王丹丹，劉鳴暢，楊艷歌，王洪越，袁 飛，吳亞君,*，吳淑清*

（1.長春大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

近年來，隨著食源性疾病的暴發(fā)，食源性致病菌成為影響食品質量與安全的首要因素，食源性致病菌主要包括彎曲桿菌屬、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌O157:H7和其他產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌菌株和弧菌等[1-3]。食品從原材料生產(chǎn)到最終消費都可能通過與水、空氣、土壤、肥料及食品加工環(huán)境的接觸而被病原體污染。據(jù)市場監(jiān)督管理總局2020年7月29日發(fā)布的食品監(jiān)督抽檢結果可以看出微生物污染占檢測不合格項目總數(shù)的18.78%，是導致食品安全隱患的主要問題之一。

因此，為了確保食品安全，在將食品投放市場之前，使用可靠、有效的方法檢測病原菌至關重要。但是由于近些年食品中添加劑、抗生素等的使用，檢測過程中細菌的生長可能受到抑制，傳統(tǒng)檢測方法容易出現(xiàn)假陰性結果，在對一些表型變異的菌株也較難用形態(tài)學辨別其種類，且傳統(tǒng)檢測方法一般包括前增菌、選擇性富集培養(yǎng)、鑒別性培養(yǎng)、挑選特定表型菌株、生理生化鑒定5 個步驟[4-5]，操作步驟繁瑣、耗時耗力，無法滿足快速檢測和預警的需求，因而簡便、特異、靈敏、低耗且適用的快速診斷及檢測食品中致病微生物的方法被廣泛應用。近年來，食源性致病菌快速檢測技術獲得了很大的進展，本文就目前常用微生物快速檢測技術的應用和研究現(xiàn)狀作總結概述，以期對我國食品快速檢測領域的發(fā)展提供參考。

1 食源性致病菌快速檢測技術的分類

1.1 顯色培養(yǎng)基技術

定位顯色培養(yǎng)基是一種基于生化反應的微生物鑒定技術，其原理是根據(jù)不同微生物胞內酶反應條件的差異作為分類鑒定的依據(jù)，在分離培養(yǎng)基中加入特定的底物，這些底物由微生物可代謝的物質及發(fā)色基團組成，在微生物特異性酶的作用下，發(fā)色基團游離并顯色，通過觀察菌落的顏色就能夠對菌種進行鑒別[6]。劉成文等[7]用定位顯色培養(yǎng)基對單核細胞增生李斯特菌純培養(yǎng)物及人工污染樣品進行了快速鑒定，結果顯示該方法對單核細胞增生李斯特菌純菌及6 份陽性人工污染樣品在1∶103～1∶108稀釋度下檢出率都達到了100%，特異性、靈敏度和準確性較高。結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（violet red bile glucose agar，VRBGE）被用作阪崎腸桿菌的顯色培養(yǎng)，在反應過程中釋放糖苷配基5-溴-4-氯-吲哚，該糖苷配基在氧氣存在時形成色素溴-氯-吲哚，使菌落呈現(xiàn)藍綠色。胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）是微生物實驗中的一種通用營養(yǎng)培養(yǎng)基，如大腸埃希氏菌在該培養(yǎng)基上顯示無色透明大菌落，銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基上產(chǎn)生綠色色素，枯草芽孢桿菌則呈現(xiàn)白色不規(guī)則菌落[8]。該技術操作簡單、方便，但是因為一些競爭作用的存在可能會使目標菌生長受到抑制，產(chǎn)生假陰性結果。

1.2 ATP發(fā)光法

ATP發(fā)光法是一種快速且便捷的操作技術，只需要幾分鐘便可以得到檢測結果。ATP在細胞代謝中起重要作用，其含量可以直接代表活細胞數(shù)，原理是將細菌中的ATP提取出來，和熒光素酶、氧氣、鎂一同和蟲熒光素發(fā)生反應產(chǎn)生熒光，通過反應產(chǎn)生的熒光推測計算其ATP的含量，從而得到所測樣品中細菌的含量[9-10]。目前，ATP發(fā)光技術在大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌的檢測中得到了應用。李海月等[11]通過運用ATP發(fā)光技術與平板計數(shù)法建立了副溶血性弧菌等常見食源性致病菌的菌落濃度與其相對應的發(fā)光強度的數(shù)學模型，Park[12]、Minikh[13]、陳文玲[14]等用該技術檢測大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見食源性致病菌，Bottari等[15]還將該技術用于檢測飲料中的菌落總數(shù)。但是該檢測方法也存在一些不足之處，ATP發(fā)光法的檢測限較高，且容易受鹽、游離ATP、體細胞等因素的干擾[16]，且該反應體系中的酶比較多，酶促反應會相互干擾，導致檢測結果不穩(wěn)定，所以其應用較為局限，目前大多用在水質檢測或者食品生產(chǎn)環(huán)境的監(jiān)測。

1.3 免疫學技術

基于抗原抗體結合的免疫學技術也被應用于微生物的快速檢測中，這些檢測主要依賴于特異性結合抗原的抗體來檢測是否含有目標物質，目前應用較多的主要有以下幾種技術。

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗技術

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術是用酶標記表面吸附抗原或抗體的固相載體，其與相應的抗體或者抗原相結合，形成帶有酶標記的復合物，得到的攜帶酶的復合物可與特定底物反應產(chǎn)生顏色變化，通過對該產(chǎn)物的定量分析，從而達到檢測目的，抗體是確定ELISA靈敏度和特異性的關鍵因素。Cho等[17]使用3 種抗體功能化的金納米顆粒進行ELISA分析，因金納米顆粒具有網(wǎng)絡結構，可使更多的酶標抗體連接至靶標，從而增強了信號強度，并且結合免疫磁分離技術，使得對大腸桿菌O157:H7的檢測限達到了3 CFU/mL。Wu Wenhe等[18]開發(fā)了一種基于金納米顆粒的酶聯(lián)抗體-適配體夾心法檢測鼠傷寒沙門氏菌，該方法使用適配體功能化的磁珠進行目標分離，用二抗形成夾心結構，并用與檢測抗體和酶偶聯(lián)的AuNPs進行標記，可檢測到牛奶中加標濃度為103CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌。ELISA技術檢測微生物時特異性較強、靈敏度高、檢測時間較短，但其實驗過程繁瑣，結果重復性較差，且基于單克隆抗體的ELISA檢測方法在檢測過程中因單克隆抗體易與菌株之間產(chǎn)生交叉反應，導致結果偏差[19]。

1.3.2 免疫熒光技術

免疫熒光技術是采用熒光素標記已知抗原或抗體，與特異抗體或者抗原結合后產(chǎn)生熒光的原理實現(xiàn)檢測目標致病菌的目的。Ozeh等[20]將免疫熒光技術與光電動力學技術相結合用于水中大腸桿菌的檢測和定量，并在4 h內檢測限達到104CFU/mL。較傳統(tǒng)ELISA而言，該技術檢測時間更短，靈敏度更高。但該技術判定結果的操作過程較繁瑣，且需要專業(yè)人員操作，因此在食源性病原菌檢測方面應用較少。

1.3.3 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術（gold immunochromatography assay，GICA）是以膠體金作為標記物檢測特定抗原或抗體的免疫標記技術，其以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，待測物受體與樣品反應，產(chǎn)物被聚集到層析材料的某一位置，通過膠體金可直接觀察實驗現(xiàn)象[21]。彭喆等[22]研制了膠體金免疫層析試紙條對沙門氏菌進行檢測，結果表明該試紙條特異性強、重復性好及結果穩(wěn)定，對沙門氏菌的最低檢測量為1.07×107CFU/mL，檢測時間僅需5～10 min。劉景武等[23]以膠體金標記沙門氏菌血清抗體，檢測沙門氏菌及其他菌種，結果顯示21 株沙門氏菌均呈陽性，其他菌株均呈陰性，靈敏度為106CFU/mL，檢測時間為10 min。GICA技術還被用來檢測大腸桿菌O157:H7[24]以及志賀氏菌[25]等常見微生物。GICA技術操作簡單、生產(chǎn)成本低、檢測范圍廣，不需要儀器設備檢測，檢測速度快，一般在5～15 min就可以得到結果，但是在檢測靈敏度和選擇性方面較差，因此其應用受到了限制[26]。

1.4 分子生物學技術

1.4.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術中實時熒光PCR和多重PCR技術在快速檢測中的應用比較廣泛，其中實時熒光PCR技術是在PCR反應體系中加入了熒光基團，在反應過程中隨著熒光信號的積累來實時監(jiān)測PCR反應進程，最后通過標準曲線來定量分析樣品中的待測成分。相比于傳統(tǒng)PCR技術，實時熒光定量PCR技術能實現(xiàn)實時對待檢成分進行定性、定量分析，省去電泳步驟，節(jié)省了時間[27]。周敏琪[28]采用實時熒光定量PCR檢測奶粉中的阪崎腸桿菌，結果顯示對人工污染的奶粉檢出限達到4.7×103CFU/mL。Delibato等[29]應用實時熒光定量PCR檢測沙門氏菌，在豬肉基質中檢測限達10 CFU/25 g。本課題組也建立了克羅諾桿菌屬一步法提取DNA和快速實時熒光PCR速測體系，對于建立的一步法DNA快速提取流程，取樣后僅需12 min熱循環(huán)反應即可直接獲取DNA，快速實時熒光PCR僅需27 min即可完成，且該速測體系與傳統(tǒng)標準檢測方法的靈敏度基本一致[30]。多重熒光定量PCR技術（multiplex quantitative real-time PCR，m-qPCR）是指在同一PCR反應體系里加入兩對及兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，較單重PCR反應，該方法可在同一反應管內同時檢出多個待檢成分，節(jié)省時間、試劑和經(jīng)費，具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟簡便性[31-32]。Lee等[33]建立了m-qPCR檢測食品中大腸桿菌O157:H7、蠟狀芽孢桿菌、副溶血性桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌以及金黃色葡萄球菌的方法，該m-qPCR分析方法用于評估人工接種的幾個即食食品樣品中6 種食源性病原體的檢測有效性時，在12 h內對6 種目標菌的檢測限能達到1 CFU/mL。PCR檢測技術是以核酸為基礎的檢測技術，基于核酸的檢測方法速度快、特異性高及重現(xiàn)性好，并且只需要少量的靶標DNA，但由于活細胞和非活細胞都存在核酸物質，僅憑核酸無法直接區(qū)分活菌和死菌，對此，一些研究者開發(fā)了僅檢測活細菌DNA的PCR檢測方法，Li Baoguang等[34]研究將定量PCR（quantitative PCR，qPCR）與疊氮化丙錠（propidium monoazide，PMA）結合使用，抑制了死細胞的DNA擴增，從而僅檢測活菌DNA，該技術能夠檢測菠菜中10～103CFU/g活細胞。此外，數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是繼普通PCR和實時熒光定量PCR之后的第三代PCR技術，是一種具有單分子敏感性的精確核酸定量技術[35]。dPCR以微流控和微滴化為基礎，將大量稀釋后的核酸分散至數(shù)百到數(shù)萬計的微滴中，每個反應室中的單拷貝核酸進行獨立的熒光PCR擴增，通過逐個檢測并統(tǒng)計反應室中陽性和陰性反應的數(shù)量單元，最終計算出初始樣品中目標核酸的精確拷貝數(shù)。相對于傳統(tǒng)PCR技術而言，dPCR不依賴擴增閾值和標準曲線，具有高靈敏度、高精確度和絕對定量等特點[36-37]。趙新等[38]采用微滴式dPCR技術定量檢測沙門氏菌，檢測靈敏度可達102CFU/mL，目前已經(jīng)有多種食源性致病細菌，如大腸桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌等均建立有dPCR檢測方法[39-40]。

1.4.2 等溫擴增技術

1.4.2.1 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermalamplification，LAMP）是針對靶基因的6 個區(qū)域設計4 種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶、60～65 ℃恒溫條件下在體外擴增核酸的技術[41]。王瑾[42]根據(jù)沙門氏菌invA基因序列設計了特異性引物，建立了沙門氏菌LAMP檢測方法，該方法檢測僅需45 min，靈敏度達到6 CFU/mL。LAMP技術也被運用到創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌的檢測[43-45]。同時，為滿足各種需求，新型的LAMP分析方法也得到發(fā)展。Liu Ningwei等[46]開發(fā)了基于不同熔融溫度的多重LAMP測定法，以同時鑒定沙門氏菌和副溶血性弧菌，結果顯示該方法具有100%的特異性。Wu Guoping等[47]開發(fā)了一種疊氮溴化乙錠結合實時熒光環(huán)介導等溫擴增（ethidium monoazide bromide-real-time-loop-mediated isothermal amplification，EMA-Rti-LAMP）法測定，使用實時LAMP方法結合疊氮溴化乙錠（ethidium monoazide bromide，EMA）處理來選擇性檢測和定量腸炎沙門氏菌的活細胞。該技術特異性高、反應速度快、敏感性高、簡單便捷及成本低[48]。但該方法也存在一些缺點，如LAMP法的引物比PCR方法的引物要求更高，設計符合要求的引物較難，且該反應過程中加入多條引物，引物間可能會因堿基互補產(chǎn)生二聚體，進而導致產(chǎn)生假陽性結果[49]。

1.4.2.2 重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）是另一種新穎的等溫擴增技術，由特定的重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶結合，在常溫條件下進行反應，5～20 min即可獲得與LAMP一樣的檢測結果。Yang Huanla等[50]使用重組酶聚合酶和內部擴增對照（internal amplification control，IAC）的新型RPA-IAC測定法來檢測副溶血性弧菌，根據(jù)副溶血弧菌toxR基因的編碼序列設計特異性引物，競爭性IAC與目標序列同時擴增，以避免假陰性結果，檢測靈敏度達3×103CFU/mL。Chen Jiaping等[51]開發(fā)了一種基于熒光探針的RPA分析方法用于腸炎沙門氏菌檢測，檢測限可達2.2×103CFU/mL。RPA靈敏度高、操作簡單、檢測效率高，并且其所需試劑大多都以干粉形式保存，方便運輸且能夠長期保存，但是，RPA擴增反應需要的引物長度為30～35 bp，比PCR引物更長，因此引物序列優(yōu)化時間冗長。此外，RPA通常在擴增后需要純化，否則在瓊脂糖凝膠電泳時會導致結果模糊。

1.4.2.3 滾環(huán)擴增技術

滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）技術是DNA分子以滾環(huán)式復制的一種恒溫擴增技術，其關鍵在于構建一個完整的單鏈DNA環(huán)用于后續(xù)擴增，RCA主要有線性RCA、超分支RCA和多引物RCA。Hao Liling等[52]設計了金黃色葡萄球菌的RCA反應，反應中產(chǎn)生的單鏈DNA用于捕獲反應中形成的游離復合物，從而較少量的復合物吸附在納米材料上，保持原有化學發(fā)光，實現(xiàn)信號放大，結果表明在最優(yōu)條件下該方法對純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的檢測限可達15 CFU/mL。Takahashi等[53]建立了一種基于RNA引導的RCA技術用于檢測單核增生李斯特菌，通過分子內連接制備預環(huán)化的DNA探針，并用核酸外切酶I處理以消除未環(huán)化的寡核苷酸，從而顯著降低影響RNA引導的RCA的非特異性擴增DNA副產(chǎn)物。RCA反應在設計上較簡單，不像LAMP一樣需要多個引物，反應產(chǎn)物較單一，能與探針直接結合實現(xiàn)信號放大。但RCA操作繁瑣，需要磷酸化的DNA來構建環(huán)，此過程需要的DNA連接酶對反應體系要求較高，當體系中的NaCl或KCl的濃度超過200 mmol/L時，DNA連接酶的活性會被抑制。

1.4.3 基因芯片技術

基因芯片技術（DNA chip）又稱DNA芯片、DNA微陣列技術，其主要利用核酸分子雜交，是通過基因芯片上固定的已知序列的核酸或核酸片段去確定被檢測的DNA樣品，因其通量高、自動化程度高等被廣泛應用在各個領域。左秀華[54]將多重PCR技術與基因芯片技術結合檢測致瀉性大腸桿菌，其對腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌和大腸桿菌O157特異性較好，檢測的靈敏度為104CFU/mL。顧鳴等[55]將基因芯片技術與PCR技術聯(lián)用檢測金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，其檢測限分別可達1.0×101CFU/mL和1.0×102CFU/mL?；蛐酒夹g因操作簡便快捷、通量高從而實現(xiàn)快速檢測，但該方法所需要的儀器費用較高，檢測特性較差，且操作過程中待檢物質在放大時易污染，導致結果偏差。

1.4.4 微流控芯片技術

微流控芯片技術（microfluidic chip）又稱為芯片實驗室，結合分析化學、微機電加工技術、微管道網(wǎng)絡、生命科學等多個技術，其將樣品制備、反應、分離、檢測等多個步驟集成到一張芯片上，較基因芯片大多只能使用一次而言，微流控芯片能夠多次使用，因此更有發(fā)展前景。其通常借助光學方法或熒光信號檢測將擴增的DNA可視化，Park等[56]開發(fā)了一種利用mPCR的微流控芯片設備來檢測大腸桿菌O157:H7，該測定法使用集成的無泵微流控芯片，通過PCR在膜室中擴增食源性病原體的靶基因，并使用方波伏安法對擴增的基因進行電化學定量，其靈敏度可達102CFU/mL。Zhu Tao等[57]將電化學阻抗技術結合微流控芯片檢測大腸埃希氏菌，在2 h內其檢測限可達103CFU/mL。微流控芯片技術檢測時所需的樣本和試劑用量少，并且在微流控芯片內集成多條通道提高了檢測通量，但由于各通道間都是獨立的，因此集成度不高，且各個通道需進行單獨操作，各反應通道間的平行性無法保證[58-59]。

1.4.5 高通量測序技術

二代測序技術實現(xiàn)了對全基因組的研究，把DNA測序引入到高通量測序時代，但是二代測序技術讀長過短、易引入PCR擴增錯誤且具有堿基GC偏好性，因此三代測序應用而生，與二代測序的邊合成邊測序相比，三代測序不需要進行PCR擴增，避免PCR擴增引入錯誤，同時第三代測序具有更高的通量和測序效率[60]。Sarah等[61]利用MinION納米孔測序儀進行了微生物基因組測序，結果表明該測序儀可以在國際空間站上進行快速的現(xiàn)場診斷和微生物鑒定，并且可以在任何空間環(huán)境中進行大規(guī)模的微生物鑒定。Ji Bin等[62]使用PacBio測序平臺對兩個典型的廢水處理廠細菌菌群進行了研究，發(fā)現(xiàn)變形細菌和擬桿菌屬占兩個廢水處理廠的50%以上，該平臺可鑒定屬水平上總序列的68%。三代測序做到了高通量、長讀長，其能夠降低基因組拼接的成本，節(jié)省計算的內存和時間，在原理上也避免了PCR的擴增錯誤，同時可以直接應用在RNA測序、DNA甲基化等研究上。然而三代測序仍存在一些重要限制因素如成本高、堿基錯誤率高、實驗依賴DNA聚合酶的活性和生物信息軟件不夠豐富等。

1.5 生物傳感器技術

生物傳感器是由生物感受器和換能器兩大部分組成的分析裝置，檢測微生物時主要利用抗原（抗體）以及各種敏感酶、生物堿和基因序列等，若待測樣品與以上物質反應，便會產(chǎn)生生物相互作用，隨后信號轉換器可將其轉化為一些可測量的電信號，再由信號放大器進行讀取檢測[63]。通常用于快速檢測食源性病原體的生物傳感器有光學生物傳感器、電化學生物傳感器以及機械生物傳感器[64-65]。Izadi等[66]建立了一種基于DNA的金納米粒子改性的電化學生物傳感器來檢測蠟狀芽孢桿菌，生物傳感器的傳感元件由金納米顆粒和自組裝的nheA基因的單鏈DNA組成，其通過與靶DNA雜交而產(chǎn)生的生物傳感器，增加其電荷轉移阻力來進行蠟狀芽孢桿菌的檢測，該傳感器可以特異地從乳制品中檢測蠟狀芽孢桿菌的目標DNA序列。Song Yang等[67]研制了一種基于熒光共振能量轉移的生物傳感器來檢測腸炎沙門氏菌16S rRNA，對腸炎沙門氏菌的檢測限可達102CFU/mL。Kanayeva等[68]采用電化學生物傳感器可檢測生菜、牛奶、碎牛肉中的單核細胞增生李斯特氏菌，此研究中單核細胞增生性抗體通過生物素-鏈霉親和素鍵變成免疫磁性納米顆粒，以在2 h的免疫反應中捕獲樣品中的單核細胞增生李斯特菌。

生物傳感器技術檢測微生物具有快速、靈敏、操作簡單和對操作人員要求低等特點，但生物傳感器的應用也存在一些問題，病原體對每種基質的吸附方式不同，矩陣相關的可變性測量會導致目標菌的電容信號下降，還有些復雜食品基質因所含豐富蛋白質、脂肪等高密度成分，導致傳感器共振頻率降低，還有一些非致病菌的存在阻礙目標病原體向傳感器表面靠近，也會干擾致病菌的檢出，所以食物基質的復雜性限制了其靈敏度和特異性[69-71]，加上生物傳感器用于識別生物分子的原件其壽命相對較短，生產(chǎn)成本也比較高[72-74]，所以生物傳感器技術的使用受到了一定的限制，大多還處于研制階段。

1.6 流式細胞技術

流式細胞技術（flow cytometry，F(xiàn)CM）是基于細胞直接計數(shù)的一種微生物快速檢測方法，流式細胞計數(shù)裝置一般包括液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、信號收集與轉換系統(tǒng)、分析系統(tǒng)[75-76]。其使用激光對通過激光束的顆粒進行計數(shù)，從而實現(xiàn)細胞的定量觀察和定性分析，當顆?；蛘呒毎ㄟ^激光束的時候，會對光線產(chǎn)生折射和反射，此信號被探測器記錄下來，每通過一個細胞，就會產(chǎn)生一個峰值，最后根據(jù)峰值的個數(shù)得到細胞的數(shù)值[77]。FCM對食品中的活菌數(shù)直接進行檢測，速度快，無需增菌，可在90～100 min內出具檢測結果；靈敏度高，甚至可檢測出1 個活的微生物或活細胞；該檢測技術適用于水、液態(tài)加工食品、飲料、化妝品及藥品等行業(yè)[78-80]。劉道亮等[81]利用FCM能夠實現(xiàn)在100 min內對液態(tài)商品中的細菌總數(shù)進行實時、自動化檢測，檢測限達到101CFU/mL數(shù)量級。

流式細胞計數(shù)法因其高通量以及能夠識別細胞的死活，被應用在工廠等檢測領域。但是流式細胞技術在檢測時需要對樣品進行稀釋，其靈敏度會在一定程度上降低，常需要與傳感器技術等一起被聯(lián)合使用，且檢測過程中加入大量的熒光基團，使得后期的分析過程復雜，因此其應用受到限制[82]。

1.7 光譜技術

隨著光學儀器、光學技術以及計算機技術的快速發(fā)展，光譜檢測技術得以快速發(fā)展，拉曼光譜[83-84]技術和表面增強拉曼光譜技術、傅里葉變換紅外光譜技術被廣泛用于微生物的快速檢測。拉曼光譜技術是通過測定代謝分子反應物質分子內部化學鍵的情況，從而確定微生物的種類。Meisel等[85]證明了拉曼光譜法適用于檢測牛奶和肉制品中微生物單細胞水平的檢測，檢測限為103～109CFU/mL。de Plano等[86]使用拉曼光譜技術檢測金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌。還有將光譜技術與納米陣列相結合，制備表面增強拉曼光譜以提高其檢測能力[87-88]。傅里葉變換紅外光譜技術被用來檢測微生物是因為其可識別菌體細胞壁、細胞膜以及細胞內肽聚糖、磷脂雙分子層、蛋白質、核酸等成分化學鍵的振動情況，從而達到檢測微生物的目的，Davis等[89]使用傅里葉變換紅外光譜技術對大腸桿菌進行了檢測，Argyri等[90]還將傅里葉變換紅外光譜技術用于檢測變質牛肉片的菌落總數(shù)。

光譜檢測技術是一種新興的無損檢測技術，其具有檢測快速、安全高效、樣本需要量少和自動化程度高等優(yōu)點，但同時也存在一些問題，雖然拉曼光譜檢測微生物預處理步驟簡單，對菌體無損傷，但其圖像易受微生物生長環(huán)境、生長狀態(tài)以及樣本制作過程等因素的影響，且其檢測波長和樣品處理方式都不統(tǒng)一。傅里葉變換紅外光譜技術檢測微生物時對樣品的水分含量要求較高，樣品中應該盡量無水分，因為水分會影響樣品吸收峰的檢測。因此光譜技術還需要不斷發(fā)展來更好的應用在微生物的檢測領域。

1.8 質譜鑒定技術

質譜技術是一種根據(jù)離子產(chǎn)生的質量圖譜來確定樣品中分子組成的分析技術。質譜技術不僅可以對傳統(tǒng)的目標分析物進行定性和定量分析，還可以用于細菌的快速準確鑒定[91]。在微生物的分析中，通過單個質量峰對微生物進行鑒定，從而實現(xiàn)微生物鑒定的快速性和有效性，其檢測過程高度自動化，極大加強了其簡便性與應用廣泛性。微生物檢測常用的質譜技術主要包括氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質譜聯(lián)用技術（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、基質輔助激光解吸飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）及電噴霧質譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）等。Lau等[92]采用MALDITOFMS技術建立了真菌數(shù)據(jù)庫，涵蓋了76 種菌屬、152 個種類、294 個獨立菌株，并對421 株真菌的鑒定準確率達到了88.9%。Krishnamurthy等[93]利用蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌各自特有的蛋白質作為標志物，采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）鑒定了9 種不同種屬的細菌。其中，GC-MS技術主要用于分析微生物中的脂肪酸、糖類等小分子物質，MALDI-TOFMS技術對微生物檢測中，一般通過參考細菌圖譜對細菌的種類進行鑒定，此種方法適合大部分的細菌物種[94]，ESI-MS技術主要是通過分析蛋白質、脂質、核酸等大分子物質來鑒定微生物，完成對不同屬、種的區(qū)分[95]。

質譜技術在微生物檢驗中的應用具有明顯的優(yōu)勢，對樣品的要求很低，樣品可以不進行分離純化，直接進行測樣，該方法準確性高、操作簡單、可自動化，同時還具有高靈敏度、高通量、高特異性，所以在微生物檢測中得到快速發(fā)展[96]。但經(jīng)研究，該方法也具有一定的缺陷，其對結構較特殊、罕見的菌種、新型的菌種、混合菌等檢測較困難[97]。

食源性致病菌快速檢測技術主要包括上文所提到的幾種技術，其具體應用信息見表1。

表1 食源性致病菌檢測技術Table 1 Detection technologies for foodborne pathogens

2 結 語

近年來，已開發(fā)出許多檢測食源性病原體的方法，以解決食品安全和公共衛(wèi)生問題，特別是隨著對新鮮食品和短保質期食品的食用不斷增加，快速檢測技術更具市場，眾多學者在不同快速檢測技術上都不斷革新，在檢測時間、靈敏度以及準確度上都有了很大的提升，但也還存在著不足，需要國內外研究者不斷地完善和改進現(xiàn)有的檢測技術。一方面，幾乎所有的快速檢測技術都存在靈敏度不足的缺點，因此還需富集、培養(yǎng)等過程才可以得到檢測結果，免疫磁分離技術是一種經(jīng)常被用在前處理過程中以提高檢測靈敏度的技術，其已成功用于富集和分離多種病原體，可以有效消除樣品基質中的聚合酶抑制劑，從而在檢測致病菌時縮短了富集時間并提高了靈敏度?？焖贆z測技術發(fā)展的方向應符合食品安全檢測的要求，實現(xiàn)高精度、高效率、低成本方式在線監(jiān)測病原體。另一方面，人工智能、基因編輯、納米技術等前沿學科融入到食源性致病菌的快速檢測，也將成為未來的發(fā)展趨勢。同時，在檢測過程中，還可以根據(jù)檢測要求選擇適當?shù)募夹g，并且可以嘗試將未來多學科交叉結合使用，發(fā)揮各學科的優(yōu)勢，并實現(xiàn)優(yōu)勢互補，從而提高檢測的靈敏度、增加檢測準確性、縮短檢測時間。另外，國內現(xiàn)行的標準幾乎沒有針對食源性致病菌快速檢測的方法，無法滿足檢測和監(jiān)管的需求，因此還亟待制定一系列快速檢測技術的國家標準、行業(yè)標準、地方標準等，彌補快速檢測標準缺乏的現(xiàn)狀。

我國對食品安全快速檢測越來越重視，國務院印發(fā)的“十三五”國家食品安全規(guī)劃中“加快建設食品安全檢驗檢測體系”中強調了要加強食品快速檢測方法應用及評價的要求，新修訂的《中華人民共和國食品安全法》更是為食品檢測技術提供支持和保障，因此，食源性致病菌的快速檢測技術有著廣闊的應用前景。隨著科學技術的發(fā)展，儀器便攜化、智能化、數(shù)字化趨勢越來越明顯，快速、高效、簡單、環(huán)境污染小的快速檢測方法，是食品快速檢測技術的發(fā)展趨勢。未來，食源性致病菌檢測技術會朝著多種檢測技術相融合、通量更高、檢測速度更快、靈敏度更高、準確性更高、適用性更強、成本更低、可廣泛推廣和標準化的方向發(fā)展，為生產(chǎn)、加工、流通和銷售整個生產(chǎn)鏈的食品安全監(jiān)管保駕護航。