趙 聰，劉寶清，楊成城，張少輝，李 喬，孟 瑩，安佳琳

目前結(jié)腸及直腸腫瘤發(fā)病率較前明顯提高[1]，腸道腫瘤引起的腸梗阻具有腹痛、嘔吐、腹脹及停止排氣排便等一般腸梗阻的特點(diǎn)，同時(shí)因腫瘤對(duì)人體的打擊，患者對(duì)腸梗阻的耐受較低，死亡率較一般腸梗阻高[2]。目前西醫(yī)治療腸梗阻以維持水電解質(zhì)及酸堿平衡、抗炎、抗感染及手術(shù)治療為主，但單純西醫(yī)治療存在復(fù)發(fā)率較高及患者生存質(zhì)量較低且對(duì)家庭經(jīng)濟(jì)壓力較大等問(wèn)題[3]。中醫(yī)可針對(duì)病因病機(jī)，發(fā)揮整體辨證優(yōu)勢(shì)，通過(guò)中藥灌腸、針灸及穴位貼敷等多種方式對(duì)腫瘤性腸梗阻進(jìn)行干預(yù)，臨床實(shí)踐中應(yīng)對(duì)其積極推廣。

《內(nèi)經(jīng)》云：“六腑者瀉而不藏,實(shí)而不能滿(mǎn)”，治療以通為主。六磨湯出自《世醫(yī)得效方》，此方的藥物組成為檳榔、沉香、木香、烏藥、大黃、枳殼，其主要功效為破氣寬中，通泄降逆。研究表明，六磨湯不僅可以通過(guò)灌腸、敷臍等多種治療方式有效改善腫瘤晚期患者腸梗阻癥狀，還可以提高患者生存質(zhì)量，促進(jìn)患者康復(fù)[4-10]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多向藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)，并通過(guò)數(shù)據(jù)分析、疾病及藥物數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、計(jì)算機(jī)模擬等方式，以預(yù)測(cè)“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間聯(lián)系的一種方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，這與中醫(yī)的“整體觀念”有著異曲同工之處[11-12]。本研究是在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接研究方法的基礎(chǔ)上，探討六磨湯治療腫瘤性腸梗阻的作用機(jī)制，以期為六磨湯的深入研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 六磨湯中潛在靶點(diǎn)及其化合物預(yù)測(cè) 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索檳榔、沉香、木香、烏藥、大黃、枳殼的化學(xué)成分及靶點(diǎn)。根據(jù)藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性指數(shù)（drug likeness，DL）≥0.18 篩選有效化學(xué)成分[13]。將由TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得出的藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)與Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.Uniprot.org)對(duì)比，得出有效靶點(diǎn)。

1.2 疾病的靶點(diǎn)收集 通過(guò)檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)（https://www.omim.org/）、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org/），以“Tumor Intestinal Obstruction”為關(guān)鍵詞，得到腫瘤性腸梗阻的相關(guān)靶點(diǎn)和基因。

1.3 六磨湯與腫瘤性腸梗阻共同靶點(diǎn)的篩選 將藥物化合物、腫瘤性腸梗阻的相關(guān)靶點(diǎn)利用R 軟件中的 Draw Venn Diagrams 工具獲取化合物治療疾病的共同靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（Protein Protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將交集靶點(diǎn)蛋白輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)制作PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并利用Cytoscape3.8.0 軟件對(duì)獲得的交集靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行可視化處理，通過(guò)CytoNCA 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅贸龊诵陌悬c(diǎn)。

1.5 基因富集分析 通過(guò)R 語(yǔ)言中的“cluster Pro filer”“DOSE”“enrich plot”等程序包進(jìn)行GO 功能富集分析,進(jìn)一步探索中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用。通過(guò)R 語(yǔ)言中的“cluster Pro filer”“org.Hs.eg.db”“enrich plot”、“ggplot2”等程序包對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG 功能富集分析,進(jìn)一步闡釋中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白在通路功能中的作用。

1.6 六磨湯核心化學(xué)成分與關(guān)鍵靶基因的分子對(duì)接驗(yàn)證 首先通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載小分子配體文件，使用Chem Office 軟件構(gòu)建小分子配體的3D 結(jié)構(gòu)。再?gòu)腜DB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，使用PyMOL 軟件進(jìn)行去水、去有機(jī)物操作。使用利用Auto Dock 軟件將活性成分結(jié)合，尋找活性口袋。篩選出同樣作用于藥物與疾病的分子進(jìn)行對(duì)接研究，最后使用PyMOL 軟件構(gòu)建完整的分子對(duì)接圖。

2 結(jié)果

2.1 六磨湯成分的收集及對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)信息分析 通過(guò)TCMSP 檢索到制檳榔化合物7 個(gè)，沉香化合物9 個(gè)，木香化合物6 個(gè)，烏藥化合物9 個(gè)，大黃化合物16 個(gè)，枳殼化合物5 個(gè)，見(jiàn)表1。這些化合物包括：β-谷甾醇、川陳皮素、蘆薈大黃素、槲皮素、柚皮素等，見(jiàn)表2。與UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物靶基因進(jìn)行校正分析，并剔除重復(fù)，得到六磨湯化合物的相關(guān)靶點(diǎn)基因25 個(gè)。檢索多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到腫瘤性腸梗阻的相關(guān)靶點(diǎn)6 530 個(gè)，將六磨湯與腸梗阻的潛在靶點(diǎn)經(jīng)過(guò)韋恩分析后，獲得兩者的共有交集179 個(gè)靶點(diǎn)。韋恩圖見(jiàn)圖1，藥物有效化合物和疾病靶點(diǎn)的相互關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖1 復(fù)方-疾病交集基因韋恩圖

圖2 復(fù)方化學(xué)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)

表1 六磨湯中藥-成分-靶點(diǎn)信息

表2 六磨湯的有效成分

續(xù)表2

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將交集靶點(diǎn)通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得出靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，其中共含160 個(gè)節(jié)點(diǎn)和701 條相互作用關(guān)系，再使用Cytoscape3.8.0 軟件可視化處理，見(jiàn)圖3。使用CytoNCA 插件對(duì)所得的 PPI 作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)拓?fù)浞治?，得出核心靶點(diǎn)有TP53、RB1、PRKCB、MAPK3、MYC、MAPK14 等，見(jiàn)表3。

表3 核心靶點(diǎn)

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 六磨湯治療腸梗阻靶點(diǎn)的富集分析 將六磨湯治療腸梗阻的共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，得到P＜0.05 的生物學(xué)功能條目2 722 條，其中P＜0.05 的生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能條目分別有2 425、92、205 條，各選取前20 條進(jìn)行可視化，可見(jiàn)復(fù)方藥中的活性成分作用的靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)等；在細(xì)胞組成中膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域所占比例最大；在分子功能方面，DNA 活化轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性排位靠前。見(jiàn)圖4。

圖4 GO 富集

將六磨湯治療腸梗阻的共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選得到P＜0.05 的條目158 條，選取P＜0.05 且與腸梗阻相關(guān)的20 條進(jìn)行可視化展示，見(jiàn)圖5。其中前20 條相關(guān)通路的富集，主要涉及結(jié)腸直腸癌信號(hào)通路（Colorectal cancer）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3KAkt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等。

圖5 KEGG 通路富集圖

2.4 六磨湯核心成分作用于核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 六磨湯核心有效化學(xué)成分為柚皮素、槲皮素（表4），PPI 網(wǎng)中核心靶點(diǎn)且Degree 值較高為AKT1、JUN、MAPK1、MAPK3、RELA、TP53。目前公認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低,發(fā)生的作用可能性越大，具體分子結(jié)合能見(jiàn)表4，分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖6～11。

圖6 柚皮素-AKT1 分子對(duì)接

表4 六磨湯中部分核心化學(xué)成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能

圖7 柚皮素-JUN 分子對(duì)接

圖8 槲皮素-MAPK1 分子對(duì)接

圖9 槲皮素-MAPK3 分子對(duì)接

圖10 槲皮素-RELA 分子對(duì)接

圖11 槲皮素-TP53 分子對(duì)接

3 討論

六磨湯中部分活性成分較多，如槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素等。槲皮素具有較強(qiáng)的抗炎作用[14]，其通過(guò)抑制白細(xì)胞介素（IL）-6 等炎性因子的表達(dá)起到抗炎作用[15]；槲皮素是一種具有廣譜抗菌作用的一種植物性抗菌劑[16]，且在人體內(nèi)外都可發(fā)揮抗菌作用[17]，并可有效調(diào)節(jié)腸道菌群[18]，相關(guān)研究表明，腸道菌群改善可降低腫瘤化療不良反應(yīng)及提高腫瘤化療效果[19]；同時(shí)槲皮素亦可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡達(dá)到抗腫瘤作用。β-谷甾醇通過(guò)抑制炎癥小體的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞中炎性因子如IL-6、IL-8 等達(dá)到抗炎效果；其還可以通過(guò)增多抗菌肽的表達(dá)及增加與病原微生物的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)增加巨噬細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)免疫[20]，從而起到抗菌作用[21]；同時(shí)β-谷甾醇或可以通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF 等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，以抑制癌細(xì)胞異常增殖、分化，從而起到抗腫瘤的作用[22]。柚皮素可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以達(dá)到抗腫瘤的作用[23]；并且通過(guò)降低環(huán)氧化酶2 的表達(dá)，以抑制炎性因子的表達(dá)起到抗炎作用[24]。六磨湯中各組成中藥可以通過(guò)多種活性成分綜合作用，不僅對(duì)腸道腫瘤的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)行干預(yù)，還可以改善患者腸梗阻癥狀，提高患者的生存質(zhì)量。

通過(guò)GO 富集分析顯示，靶點(diǎn)主要富集合在細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激，腫瘤性腸梗阻因腫瘤擴(kuò)散嚴(yán)重影響患者腸道功能，六磨湯可降低腸道應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)腸道功能恢復(fù)，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善患者生活質(zhì)量。KEGG 富集分析結(jié)果提示，六磨湯或可調(diào)節(jié)IL-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3KAkt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）及結(jié)腸直腸癌信號(hào)通路（Colorectal cancer）等信號(hào)通路。IL-17 信號(hào)通路主要作用于IL-17 炎性因子，IL-17 炎性因子的降低是疾病緩解的重要標(biāo)志[25]。PI3K/AKT 信號(hào)通路是人體重要的信號(hào)通路，其可參與多種人體生物活動(dòng)，尤對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。六磨湯可通過(guò)調(diào)節(jié)AKT1的表達(dá)以干預(yù)PI3K/AKT 信號(hào)通路以減少免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)[26]。HIF-1 是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠隨著細(xì)胞中氧濃度的變化而改變基因表達(dá)[27]。同時(shí)六磨湯可直接作用于結(jié)腸直腸癌信號(hào)通路，并通過(guò)對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果提示PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)且Degree 值較高為MAPK1、MAPK3 等，MAPK 靶點(diǎn)基因的表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)[28]，提示其可通過(guò)多通路及多靶點(diǎn)共同作用，對(duì)結(jié)腸及直腸腫瘤進(jìn)行干預(yù)。腫瘤性腸梗阻患者在患病期間不僅因腸梗阻引起腸道菌群失常、全身炎癥反應(yīng)及全身營(yíng)養(yǎng)失衡，還因腫瘤原因使得患者生活質(zhì)量進(jìn)一步下降。六磨湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)多靶點(diǎn)基因、多條信號(hào)通路以達(dá)到提高患者免疫力、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道菌群及抗腫瘤作用，促進(jìn)患者生活質(zhì)量的提高為進(jìn)一步臨床治療提供基礎(chǔ)。

通過(guò)分子對(duì)接結(jié)果可見(jiàn)，各小分子配體與受體結(jié)合的結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，提示槲皮素與AKT1、JUN、RELA、TP53 結(jié)合及柚皮素與MAPK1、MAPK3 結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量較低，可發(fā)揮的作用可能較高。六磨湯可通過(guò)多種活性成分綜合作用，發(fā)揮其可作用于多靶點(diǎn)、多通路的優(yōu)勢(shì)，針對(duì)在腫瘤性腸梗阻中發(fā)揮作用的多個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)的基因靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)。六磨湯通過(guò)發(fā)揮抗炎、抗菌及抗腫瘤等生物學(xué)作用以改善腫瘤性腸梗阻患者的生活質(zhì)量。

綜上所述，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接的分析方法，探索六磨湯干預(yù)腫瘤性腸梗阻的作用機(jī)制。結(jié)果提示，六磨湯通過(guò)多活性成分共同作用以調(diào)節(jié)多靶點(diǎn)蛋白表達(dá)及信號(hào)通路，從而達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)及抗腫瘤等生物學(xué)作用，以提高患者生存質(zhì)量。同時(shí)本研究亦證實(shí)中醫(yī)藥具有可作用多靶點(diǎn)、多通路的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)本研究期望為今后研究六磨湯作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)及六磨湯的臨床合理應(yīng)用提供參考。但該研究仍存在一定的局限性，仍需開(kāi)展相應(yīng)試驗(yàn)明確六磨湯對(duì)上述關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路影響的準(zhǔn)確性。