公 瑞，劉 湘，張 玥，程志新，殷 璇

血栓性淺靜脈炎（superficial thrombophlebitis，STP）是指發(fā)生于四肢、胸腹壁淺靜脈的血栓性、炎癥性疾病，在人群中的發(fā)病率高達(dá)3%～11%[1]。若不及時治療，其血栓可向近端或者深靜脈系統(tǒng)蔓延，導(dǎo)致深靜脈血栓形成，甚至引發(fā)肺栓塞[2]。本病屬于中醫(yī)學(xué)“惡脈”“青蛇毒”等范疇，其主要病機(jī)為熱毒、水濕和血瘀阻于脈絡(luò)。故中醫(yī)治以清熱利濕、活血通脈為主。四妙丸由黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、川牛膝組成，善治濕熱下注、下焦腫痛諸證。多項(xiàng)臨床研究表明四妙丸加味治療STP 療效顯著[3-5]，但是其治療STP 的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以高通量的方式從中藥復(fù)方中篩選出協(xié)同增效的化合物，具有“數(shù)據(jù)量大、分析便捷、結(jié)果準(zhǔn)確”的特征[6]。本文擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)，整合分析數(shù)據(jù)庫中藥物與疾病的信息，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，以探討四妙丸治療STP 的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 四妙丸有效成分篩選 通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫[7]獲取四妙丸中薏苡仁、黃柏、蒼術(shù)、牛膝的有效成分，按照口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的條件對有效成分進(jìn)行篩選。

1.2 有效成分作用靶點(diǎn)獲取 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫挖掘有效成分的作用靶點(diǎn)，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將作用靶點(diǎn)的名稱作標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 STP 靶點(diǎn)的獲取 使用Genecards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫 和OMIM（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）數(shù)據(jù)庫，分別檢索并獲取STP 相關(guān)靶點(diǎn)，在CTD 數(shù)據(jù)庫[8]中以“Inference Score≥10”為條件對獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，獲得與STP 相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過Excel 將1.2 中的靶點(diǎn)與1.3 中的靶點(diǎn)取交集，去除重復(fù)值后得到四妙丸治療STP 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過STRING 數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行預(yù)測，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的關(guān)系。STRING 數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)可對通過不同方式獲得的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行評分，分值越高，表示PPI 結(jié)果的置信度越高。

1.5 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 使用Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org）構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（node）分別代表中藥、成分、靶點(diǎn)與疾病，節(jié)點(diǎn)之間通過邊（edge）來連接。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（degree）的大小篩選出網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)。

1.6 四妙丸治療STP 通路富集分析 運(yùn)用Cytoscape3.7.2 中CluoGO v 2.5.5插件GO Biological Process 來分析四妙丸有效成分治療STP靶點(diǎn)生物過程，運(yùn)用KEGG 以“P＜0.01”對獲取的治療STP 的通路進(jìn)行富集分析。

1.7 核心成分與靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證 對1.5 中通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖篩選得到的核心成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。從RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）中下載獲取核心靶點(diǎn)蛋白PDB 格式的3D 結(jié)構(gòu)文件。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmspsearch.php）中下載獲取核心成分的mol2 格式文件。運(yùn)用AutoDockTools 1.5.6 軟件對靶蛋白和小分子配體進(jìn)行對接前的預(yù)處理。運(yùn)用Autodock vina 1.1.2 進(jìn)行對接及結(jié)合能的計(jì)算，進(jìn)而分析其結(jié)合活性。利用Pymol 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 四妙丸藥物入血活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索新處方藥物有效成分，以O(shè)B ≥30%和DL ≥0.18 為條件篩選出四妙丸活性化合物60個，其中薏苡仁9 個，川牛膝4 個，蒼術(shù)9 個，黃柏38 個。

2.2 有效成分作用靶點(diǎn) 獲取黃柏有效成分作用靶點(diǎn)132 個，川牛膝106 個，薏苡仁44 個，蒼術(shù)48 個。將靶點(diǎn)合并去除重復(fù)值后，共獲得132 個作用靶點(diǎn)。

2.3 STP 相關(guān)靶點(diǎn) 在GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中篩選出STP 相關(guān)靶點(diǎn)143 個，在CTD 數(shù)據(jù)庫中篩選出STP 相關(guān)靶點(diǎn)共4086 個，將靶點(diǎn)合并去除重復(fù)值后，共獲得相關(guān)靶點(diǎn)4148 個。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 經(jīng)過取交集并去除重復(fù)值后，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)94 個，并繪制維恩圖（圖1）。在STRING 數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵靶點(diǎn)，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2）以及靶點(diǎn)之間的關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點(diǎn)94 個，邊813 條，平均度值為17.3。按照節(jié)點(diǎn)度值設(shè)置，度值越高表示該節(jié)點(diǎn)越重要，其所代表的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用也就越高,表明這些靶點(diǎn)可能在四妙丸治療STP 的過程中起關(guān)鍵作用。

圖1 四妙丸有效成分作用靶點(diǎn)與STP 相關(guān)靶點(diǎn)交集

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)由143 個節(jié)點(diǎn)組成，其中4 個中藥節(jié)點(diǎn)、44 個成分節(jié)點(diǎn)、94 個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和1 個疾病靶點(diǎn)，六邊形代表中藥節(jié)點(diǎn)，橢圓形代表疾病節(jié)點(diǎn)，菱形代表靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，矩形代表成分節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的Degree 值越大，說明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。根據(jù)Degree 值大小篩選出核心成分和靶點(diǎn)(表1)，結(jié)果表明，槲皮素（MOL000098）、β 谷甾醇（MOL000358）等有效成分以及雄激素受體（androgen receptor,AR）、雌激素受體1（estrogen receptor，ESR1）、凝血酶Ⅱ（thrombin，F(xiàn)2)等靶點(diǎn)度值較高，說明這些有效成分和靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用顯著，是和其他靶點(diǎn)互通的紐帶。

表1 四妙丸治療STP 的核心節(jié)點(diǎn)

圖3 四妙丸治療STP 的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.6 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病通路分析 通過ClueGO 將四妙丸治療STP 的生物過程和通路進(jìn)行分析，運(yùn)用GO Biological Process 并選擇P＜0.01的生物過程，共214 條，關(guān)鍵靶點(diǎn)富集顯著的前5條生物過程（表2）為對藥物的反應(yīng)（48 個靶點(diǎn)），對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)（44 個靶點(diǎn)），對氮化合物的反應(yīng)（33 個靶點(diǎn)），細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)（32 個靶點(diǎn)），細(xì)胞對有機(jī)氮化合物的反應(yīng)（30個靶點(diǎn)）。證明四妙丸治療STP 的作用可通過參與多種生物過程而達(dá)到。

運(yùn)用KEGG 進(jìn)行通路富集分析，以P＜0.01共得到29 通路。結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，白細(xì)胞介素-17（interleukin 17，IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、松弛素（relaxin，RLX）信號通路及C 型凝集素受體（c-type lectin receptor，CLR）信號通路等通路是關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集的通路。

圖4 KEGG 獲得的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病通路

2.7 核心成分和核心靶點(diǎn)分子對接 在“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中篩選出四妙丸核心成分2 個[槲皮素（MOL000098），β 谷甾醇（MOL000358）]以及3 個核心靶點(diǎn)（ESR1、AR、F2）進(jìn)行分子對接。對接靶點(diǎn)基因的PDB ID 和結(jié)合能等信息見表3，對接結(jié)合位點(diǎn)見圖5，其中槲皮素與ESR1 的連接（圖5A）,槲皮素與AR的連接（圖5B），槲皮素與F2 的連接（圖5C），β 谷甾醇與ESR1 的連接（圖5D），β 谷甾醇與AR 的連接（圖5E），β 谷甾醇與F2 的連接（圖5F）。核心成分與靶點(diǎn)之間可通過氫鍵連接，圖中黃色虛線即是氫鍵。若結(jié)合能＜-7.0 kcal·mol-1，則提示結(jié)合活性較好[9]，分子對接結(jié)果表明，活性成分槲皮素、β 谷甾醇與核心蛋白ESR1、AR、F2 之間的相互作用力及結(jié)合親和力較強(qiáng)，具有潛在的研究價值。

圖5 四妙丸核心成分與其治療核心靶點(diǎn)的分子對接

表3 四妙丸核心成分與靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

3 討論

血栓性淺靜脈炎是指由于各種原因?qū)е卵簻粼跍\靜脈內(nèi)發(fā)生異常凝固，進(jìn)而阻塞淺靜脈，引起血液回流障礙，使沿淺靜脈走行部位出現(xiàn)紅、腫、熱、痛的急性非化膿性炎癥[10]。中醫(yī)認(rèn)為本病多由濕熱蘊(yùn)結(jié)、寒濕凝滯、痰濁瘀阻、脾虛濕蘊(yùn)、外傷血脈等因素致使?jié)裥跋伦⒂诿}絡(luò)，日久郁而化熱，煎熬血液而成瘀，導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，脈絡(luò)滯塞不通而發(fā)病[11]。故濕熱瘀結(jié)是其主要的病機(jī)特點(diǎn)。四妙丸出自清代張秉成的《成方便讀》，方中以黃柏為君藥，取其寒以勝熱，苦以燥濕，且善除下焦之濕熱。蒼術(shù)溫燥利濕，薏苡仁健脾燥濕散結(jié)，共為臣藥。牛膝活血通經(jīng)絡(luò)，且引藥直達(dá)下焦，為佐藥[12]。四藥配伍苦寒溫燥相制，長于下焦，藥簡而效專，共奏清熱利濕、活血解毒之功?，F(xiàn)代藥理表明，黃柏具有抗菌、消炎、解熱和鎮(zhèn)痛等作用[13]。蒼術(shù)具有抗腫瘤、抗炎和抗過敏等作用。薏苡仁具有抗凝血、抗腫瘤、降血糖和抗炎等作用[14]。牛膝具有擴(kuò)張血管、改善循環(huán)、抗炎和消腫等作用[15]。研究結(jié)果顯示，槲皮素、β-谷甾醇等為四妙丸治療STP 的核心成分，可通過作用于AR、ESR1、F2 等核心靶點(diǎn)和參與IL-17 信號通路、TNF 信號通路、RLX 信號通路、CLR 信號通路等達(dá)到治療STP 的作用。

3.1 四妙丸的有效成分 槲皮素屬于黃酮醇類物質(zhì)，其存在于蘋果、洋蔥、槐米等水果、蔬菜以及中藥中，研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒作用，特別是抗炎作用與其他藥理活性密切相關(guān)[16-18]。李林蔓等[19]通過研究槲皮素對于急性喉炎模型大鼠炎性反應(yīng)的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過提高Treg 細(xì)胞分化、降低Th17細(xì)胞分化進(jìn)而恢復(fù)Th17/Treg 平衡以及提高HO-1的表達(dá)水平和活性，從而改善急性喉炎模型大鼠喉部組織的炎性。孫軍等[20]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過直接激活氧化應(yīng)激下的血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）下游的PI3K/Akt 信號通路，對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)EPCs 氧化應(yīng)激損傷起到修復(fù)作用。β-谷甾醇是植物中甾醇類成分之一，廣泛存在于植物油和堅(jiān)果等植物種子中，主要有降血脂、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用[21]。Choi等[22]證實(shí)β-谷甾醇能夠減少TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌，發(fā)揮其抗炎作用。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn) AR、ESR1、F2 等是四妙丸作用于STP 的核心靶點(diǎn)，AR 是一種配體依賴性的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，主要分布在靶細(xì)胞的核內(nèi)，是參與雄激素在靶細(xì)胞中發(fā)揮作用的重要組成部分。研究表明睪酮是一種雄激素，由膽固醇合成，具有抑制炎癥、擴(kuò)張冠狀動脈的功能，由于睪酮主要與AR 通過基因及非基因效應(yīng)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，雄激素-AR 系統(tǒng)可對抗缺血缺氧對血管系統(tǒng)造成的改變，故AR 具有保護(hù)血管系統(tǒng)的作用[23]。羅秀梅等[24]研究表明：血小板Aβ 的過度生成可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而ESR1 可抑制血小板Aβ的生成，進(jìn)而防止血小板Aβ 過度生成對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成的毒性作用，從而達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。F2 是凝血級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，可以將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，激活凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅺ和Ⅻ，進(jìn)而活化血小板,增強(qiáng)血管通透性，發(fā)揮其炎癥介質(zhì)作用[25]。分子對接結(jié)果部分驗(yàn)證了四妙丸治療STP 的多靶點(diǎn)協(xié)同作用機(jī)制。

3.3 信號通路 IL-17 作為強(qiáng)大的促炎性細(xì)胞因子，可以經(jīng)過活化中性粒細(xì)胞和引導(dǎo)分泌前炎癥因子從而產(chǎn)生炎癥作用[26]。研究表明，TNF-α 作為炎性細(xì)胞因子的重要成員，可促使炎癥細(xì)胞活化，誘導(dǎo)黏附分子和趨化因子的分泌，是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要細(xì)胞因子[27]。二者作為炎性細(xì)胞因子，具有協(xié)同性[28]。IL-17 可以增多巨噬細(xì)胞生成TNF-α 和IL-1，從而進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[29]。因此，四妙丸可以通過以上2 種通路發(fā)揮抗炎作用，從而減輕STP 的炎癥反應(yīng)。RLX 是一種新型的肽類激素，研究表明RLX 可以引起內(nèi)皮源性血管擴(kuò)張，降低血管阻力、抑制炎性因子黏附，從而改善血管功能[30]。在大鼠和豚鼠的炎性反應(yīng)模型中，松弛素通過一氧化氮的產(chǎn)生介導(dǎo)抑制肥大細(xì)胞釋放組胺[31]。此外有研究表明松弛素可抑制中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞流入受損器官[30-31]。CLR 是一種模式識別受體，可以識別不同且保守的外源性病原體相關(guān)以及內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式，這些可以相互作用引發(fā)下游信號級聯(lián)，導(dǎo)致產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[32]。以上通路均為關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集的通路，與炎癥反應(yīng)、血管功能等關(guān)系密切，有效成分可能通過介導(dǎo)多條通路來發(fā)揮其藥理作用治療STP，體現(xiàn)出四妙丸多通路的協(xié)同作用機(jī)制。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討的是四妙丸治療STP 的作用機(jī)制，吳越等[14]探討的則是四妙丸治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)四妙丸主要通過槲皮素、漢黃芩素(Wogonin)、山柰酚(Kaempferol)、巴馬汀(Palmatine)、黃連堿(Coptisine)、黃芩素(Baicalein)等有效成分作用于前列腺素G/H 合成酶2(PTGS2)，絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)，絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)，腫瘤壞死因子(TNF)，雄激素受體(A R)等靶點(diǎn)以及IL-17 信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥的AGE-R AGE 信號通路、松弛素信號通路、TNF 信號通路、破骨細(xì)胞分化等通路來治療骨關(guān)節(jié)炎。其中漢黃芩素、山柰酚、巴馬汀、黃連堿、黃芩素等有效成分在治療過程中多起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，抑制炎性反應(yīng)的作用，槲皮素作為四妙丸治療兩種疾病時發(fā)揮主要作用的有效成分，在治療骨關(guān)節(jié)炎時其主要作用是通過抑制和減少活性氧種類(ROS)和下游因子(如MMP)來保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，減輕關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解來改善骨關(guān)節(jié)炎，而在治療STP 時則多取其抗炎、抗氧化、修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。在治療骨關(guān)節(jié)炎時主要作用的靶點(diǎn)及通路多介導(dǎo)參與的是軟骨的降解與損傷修復(fù)，炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程，而治療STP時主要作用的靶點(diǎn)及通路則更多參與介導(dǎo)的除炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程以外，更多的是對血管功能的改善與保護(hù)。綜上所述，四妙丸在治療骨關(guān)節(jié)炎及STP 時發(fā)揮的相同作用是抑制炎性反應(yīng)，不同的是治療骨關(guān)節(jié)炎時要保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，治療STP時則要改善血管功能。

本研究說明了四妙丸中的多種成分可能通過作用于多個靶點(diǎn)和介導(dǎo)多項(xiàng)通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、抗凝、保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，從而達(dá)到治療STP 的效果。但考慮到網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫不夠完善，所以存在一定的局限性，四妙丸治療STP 的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究進(jìn)行完善和驗(yàn)證。