蘇榮欣 ，王潔櫻 ，黃仁亮，崔 美 ，齊 崴 ，何志敏

(1. 天津大學化工學院，天津 300350；2. 化學工程聯(lián)合國家重點實驗室(天津大學)，天津 300350；3. 天津大學海洋科學與技術學院，天津 300072)

納米纖維素(nanocellulose，NC)是一類至少有一個維度在納米尺度的纖維素材料的統(tǒng)稱[1]，具有無毒、低成本、低密度、高強度以及高模量等優(yōu)點[2-3]，已應用于藥物靶向遞送[4]、生物負載[5]、3D打印[6]、酶固定化[7]、水處理、重金屬離子吸附及環(huán)境治理等諸多領域[8]，受到各國科研工作者廣泛關注．例如，Lassoued等[9]在純水介質(zhì)中用甲基丙烯酸縮水甘油酯對纖維素納米纖維進行化學改性，合成了透明、可生物降解且具有很強機械性能的薄膜，可作為防彈玻璃的夾層使用．納米纖維素的制備方法主要有酸水解法、氧化法、離子液體法、機械法和酶解法等．例如，Zhang等[10]以竹子為原料，經(jīng)甲酸預處理(85%甲酸，145℃，45min)后通過TEMPO氧化制得長度80～300nm、直徑5～9nm纖維素納米晶；Liu等[11]以小麥秸稈為原料，組合采用蒸汽爆破、微波輔助堿水解和微射流法制備了直徑為10～40nm的纖維素納米纖維．

球形納米纖維素(spherical nanocellulose，SNC)是幾何形狀為球形的纖維素納米晶，具有高熱穩(wěn)定性、生物降解性、生物相容性等優(yōu)點[12]．例如，Meyabadi等[13]對棉花纖維進行酶水解和超聲處理，制備了平均粒度小于100nm的球形納米纖維素，有望應用于晶體管和電池中．Hakkak等[14]采用離子液體法，以微晶纖維素和1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽(EMIMAc)為主要試劑，制備了大小為100～400nm的SNC．Li等[15]以微晶纖維素為原料，先經(jīng)過轉(zhuǎn)晶處理，再用65%濃硫酸水解制得直徑為(100±3)nm的SNC，并利用其良好的乳化性能，將其應用于穩(wěn)定O/W型的Pickering乳液[16]．賈夢雨等[17]以紙漿(桉木漿板)為原料，加入400U/mL的復合酶(纖維素酶與木聚糖酶)于50℃下反應5h制備得到100nm以下的球形納米纖維素，與殼聚糖共混制備出阻水阻氧、熱穩(wěn)定性和彈性模量較高的復合膜．微晶纖維素、紙漿等原料成本較高限制了SNC的規(guī)?；苽?，因此迫切需要尋找一種低成本生物質(zhì)原料．

木糖渣是玉米芯經(jīng)過酸處理提取木糖后的固體殘渣，由于生產(chǎn)木糖主要是利用玉米芯中的半纖維素成分，所以木糖渣的主要成分為纖維素和較容易脫除的木質(zhì)素[18]．為了實現(xiàn)廢棄生物質(zhì)的資源化利用，本研究以木糖渣為原料，采用酶解耦合超聲破碎或高壓均質(zhì)制備了SNC．考察了不同預處理、酶解時長、超聲破碎時長、高壓均質(zhì)壓力與循環(huán)次數(shù)對SNC形貌、粒徑、結晶度和產(chǎn)率的影響．

1 實 驗

1.1 材料與儀器

高速多功能粉碎機(天祺盛世工貿(mào)有限公司)，恒溫水浴振蕩器(優(yōu)萊博技術有限公司)，高速離心機(德國Sigma)，超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，高壓均質(zhì)機(安拓思納米技術有限公司)，納米粒度及Zeta電位儀(馬爾文)，X射線衍射儀(德國Bruker)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)，原子力顯微鏡(德國Bruker)．

木糖渣(山東龍力生物科技有限公司)，纖維素酶(夏盛酶生物技術有限公司)，過氧化氫(H2O2，30%，北京伊諾凱科技有限公司)，氫氧化鈉(NaOH，96%)和甲醇(CH3OH，AR)均購自上海阿拉丁公司．

1.2 木糖渣預處理

將木糖渣在60℃鼓風干燥箱中烘干，然后用粉碎機粉碎通過100目篩網(wǎng)并收集．將氫氧化鈉溶解在以下3種溶劑中，配置成質(zhì)量分數(shù)為2.5%[19]的混合堿液：甲醇(NaOH-CH3OH)、水(NaOH)和2%過氧化氫(NaOH-H2O2)．各取200mL，分別向其中投入20g或10g(NaOH-H2O2)100目木糖渣，80℃處理3h或50℃處理6h(NaOH-H2O2)[20]，整個過程均在轉(zhuǎn)數(shù)為120r/min的振蕩搖床中進行．反應結束后進行固液分離，將收集得到的固體水洗至中性，然后于60℃鼓風干燥箱中烘干、粉碎待用．

1.3 球形納米纖維素的制備

往錐形瓶中加入1g預處理后的木糖渣和99mL雙蒸水，室溫下提前潤脹2h，再加入500FPU纖維素酶，在50℃(酶最佳使用溫度)、120r/min的恒溫水浴振蕩器中反應，沸水浴15min終止反應．調(diào)節(jié)pH值為4使產(chǎn)物沉降[21-23]，8000r/min高速離心30min，收集沉淀并水洗至中性，然后加入80mL雙蒸水進行超聲破碎或高壓均質(zhì)處理．結束后2000r/min離心15min，收集上清懸浮液，凍干備用.

1.4 球形納米纖維素的表征

將凍干的SNC粉末研磨粉碎，取0.5g樣品在樣品臺上壓實壓平，用XRD測試[24](Cu靶，加速電壓40kV，工作電流40mA，掃描范圍2θ＝5°～30°，掃速5°/min)．配制質(zhì)量分數(shù)為0.01%的SNC懸浮液，取1.5mL加入石英比色皿中，用納米粒度及Zeta電位儀測試粒徑分布[25]．取50μL滴于云母片上，3min后用氮氣吹干，用于AFM測試(接觸模式，掃描頻率1Hz)．取50μL滴至玻璃片上，放入烘箱中至完全干燥，進行鍍金處理(E1045 鍍膜機，15mA，80s)，用于SEM測試(電壓5kV)．

1.5 分析方法與數(shù)據(jù)處理

木糖渣組分參照美國可再生能源實驗室(NREL)標準分析規(guī)程LAP-002(2008)進行測定．木質(zhì)素去除率計算式為

式中：Δω為木質(zhì)素去除率，%；0ω為木糖渣中木質(zhì)素含量；1ω為預處理后木糖渣中木質(zhì)素含量．

采用MDI Jade 6.5軟件對XRD所測數(shù)據(jù)進行分析，擬合出結晶區(qū)衍射峰以及非結晶區(qū)衍射峰，按式(2)計算：

式中：Xc為結晶度，%；Ac為結晶區(qū)衍射峰總面積；Aa為非結晶區(qū)衍射峰總面積．

球形納米纖維素的產(chǎn)率按式(3)計算：

式中：η為SNC產(chǎn)率，%；m1為制得SNC的質(zhì)量；m0為加入預處理后木糖渣的質(zhì)量．

2 結果與討論

2.1 木糖渣預處理方法的確定

如圖1所示，樣品在22°的衍射峰與纖維素Ⅰ的晶體結構有關[26]；堿處理后峰變得更窄、更尖銳，這表明結晶度在增加．這可能是在堿處理過程中去除了無定型木質(zhì)素，同時從纖維素中去除了無定形區(qū)域[27-29]．

圖1 預處理對木糖渣結晶度的影響Fig.1 Effect of pretreatment on the crystallinity of corncob residues

從表1可見，未處理的木糖渣木質(zhì)素含量為26.0%，NaOH-CH3OH、NaOH和NaOH-H2O23種堿性溶液均有效地去除了原料中的木質(zhì)素，使木質(zhì)素含量分別降低至9.4%、7.8%和8.2%，對木糖渣中木質(zhì)素的去除率分別為64.0%、70.2%和68.3%．未處理的木糖渣結晶度為50.1%，采用NaOH-CH3OH處理后結晶度有所提高，達到51.3%；NaOH處理后結晶度為72.5%；NaOH-H2O2處理后的木糖渣結晶度提高得最多，增大至74.7%．通過比較發(fā)現(xiàn)，NaOH和NaOH-H2O2預處理都具有較高的木質(zhì)素去除率和結晶度，但H2O2具有漂白效果，使得預處理后木糖渣由褐色變成白色，有利于后續(xù)制備高純納米纖維晶．因此，本文選擇2.5%NaOH-H2O2溶液為預處理液，用于制備SNC的原料均是基于NaOH-H2O2預處理后的木糖渣．在該條件下，預處理液的pH值為11.5，此時溶液中含有高活性自由基[30]，即H2O2解離產(chǎn)生的過氧自由基和羥基自由基(見式(4)和(5)).這些自由基將木質(zhì)素降解成低分子質(zhì)量化合物，從而實現(xiàn)木質(zhì)素的有效脫除[31]，提高原料的結晶度．

表1 預處理對木糖渣木質(zhì)素含量、木質(zhì)素去除率與結晶度的影響Tab.1 Effects of pretreatment on the lignin content，lignin removal rate，and crystallinity of corncob residues

2.2 球形納米纖維素形貌分析

圖2為預處理后的木糖渣在酶解3h耦合超聲破碎120min、高壓均質(zhì)20MPa循環(huán)5次或80MPa循環(huán)25次條件下制備的SNC的掃描電鏡圖和原子力顯微鏡圖．SEM和AFM均表明所制備的納米纖維素為大小均勻的球形．由圖2(a)可見，超聲處理后球形納米纖維素粒徑分布在40～60nm之間，大于Liu等[11]制備的納米纖維素(直徑10～40nm)；而20MPa高壓均質(zhì)下球形納米纖維素粒徑分布在600～800nm之間(圖2(b))．進一步提高均質(zhì)壓力和循環(huán)次數(shù)，在80MPa下循環(huán)25次后球形納米纖維素粒徑為5～10nm，直徑接近于Zhang等[10]制備的纖維素納米晶(直徑5～9nm)．這說明SNC粒徑分布受機械處理條件影響，處理強度越大，SNC的直徑越?。?/p>

圖2 SNC表面形貌(左：SEM，右：AFM)Fig.2 Surface topography of SNC(SEM on left，AFM on right)

2.3 酶解耦合超聲破碎

2.3.1 酶解時長的確定

眾所周知，纖維素內(nèi)切酶可以降解纖維素的無定型區(qū)[32]，隨著酶解時長增加，纖維素酶與底物反應越充分[33]．實驗分別探究了酶解3h、10h、24h以及超聲破碎對SNC粒徑分布的影響，實驗結果見圖3．隨著酶解時間的增長，SNC粒徑變小，在酶解3h情況下制得的SNC平均粒徑為300nm，酶解24h時減小為220nm．這是由于纖維素酶對纖維素非結晶區(qū)和結晶區(qū)的水解動力學影響不同[34]，使得酶解反應優(yōu)先發(fā)生在纖維素的非結晶區(qū)，有效減小了纖維長度[35].在酶解后進行超聲破碎，SNC的粒徑顯著降低．例如，酶解3h后超聲破碎所制備的SNC平均粒徑降至100nm．這表明短時間超聲破碎即可有效地降低SNC粒徑．超聲破碎實質(zhì)上是微氣泡的形成、生長和爆破過程．液體中的分子吸收超聲波形成氣泡，這些氣泡迅速炸裂產(chǎn)生能量(10～100kJ/mol)[36]，進一步降低SNC尺寸．

圖3 酶解時長以及超聲破碎對SNC粒徑分布的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis time and sonication on the diameter distribution of SNC

2.3.2 超聲破碎時長的確定

如表2所示，在酶解3h條件下考察超聲破碎20min、60min、90min和120min對產(chǎn)物粒徑以及產(chǎn)率的影響．當超聲破碎20min時，制得的SNC直徑為80～150nm，產(chǎn)率最低，僅為6.7mg/g；而當超聲破碎時間增至120min，SNC粒徑大幅度降低至30～80nm，產(chǎn)率也有所提高，為50.6mg/g．結果表明：隨著超聲破碎時間增長，SNC粒徑減小且產(chǎn)率隨之提高．

表2 超聲破碎時長對SNC粒徑和產(chǎn)率的影響Tab.2 Effects of sonication time on particle size and yield of SNC

圖4為酶解3h后耦合不同時長的超聲破碎所制備SNC的粒徑分布，當超聲破碎時間由20min增至120min時，SNC粒徑分布變窄，峰寬由73.9nm降低至46.1nm，表明延長超聲破碎時間可制得更均勻的SNC．綜上，隨著超聲破碎時間增長，制備的球形納米纖維素粒徑減小且粒徑分布更均勻，產(chǎn)率也隨之提高．

圖4 超聲破碎時長對SNC粒徑分布的影響Fig.4 Effects of sonication time on the diameter distribution of SNC

2.4 酶解聯(lián)合高壓均質(zhì)

2.4.1 高壓均質(zhì)壓力及循環(huán)次數(shù)的確定

圖5為酶解3h后耦合不同條件高壓均質(zhì)所制備的SNC的粒徑分布．由圖5可見，這種機械處理所得的SNC在1000nm內(nèi)的粒徑分布出現(xiàn)兩個峰．如表3所示，在相同循環(huán)次數(shù)條件下，增加均質(zhì)壓力，SNC顆粒直徑大幅度減小，產(chǎn)率增加也很明顯．例如，在20MPa(15次)條件下，SNC直徑在150～300nm范圍內(nèi)，產(chǎn)率為47.7mg/g；當80MPa(15次)時，制得的SNC減小為10～40nm，產(chǎn)率提升至80.6mg/g．在相同壓力下，增加循環(huán)次數(shù)也有利于SNC粒徑減?。?，20MPa條件下，循環(huán)次數(shù)從5次提高到15次，獲得的納米顆粒直徑從400～800nm減小為70～130nm；但產(chǎn)率變化較小，僅從46.3mg/g提高至48.2mg/g．由于高壓均質(zhì)過程中纖維素受到多種力的作用，包括粒子間的撞擊力、剪切力，以及由于物體流速的極端變化而產(chǎn)生的空化力等[37]，降低球形納米纖維素尺寸．因此，均質(zhì)壓力越大或循環(huán)次數(shù)越多，SNC粒徑越小且產(chǎn)率越高，從收率和能耗角度考慮，本研究選擇均質(zhì)壓力為80MPa，循環(huán)次數(shù)為15次．

圖5 高壓均質(zhì)對SNC粒徑分布的影響Fig.5 Effects of high-pressure homogenization on the diameter distribution of SNC

表3 高壓均質(zhì)對SNC粒徑和產(chǎn)率的影響Tab.3 Effects of high-pressure homogenization on the particle size and yield of SNC

2.4.2 SNC結晶度分析

圖6是在均質(zhì)循環(huán)15次情況下制得SNC的XRD譜圖，樣品的出峰位置幾乎無變化，這表明纖維素的晶體保持了天然纖維素Ⅰ型結構；20MPa、50MPa和80MPa條件下均質(zhì)15次制得的SNC結晶度分別為72.3%、63.9%和58.6%，與原料相比均有提高；但壓力越大，結晶度降低．這可能是因為球形納米纖維素粒徑的降低，減少了晶體域之間的氫鍵[23]；或者是較高壓力對剝離非晶態(tài)和晶態(tài)纖維素的非選擇性作用．

圖6 均質(zhì)壓力對SNC結晶度的影響Fig.6 Effects of homogeneous pressure on the crystallineity of SNC

3 結 語

本文以成本低廉的木糖渣為原料，采用酶解耦合超聲破碎或高壓均質(zhì)的方式制備高附加值的SNC．結果發(fā)現(xiàn)堿性過氧化氫處理后的木糖渣結晶度由50.1%提升至74.7%．酶解3h耦合超聲破碎120min可得到直徑30～80nm的SNC，產(chǎn)率為50.6mg/g；酶解3h聯(lián)合高壓均質(zhì)，分別在20MPa、50MPa和80MPa壓力下循環(huán)15次，可獲得直徑為150～300nm、20～80nm、10～40nm的SNC，收率分別為47.7mg/g、70.1mg/g、80.6mg/g．本研究通過調(diào)控制備條件可以得到不同粒徑的SNCs(如：5～30nm，10～40nm，30～80nm)，為木糖渣的高效利用以及納米纖維素的制備提供了一種新思路．