曹銀娟，韓 玲,*，余群力，林 娟，李維正，鄒小紅，韓廣星，韓明山

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅祁連牧歌實(shí)業(yè)公司，甘肅 張掖 734000；3.山東綠潤食品有限公司，山東 臨沂 276000；4.內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

冷凍是目前食品保藏中較為重要的貯藏方法，然而新鮮牛瘤胃在運(yùn)輸、貯藏、消費(fèi)過程中由于冷鏈技術(shù)不健全，溫度波動比較大，在被食用之前一直處于凍結(jié)和解凍（凍融循環(huán)）的過程[1]，因此反復(fù)凍融在商業(yè)中不可避免。然而，反復(fù)凍融對肉制品品質(zhì)會造成一定的影響，如色澤劣變、組織機(jī)械損傷、蛋白質(zhì)變性、解凍后水分損失增加、脂質(zhì)氧化等品質(zhì)劣變現(xiàn)象[2-3]。

目前已有相關(guān)研究證明反復(fù)凍融是影響肉品品質(zhì)變化的重要因素。反復(fù)凍融會引起重結(jié)晶現(xiàn)象的發(fā)生，致使冰晶數(shù)量減少和體積增大，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，損傷細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，加速蛋白質(zhì)氧化變性和汁液流失[4]。李銀等[5]研究發(fā)現(xiàn)牛肉中主要蛋白質(zhì)的降解導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)破壞，使肌肉持水能力下降。Kim等[2]指出豬肉冷凍時隨著冰晶體的形成，肌細(xì)胞受到機(jī)械損傷而破裂，大量水分滲出，同時肌纖維也會發(fā)生變形和斷裂，使肌肉持水能力下降，導(dǎo)致解凍后肌肉大量汁液流失。有研究發(fā)現(xiàn)豬肉肌原纖維蛋白降解程度的增加顯著加快了肌肉汁液的流失[6]。Zhou Feibai等[7]指出豬肉中氧化反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基也會引發(fā)肌纖維蛋白氧化，使其發(fā)生變性和降解。游輝煌[8]研究發(fā)現(xiàn)隨著凍融次數(shù)的增加，豬蹄感官品質(zhì)下降，可能是由于豬蹄中含有較高的膠原蛋白。然而，平滑肌蛋白組成和結(jié)構(gòu)均與骨骼肌存在差異，膠原蛋白含量較骨骼肌高10.1%[9]，而平滑肌在反復(fù)凍融過程中品質(zhì)穩(wěn)定性及引起品質(zhì)變化的生化過程尚不清楚。

因此，本實(shí)驗(yàn)以牛瘤胃為研究對象，探究了反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌品質(zhì)穩(wěn)定性變化及變化機(jī)理，旨在了解凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌品質(zhì)劣變的影響機(jī)制，以期為平滑肌肉用價值的開發(fā)、加工和品質(zhì)控制提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛瘤胃購自于張掖市萬禾草畜產(chǎn)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司，源于隨機(jī)選取的生長發(fā)育正常、健康無病、平均年齡3～4 歲體質(zhì)量（600±30）kg的6 頭公牛。將瘤胃置于保溫箱（放冰袋）運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

賴氨酸吡啶啉（lysine pyridinoline，LP）、羥賴氨酸吡啶啉（hydroxylysine pyridinoline，HP）、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；戊二醛 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS223S型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；H/T16MM臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水浴鍋 常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；JJ-2組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇國華電器有限公司；C-LM3B型數(shù)顯肌肉嫩度儀 北京天翔飛域科技有限公司；PHS-3C便攜式pH計 上海雷磁儀器廠；UV-1601酶標(biāo)儀 日本島津公司；JSM-5600LV掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集和制備

取瘤胃用蒸餾水將表面沖洗干凈，剔除筋膜及可見脂肪，用濾紙擦干表面水分并對案板、刀具及瘤胃用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液消毒至完全揮發(fā)。將肉樣切成質(zhì)量100 g左右的方塊，用聚乙烯食品保鮮袋包裝，樣品隨機(jī)分為6 組，每組3 份平行，在-18 ℃ 冷凍12 h、4 ℃ 解凍12 h（此為凍融1 次），分別在凍融0、1、2、3、4、5 次后測定相應(yīng)的指標(biāo)。

1.3.2β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶活力的測定

β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶活力均采用試劑盒進(jìn)行測定，具體操作和計算參照各試劑盒的說明書。

1.3.3 HP和LP含量測定

HP、LP含量的測定參考莎麗娜[10]的方法，取樣品1 g左右于50 mL離心管中，按1∶9（m/V）加入磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4），10 000 r/min冰浴勻漿。然后4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行測定。測定步驟及計算參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

使用掃描電子顯微鏡觀察牛瘤胃平滑肌微觀結(jié)構(gòu)，樣品制備方法參考常海軍[11]的方法并稍作修改。將樣品切割成2 mm×2 mm×5 mm的肉條在體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中于4 ℃下固定3 d，用蒸餾水徹底沖洗，樣品表面用離子濺射法涂覆金屬薄膜（10 nm），然后在掃描電子顯微鏡（20.0 kV）下放大300 倍觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.5 膠原蛋白熱溶解性測定

參考常海軍[11]的方法測定。以羥脯氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.217x-0.002 5，R2=0.999 8（其中x為羥脯氨酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）；y為吸光度）。羥脯氨酸的含量乘以系數(shù)7.25換算為膠原蛋白含量，其中上清液中的蛋白含量為可溶性膠原蛋白含量；沉淀中的蛋白含量為不溶性蛋白含量。膠原蛋白溶解性通過式（1）進(jìn)行計算。

1.3.6 pH值測定

參考Zuo Huixin等[12]的方法，將解凍后的樣品用便攜式pH計測定pH值，將探頭插入肉樣中，使其電極與牛瘤胃平滑肌肌肉組織充分接觸，待pH計讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)值，每個樣品測定3 次平行，結(jié)果取其平均值。

1.3.7 解凍損失率測定

在第n次冷凍之前測定樣品的質(zhì)量（mn1/g），解凍之后用濾紙擦拭樣品表面去除水分，再次稱質(zhì)量（mn2/g），第n次解凍損失率按式（2）計算。

1.3.8 剪切力測定

參照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測定 剪切力測定法》，將熟制平滑肌沿平行于肌纖維方向切取40 mm×10 mm的肉樣，將2～3 個樣品堆疊至樣品自然高度為10 mm后采用數(shù)顯肌肉嫩度儀自帶的“V”型剪切刀架測定剪切力，重復(fù)6 次取平均值，單位以kgf表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析法，各處理平均數(shù)間采用Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶活力的影響

β-葡糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶可降解肌內(nèi)膠原蛋白基質(zhì)多糖（蛋白多糖）[8]，而蛋白多糖是維持結(jié)締組織機(jī)械強(qiáng)度的主要成分，其降解可以改善肉的嫩度[13]。由圖1A可知，隨著凍融次數(shù)的增加，β-半乳糖苷酶活力先上升后下降，在凍融4 次時達(dá)到最大（13.26 U/L），顯著高于新鮮平滑?。?.79 U/L）（P＜0.05），可能原因是凍融處理可以弱化或破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；但凍融5 次時β-半乳糖苷酶活力下降至11.31 U/L，可能是凍融處理對酶本身的破壞性影響使得活力下降。由圖1B可知，隨著凍融次數(shù)的增加，β-葡糖醛酸酶活力呈波動式上升（P＜0.05），凍融5 次時β-葡糖醛酸酶活力與新鮮平滑肌相比增加了76.60%。說明牛瘤胃凍融過程肌內(nèi)膠原蛋白基質(zhì)多糖降解程度增加，這與Lee等[14]的研究結(jié)果一致。

圖1 反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌β-半乳糖苷酶活力（A）和β-葡糖醛酸酶活力（B）的變化Fig.1 Changes in β-galactosidase activity (A) and β-glucuronidase activity (B) in bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.2 凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌膠原蛋白HP和LP含量的影響

HP和LP是膠原蛋白交聯(lián)途徑中主要的穩(wěn)定交聯(lián)產(chǎn)物，其含量越高，嫩度越差，交聯(lián)是膠原蛋白的主要性質(zhì)，膠原蛋白在體內(nèi)合成后會發(fā)生不同程度的交聯(lián)[15]。如圖2A所示，HP含量隨凍融次數(shù)（0～4 次）的增加呈上升趨勢（P＜0.05），凍融4 次時較新鮮平滑肌上升了384.50%，凍融5 次時略有下降（P＞0.05）。如圖2B所示，隨凍融次數(shù)的增加，LP含量基本呈“直線”趨勢增加，凍融5 次時較新鮮平滑肌增加了325.93%。表明隨凍融次數(shù)的增加，肌肉中膠原蛋白的交聯(lián)度增大，與宦海珍[16]研究發(fā)現(xiàn)秘魯魷魚解凍過程中肌原纖維蛋白變性導(dǎo)致交聯(lián)物產(chǎn)生的結(jié)果一致。

圖2 反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌HP（A）和LP（B）含量的變化Fig.2 Changes in HP (A) and LP (B) contents in bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.3 凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌微觀結(jié)構(gòu)的影響

反復(fù)凍融過程中瘤胃結(jié)締組織結(jié)構(gòu)變化如圖3所示，新鮮牛瘤胃平滑肌整體上肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)整且緊密，肌束膜完整基本沒有破裂；凍融1 次時，牛瘤胃平滑肌肌纖維束之間有細(xì)小空隙，肌束膜和肌內(nèi)膜有輕微的裂痕，說明牛瘤胃平滑肌肌束膜發(fā)生了輕微的收縮。凍融3 次時，牛瘤胃平滑肌肌纖維結(jié)構(gòu)較為清晰，但肌纖維之間空隙增大，排列較松散；凍融5 次時，牛瘤胃平滑肌肌束膜及肌內(nèi)膜破損斷裂程度嚴(yán)重，肌纖維束間空隙增多且變大，肌纖維排列雜亂，可以觀察到肌纖維與肌內(nèi)膜明顯剖離，說明牛瘤胃平滑肌肌束膜收縮程度更為劇烈。隨著凍融次數(shù)增加，組成肌肉的各個肌束之間的縫隙明顯增多，顯示出組織結(jié)構(gòu)的弱化。即隨著冷凍-解凍次數(shù)的增加，牛瘤胃平滑肌肌纖維發(fā)生明顯斷裂、結(jié)締組織膜嚴(yán)重受損，使肌肉失去原有的完整性，可能是與凍融過程中蛋白質(zhì)的降解和冰晶體的機(jī)械破壞作用有關(guān)，這與李銀等[5]的研究結(jié)果一致。

圖3 反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.3 Changes in microstructure of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.4 凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌剪切力的影響

剪切力是肉品嫩度的直接反映，剪切力越小，肉嫩度越好[17]。由圖4可知，隨著凍融次數(shù)的增加，牛瘤胃平滑肌剪切力呈先上升再下降趨勢（P＜0.05），凍融1 次時達(dá)到最大（9.70 kgf），凍融5 次時較新鮮平滑肌下降了28.79%，其變化趨勢與Shanks等[18]對牛肉的相關(guān)品質(zhì)研究基本一致。剪切力在凍融1 次時顯著上升可能是因?yàn)閮鋈诤蟪炙ο陆祵?dǎo)致肌肉收縮，使肌纖維排列更加緊致；而凍融1 次后剪切力下降，一方面是因?yàn)楸щS著凍融次數(shù)增加反復(fù)形成和消失，使細(xì)胞膜和組織結(jié)構(gòu)不斷受到機(jī)械損傷而導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)降解和破裂，蛋白多糖降解，膠原蛋白溶解性增大，從而使牛瘤胃平滑肌肌肉質(zhì)地變軟[19-20]；另一方面，反復(fù)凍融后肌肉細(xì)胞失水、平滑肌間隙增大，也會導(dǎo)致剪切力降低[21]。常海軍[11]研究發(fā)現(xiàn)牛肉中膠原蛋白交聯(lián)度的增加使膠原蛋白的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，能增加肌肉結(jié)締組織強(qiáng)度，使肌肉剪切力增大，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不一致，可能是貯藏方式和肌肉種類不同所致[10-11]。

圖4 反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌剪切力的變化Fig.4 Changes in shear force of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.5 凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌膠原蛋白溶解性的影響

膠原蛋白溶解性是膠原蛋白的主要性質(zhì)，也是影響肉品嫩度的主要因素之一[22]。由圖5可知，隨凍融次數(shù)的增加，膠原蛋白溶解性顯著增加（P＜0.05），可能是因?yàn)閮鋈谶^程中冰晶的作用使平滑肌肌束膜和肌內(nèi)膜蛋白多糖降解、結(jié)締組織膜被破壞，增加了膠原蛋白溶解性，從而使剪切力下降，嫩度改善。凍融4 次時膠原蛋白溶解性較新鮮平滑肌增加了21.05%，隨凍融次數(shù)的進(jìn)一步增加變化不顯著（P＞0.05）。

圖5 反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌膠原蛋白溶解性的影響Fig.5 Changes in collagen solubility of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.6 凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌pH值的影響

pH值是影響肉品持水性的主要因素之一[23]。李婉竹等[24]研究表明在凍融循環(huán)過程中肌肉蛋白發(fā)生降解產(chǎn)生的氨基酸中，當(dāng)堿性自由氨基酸含量高于酸性自由氨基酸含量時，pH值就會升高，反之則減小。由圖6可知，隨著凍融次數(shù)的增加，pH值呈先上升后下降趨勢，凍融1 次時，較新鮮平滑肌上升了3.33%，可能是由于肌肉中的蛋白質(zhì)分解成胺類等堿性物質(zhì)。凍融5 次時pH值較新鮮平滑肌下降了3.06%，可能與反復(fù)凍融引起肌纖維及基質(zhì)中蛋白變性，影響肌肉組織內(nèi)酸堿平衡有關(guān)[4]。阿依木古麗等[25]研究發(fā)現(xiàn)隨著凍融次數(shù)的增加牛肉背最長肌的pH值顯著降低。

圖6 反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌pH值的變化Fig.6 Changes in pH of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.7 凍融次數(shù)對牛瘤胃平滑肌解凍損失率的影響

肉中的細(xì)胞液隨著凍融次數(shù)的增加不斷從肌肉組織內(nèi)部滲出，不僅影響其外觀，而且使肌肉中的營養(yǎng)成分和汁液流失增多[26]。解凍損失率是衡量肉品加工性能和營養(yǎng)成分損失程度的重要指標(biāo)，解凍損失率越高，保水性越差[27]。從圖7可以看出，牛瘤胃平滑肌解凍損失率隨凍融次數(shù)增加顯著升高（P＜0.05），主要是因?yàn)樵诜磸?fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌中冰晶不斷形成和消失，使組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜受到機(jī)械損害，解凍時細(xì)胞中的水分、營養(yǎng)成分和可溶性蛋白逐漸流失，最終導(dǎo)致牛瘤胃平滑肌的保水性下降[28]，這與Boonsumrej等[27]的研究結(jié)果一致。解凍損失率在前3 次凍融循環(huán)中增加了26.16%，在后2 次凍融循環(huán)中增加了64.96%，說明在凍融次數(shù)超過3 次時，保水性的下降速率加快。這可能是因?yàn)榕Ａ鑫钙交∷衷诶鋬鲞^程中體積增加使肌細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂[29]。

圖7 反復(fù)凍融過程中牛瘤胃平滑肌解凍損失率的變化Fig.7 Changes in thawing loss of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.8 牛瘤胃平滑肌品質(zhì)指標(biāo)與膠原蛋白降解、交聯(lián)指標(biāo)間相關(guān)性分析

由表1可知，在凍融循環(huán)過程中，剪切力與β-半乳糖苷酶活力、β-葡糖醛酸酶活力、HP含量、LP含量和膠原蛋白溶解性呈極顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.01）。結(jié)合前面這些指標(biāo)測定結(jié)果，可以說明隨著凍融次數(shù)的增加，肌內(nèi)膠原蛋白基質(zhì)多糖顯著降解、溶解性增大，結(jié)締組織弱化加劇，導(dǎo)致剪切力下降。Nishimura等研究表明牛肉肌束膜中的蛋白多糖顯著降解，加快了牛肉結(jié)締組織弱化，顯著改善了牛肉的嫩度[30]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。然而，有研究表明膠原蛋白交聯(lián)可提高剪切力，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出膠原蛋白交聯(lián)物HP和LP含量與剪切力呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），因此，牛瘤胃平滑肌嫩度改善主要取決于冰晶對肌肉的破壞和蛋白降解的作用，而蛋白交聯(lián)對其影響較小。解凍損失率與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與HP含量、LP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Liu Zelong等[31]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)與肉的保水性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Melody等認(rèn)為pH值降低是肉保水性下降的主要原因[32]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

表1 牛瘤胃平滑肌各指標(biāo)間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 1 Pearson correlation coefficients among various indicators

3 結(jié) 論

隨著凍融次數(shù)的增加，牛瘤胃平滑肌膠原蛋白降解程度（β-半乳糖苷酶活力、β-葡糖醛酸酶活力）增大，結(jié)締組織破壞嚴(yán)重，膠原蛋白溶解性增大，膠原蛋白交聯(lián)度增大，解凍損失率增大，使牛瘤胃平滑肌保水性下降。凍融超過1 次后，剪切力下降，說明平滑肌嫩度逐漸得到改善。然而，在凍融3 次后，剪切力下降速率變慢，解凍損失率升高速率加快。因此，從食用品質(zhì)和商業(yè)價值綜合考慮，凍融次數(shù)應(yīng)控制在3 次以內(nèi)。