癥損傷，促進組織修復，還可通過增強自噬活性而抑制轉基因小鼠神經元凋亡，因而推測APS有望成為放射性腸炎的潛在治療藥物［5-6］。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是調控自噬作用的重要信號通路，介導燒傷、中暑和化學藥物等各種致病因素引發(fā)的腸道損傷過程，激活AMPK/mTOR信號通路可增強AMPK磷酸化，減輕mTOR磷酸化，促進自噬，抑制炎癥及腸道細胞凋亡，減輕腸道損傷［7-9］。因此，AMPK/mTOR信號通路可作為防治放射性腸炎的重要作用靶點。本文通過構建急性放射性腸炎大鼠模型，探討APS通過AMPK/mTOR信號通路介導的自噬途徑對受損腸黏膜的保護作用。

材料和方法

1　材料

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體重190～210 g，購自武漢云克隆動物有限公司，許可證號為SCXK（鄂）2018-0021。大鼠分籠飼養(yǎng)在溫度約25 ℃、濕度約55%的動物房中，保持室內環(huán)境安靜、通風良好。

1.2試劑與儀器APS（純度≥90%）購自上海吉至生化科技有限公司；AMPK抑制劑compound C （CC）購自MedChemExpress；腸型脂肪酸結合蛋白（instestinal fatty acid-binding protein，I-FABP）試劑盒、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）測試盒、細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）測試盒、白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）測試盒、IL-1β測試盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）測試盒和高強度RIPA裂解液購自南京建成生物工程研究所；兔源抗AMPK抗體、兔源抗β-actin抗體、兔源抗LC3抗體、兔源抗p-AMPK抗體、BCA蛋白檢測試劑盒、HE染色試劑盒、兔源抗beclin-1抗體、羊抗兔Ⅱ抗、兔源抗p-mTOR抗體和兔源抗mTOR抗體購自Abcam。

Synergy?Platform直線加速器購自Elekta；BioTek μQuant?酶標儀購自上海坤肯生物化工有限公司；RM2235型輪轉切片機和DM4000 B LED顯微鏡系統(tǒng)購自Leica；Tissue-Tek VIP?6 AI全封閉組織脫水機購自Sakura Finetek；Y6-6LF型生物組織包埋機購自湖北亞光易用電子技術有限公司；1659001型蛋白電泳儀和Trans-Blot SD半干轉膜儀購自Bio-Rad；GIS-500型凝膠成像儀購自杭州米歐儀器有限公司。

2　方法

2.1大鼠放射性腸炎模型制備及分組給藥參照文獻［10］中大鼠禁食禁水8 h，以乙醚氣體麻醉后仰臥固定，使用直線加速器單次照射其胸骨劍突至肛門外緣，照射源距皮膚100 cm，照射劑量12 Gy，然后觀察大鼠，若在1 d內出現(xiàn)腹瀉、黏液便和血便等癥狀，提示模型構建成功，將其隨機分成5組：模型組、APS（2 g/kg）組、CC（0.2 mg/kg）組和APS（2 g/kg）+CC（0.2 mg/kg）組，每組12只。另取12只大鼠不做處理，設為對照組。

將APS和CC加入生理鹽水中，溶解混勻，分別配制成濃度為0.2 g/mL的APS［11］藥液和0.02 mg/mL的CC［12］藥液。APS+CC組大鼠灌胃10 mL/kg的APS藥液，同時尾靜脈注射10 mL/kg的CC藥液；APS組大鼠灌胃10 mL/kg的APS藥液，同時尾靜脈注射10 mL/kg的生理鹽水；CC組大鼠灌胃10 mL/kg的生理鹽水，同時尾靜脈注射10 mL/kg的CC藥液；模型組和對照組大鼠灌胃10 mL/kg的生理鹽水，同時尾靜脈注射10 mL/kg的生理鹽水。連續(xù)給藥7 d。

2.2評測大鼠一般情況及標本采集藥物治療結束后24 h，觀察大鼠一般情況，并根據(jù)以下征象標準進行臨床癥狀評分：大鼠皮毛光潔，活動自如，飲食、飲水正常，肛周皮毛無損，大便成形，評為1分；大鼠皮毛光潔度差，喜靜，飲食、飲水稍減少，肛周皮膚脫毛潮紅（直徑<0.5 cm），大便不成形，呈黏液狀，評2分；大鼠皮毛欠光潔，蜷縮少動，飲食、飲水明顯減少，肛周皮膚脫毛潮紅（直徑0.5～1 cm），腹瀉，大便呈黏液狀、含有血液，評3分；大鼠皮毛不光潔，蜷縮少動并有弓背扭體現(xiàn)象，拒食、拒水，肛周皮膚脫毛潮紅（直徑>1 cm），腹瀉、肛門出血、水樣便，評4分。以乙醚氣體麻醉大鼠后，使用注射器自頸動脈刺入，采集血液1.5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，將上清液吸出，分組標記后保存在-80 ℃；頸椎脫臼處死大鼠，開腹，取出結直腸，分離腸黏膜組織，剪下0.8 g，剪碎后置于高強度RIPA裂解液，制備成勻漿液后于4 ℃、3 000 r/min離心20 min，采用試劑盒通過BCA法測定總蛋白濃度（具體步驟參照說明書），將各組調至相等，分組標記后保存在-80 ℃；剩余腸黏膜組織以全封閉組織脫水機脫水后置于二甲苯中透明，經生物組織包埋機包埋后置于輪轉切片機中，進行常規(guī)病理切片備用。

2.3HE染色檢測大鼠腸黏膜病理形態(tài)取出2.2中的腸黏膜組織切片，脫蠟后水化，采用試劑盒做HE染色（具體步驟參照說明書），然后在顯微鏡下觀察大鼠腸黏膜病理形態(tài)，并任意采集5個視野圖像。

2.4大鼠血清IL-17、IL-1β、TNF-α、I-FABP、ICAM-1和DAO水平測定取出2.2中頸動脈血清，于4 ℃冰箱中靜置解凍，采用試劑盒并嚴格按照說明書的操作步驟測定其中IL-17、IL-1β、TNF-α、I-FABP、ICAM-1和DAO水平。

2.5大鼠腸黏膜組織自噬相關蛋白及AMPK/mTOR通路相關蛋白表達的檢測取出2.2中腸黏膜組織蛋白樣品液，于4 ℃冰箱中靜置解凍，每組取20 μL分別加入SDS-PAGE濃縮膠的上樣孔中，于120 V恒壓下電泳70 min，取出分離膠，通過濕轉（40 mA，75 min）將膠中蛋白轉移至PVDF膜上，將膜浸沒入5%的脫脂奶粉溶液中，于室溫下封閉2 h，取出膜，以薄刀片裁下目的蛋白，以兔源β-actin、beclin-1、LC3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR和mTOR I抗孵育（4 ℃，11 h），洗膜（TBST，室溫，3次，每次5 min），羊抗兔II抗孵育（室溫，1.5 h ），洗膜（TBST，室溫，3次，每次5 min），化學發(fā)光法顯色后拍照，以ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，使用β-actin做內參照，進行統(tǒng)計后得出各組蛋白的相對表達量。

3　統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，并輸入SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　對照組和模型組大鼠一般情況

對照組大鼠活動自如，飲食、飲水正常，肛周皮毛無損，大便成形，體重正常上升；模型組大鼠喜靜，飲食、飲水減少，出現(xiàn)腹瀉、黏液便、血便，肛門發(fā)紅，體重逐漸下降，見圖1。

Figure 1.General situation of control rats and model rats.

2　各組大鼠臨床癥狀評分結果

與對照組（1.00±0.00）相比，模型組大鼠臨床癥狀評分（2.97±0.38）顯著升高（<0.05）；分別與模型組和APS+CC組（2.92±0.43）比較，APS組大鼠臨床癥狀評分（1.21±0.39）顯著降低（<0.05），CC組大鼠臨床癥狀評分（3.76±0.20）顯著升高（<0.05）。

3　各組大鼠腸黏膜病理形態(tài)檢測結果

對照組大鼠腸黏膜病理形態(tài)完好，無損傷；模型組大鼠腸黏膜組織出現(xiàn)嚴重病理損傷，具體表現(xiàn)為腸道組織糜爛，上皮細胞壞死、丟失，絨毛稀疏且高度降低，腺體變形萎縮，黏膜下層充血、水腫并有大量炎癥細胞浸潤，出現(xiàn)空泡樣改變；分別與模型組和APS+CC組比較，APS組大鼠腸黏膜組織病理損傷明顯減輕，CC組大鼠腸黏膜組織病理損傷明顯加重，見圖2。

Figure 2.Pathomorphological changes of intestinal mucosa of rats in each group （HE staining，scale bar=50 μm）. The red arrow indicated the lesion site. APS： Astragalus polysaccharide； CC： compound C.

4　各組大鼠血清炎癥因子檢測結果

與對照組相比，模型組大鼠血清炎癥因子IL-17、IL-1β及TNF-α水平顯著升高（<0.05）；分別與模型組和APS+CC組比較，APS組大鼠血清炎癥因子IL-17、IL-1β及TNF-α水平均顯著降低（<0.05），CC組大鼠血清炎癥因子IL-17、IL-1β及TNF-α水平均顯著升高（<0.05），見表1。

表1　各組大鼠血清炎癥因子IL-17、IL-1β及TNF-α水平

APS：polysaccharide； CC： compound C.*<0.05control group；#<0.05model group；△<0.05APS+CC group.

5　各組大鼠血清I-FABP、ICAM-1和DAO水平檢測結果

與對照組相比，模型組大鼠血清I-FABP、ICAM-1和DAO水平顯著升高（<0.05）；分別與模型組和APS+CC組比較，APS組大鼠血清I-FABP和DAO水平均顯著降低（<0.05），血清ICAM-1水平差異無統(tǒng)計學意義（>0.05），CC組大鼠血清I-FABP、ICAM-1和DAO水平均顯著升高（<0.05），見表2。

表2.各組大鼠血清I-FABP、ICAM-1與DAO水平

Table 2.Serum I-FABP，ICAM-1 and DAO levels of rats in each group （Mean±SD. n=12）

APS：polysaccharide； CC： compound C.*<0.05control group；#<0.05model group；△<0.05APS+CC group.

6　各組大鼠腸黏膜組織自噬相關蛋白檢測結果

與對照組相比，模型組大鼠腸黏膜組織自噬相關蛋白beclin-1和LC3-II/LC3-I水平顯著降低（<0.05）；分別與模型組和APS+CC組比較，APS組大鼠腸黏膜組織beclin-1和LC3-II/LC3-I水平均顯著升高（<0.05），CC組大鼠腸黏膜組織beclin-1和LC3-II/LC3-I水平均顯著降低（<0.05），見圖3。

Figure 3.Western blot was used to detect the expression of autophagy-related proteins in intestinal mucosa of rats in each group. APS： Astragalus polysaccharide； CC： compound C. Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs APS+CC group.

7　各組大鼠腸黏膜組織AMPK/mTOR通路相關蛋白檢測結果

與對照相比，模型組大鼠腸黏膜組織p-AMPK/AMPK水平顯著降低（<0.05），p-mTOR/mTOR水平顯著升高（<0.05）；分別與模型組和APS+CC組比較，APS組大鼠腸黏膜組織p-AMPK/AMPK水平顯著升高（<0.05），p-mTOR/mTOR水平顯著降低（<0.05），CC組大鼠腸黏膜組織p-AMPK/AMPK水平顯著降低（<0.05），p-mTOR/mTOR水平顯著升高（<0.05），見圖4。

Figure 4.Western blot was used to detect the levels of AMPK/mTOR signaling pathway-related proteins in intestinal mucosa of rats in each group. APS： Astragalus polysaccharide； CC： compound C. Mean±SD. n=12. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs APS+CC group.

討論

近年來，隨著盆腹腔腫瘤患者增多及放療在腫瘤治療中的廣泛應用，放射性腸炎的發(fā)病率有所增加，臨床上主要采用美沙拉嗪、皮質類固醇、硫糖鋁等西藥及高壓氧艙、營養(yǎng)支持等方法治療，但療效并不理想，對患者腫瘤的治療及生活質量的改善造成了較大的負面影響，因而探尋有效的中醫(yī)藥防治策略具有重大的臨床意義［3，13］。APS作為中藥黃芪的主要起效成分，具有明顯的增強自噬、抗輻射、抗炎的生物活性。因此本研究使用APS治療急性放射性腸炎大鼠，并探討其中作用機制。

本文以12 Gy劑量的射線對SD大鼠單次照射，制備急性放射性腸炎模型，結果顯示，造模大鼠腸道組織糜爛，上皮細胞壞死、丟失，絨毛稀疏且高度降低，腺體變形萎縮，黏膜下層充血、水腫并有大量炎癥細胞浸潤，出現(xiàn)空泡樣改變等嚴重病理損傷，臨床癥狀評分及血清IL-17、IL-1β、TNF-α、I-FABP、ICAM-1和DAO水平顯著升高，表明射線照射可誘導炎癥細胞因子大量產生，引發(fā)嚴重的炎癥反應，損傷腸黏膜組織，并使大鼠產生腹瀉、黏液便、血便等癥狀，提示模型制備成功。

炎癥反應是造成放射性腸炎患者腸黏膜損傷的主要病理機制，自噬在其中起到重要調控作用，增強自噬活性，可抑制活性氧產生，減輕炎癥和腸道細胞凋亡，改善放射性腸炎癥狀［14-15］。APS可顯著減輕潰瘍性結腸炎大鼠腸道炎癥反應，抑制腸細胞凋亡，改善腸黏膜屏障功能，還可促進轉基因小鼠神經細胞自噬，進而緩解腦組織炎癥損傷［6，16-17］，因而推測APS可能通過促進自噬，抑制炎癥來防治放射性腸炎，本文結果顯示，以APS處理急性放射性腸炎大鼠，可減輕腸黏膜組織病理損傷，升高腸黏膜組織beclin-1和LC3-II/LC3-I蛋白水平，降低臨床癥狀評分及血清IL-17、IL-1β和TNF-α水平，表明APS可減少炎癥因子生成，增強自噬，抑制炎癥反應，減輕腸黏膜組織病理損傷，改善大鼠腹瀉、黏液便、血便等腸炎癥狀；APS對血清ICAM-1水平無顯著影響，但可顯著降低血清I-FABP和DAO水平，ICAM-1是介導內皮細胞損傷的重要因子［18］，I-FABP和DAO是反應腸黏膜損傷的標志物，提示APS可能對腸粘膜損傷的修復具有針對性。

AMPK/mTOR是重要的自噬調控信號，在各種腸道炎癥損傷性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用，激活AMPK信號，可抑制mTOR的磷酸化，增強自噬活性，減輕腸道黏膜損傷，改善腸炎癥狀，表明AMPK/mTOR通路是腸炎的一個重要治療靶點［19-20］。本文結果顯示，放射性腸炎大鼠腸黏膜組織beclin-1、LC3-II/LC3-I和p-AMPK/AMPK水平顯著降低，腸黏膜組織p-mTOR/mTOR水平顯著升高，經APS處理后，上述蛋白表達異常改變得到恢復，表明AMPK/mTOR通過自噬途徑介導放射性腸炎的發(fā)病過程。APS可激活AMPK/mTOR信號，減輕腸黏膜損傷，以AMPK抑制劑CC處理急性放射性腸炎大鼠，可抑制自噬，加重腸黏膜組織炎癥損傷，減弱APS對腸黏膜損傷的抑制作用，逆轉APS對放射性腸炎的治療作用，提示APS是通過激活AMPK/mTOR通路，促進自噬而減輕急性放射性腸炎大鼠腸黏膜炎癥損傷的。

綜上所述，APS可促進AMPK磷酸化，減少mTOR磷酸化，進而促進自噬作用，抑制炎癥反應發(fā)生發(fā)展，緩解急性放射性腸炎大鼠腸黏膜損傷，激活AMPK/mTOR通路是其作用機制之一。本文為急性放射性腸炎的防治提供了新的思路和實驗參考。

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polysaccharide protects against intestinal mucosal injury in rats with acute radiation enteritis through AMPK/mTOR-mediated autophagy pathway

LI Hao-tian1，LI Meng-li1，ZHANG Chen1，ZHANG Chun-li2△

（1，，450053，；2，，450053，）

To explore the the protective effect ofpolysaccharide （APS） on intestinal mucosa in rats with acute radiation enteritis through AMP-activated protein kinase （AMPK）/mammalian target of rapamycin （mTOR）-mediated autophagy pathway.Forty-eight SD rats were irradiated at a single dose of 12 Gy to prepare an acute radiation enteritis model，and were randomly divided into model group，APS （2 g/kg） group，AMPK inhibitor compund C （CC，0.2 mg/kg） group and APS （2 g/kg）+CC （0.2 mg/kg） group，with 12 rats in each group. Another 12 rats without treatment served as control group. The general condition of the rats was checked，and the clinical symptoms were scored after treatment. HE staining was used to detect the pathomorphological changes of rat intestinal mucosa. Kits were used to detect the serum levels of interleukin-17 （IL-17），IL-1β，tumor necrosis factor-α （TNF-α），intestinal fatty acid-binding protein （I-FABP），intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1） and diamine oxidase （DAO）. Western blot was used to detect the levels of autophagy-related proteins （beclin-1 and LC3-II/LC3-I） and AMPK/mTOR pathway-related proteins （p-AMPK/AMPK and p-mTOR/mTOR） in rat intestinal mucosal tissue.Compared with control group，the intestinal mucosal tissue in model group showed severe pathological damage，the levels of beclin-1，LC3-II/LC3-I and p-AMPK/AMPK in the intestinal mucosal tissue were significantly decreased （<0.05），and the clinical symptom score，serum IL-17，IL-1β，TNF-α，I-FABP，ICAM-1 and DAO levels，and intestinal mucosal tissue p-mTOR/mTOR level were significantly increased （<0.05）. Compared with model group and APS+CC group，the pathological damage of the intestinal mucosa in APS group was reduced，the levels of beclin-1，LC3-II/LC3-I and p-AMPK/AMPK in the intestinal mucosal tissue were increased （<0.05），and the clinical symptom score，serum IL-17，IL-1β，TNF-α，I-FABP and DAO levels，and intestinal mucosal tissue p-mTOR/mTOR level were decreased （<0.05）. The pathological damage of the intestinal mucosa in CC group was aggravated，and the trends of various indexes were opposite to those in APS group （<0.05）.polysaccharide enhances the autophagy by activating AMPK/mTOR signaling pathway，reduces the inflammatory injury of intestinal mucosa in rats with acute radiation enteritis，and protect the intestinal function.

polysaccharide； Acute radiation enteritis； Autophagy； AMPK/mTOR signaling pathway

R818.023； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.015

1000-4718（2022）02-0311-07

2021-09-27

2021-12-07

［基金項目］2019年度河南省醫(yī)學科技攻關計劃（聯(lián)合共建）項目（No. LHGJ20191072）

Tel： 13643848818； E-mail： justzhang@126.com

（責任編輯：盧萍，羅森）