林珩迅，何興興*，張成云，關(guān)文強(qiáng)*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

肉類因其富含高價(jià)值蛋白質(zhì)、B族維生素、微量元素和其他生物活性化合物，是補(bǔ)充人體所需營養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)食物來源[1]，中國作為全世界最大的肉類生產(chǎn)和消費(fèi)國，肉類年產(chǎn)量占全球總量1/4[2]。鮮肉最常規(guī)的貯藏方式是冷藏，既將肉貯藏在0～4 ℃溫度下，這對(duì)于細(xì)胞代謝和微生物生長的抑制作用有限，保質(zhì)期較短，無法達(dá)到長期貯藏的目的[3]。冰溫貯藏技術(shù)指將食物置于其冰溫帶（0 ℃與結(jié)冰溫度之間）進(jìn)行貯藏，冰溫貯藏既避免了凍結(jié)破壞食物組織結(jié)構(gòu)，又可以利用較低的溫度降低機(jī)體生理代謝，抑制微生物生長[4]，進(jìn)而起到延長食品保質(zhì)期的作用，現(xiàn)已被廣泛的運(yùn)用于果蔬[5-6]、海產(chǎn)品[7]及肉類[8]保鮮貯藏。許立興等[9]研究冰溫貯藏對(duì)雞肉品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)比4 ℃冷藏，冰溫對(duì)延緩雞肉品質(zhì)劣變效果更顯著，可將保質(zhì)期延長13 d。辜雪冬等[10]發(fā)現(xiàn)，冰溫條件下牦牛肉的保水性及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性均優(yōu)于冷藏。此外，有研究表明低溫更有利于維持鮮肉的感官品質(zhì)及衛(wèi)生指標(biāo)[11]。

糖酵解是指葡萄糖在無氧條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楸岵⑸葾TP所經(jīng)歷的一系列反應(yīng)，禽畜宰后肌肉糖酵解及相關(guān)代謝途徑如圖1所示。為了維持代謝平衡，宰后肌肉中的糖原和葡萄糖通過糖酵解途徑分解產(chǎn)生丙酮酸。在有氧條件下丙酮酸會(huì)繼續(xù)進(jìn)行有氧分解，但由于宰后肌肉血液流動(dòng)和供氧停止，糖酵解過程產(chǎn)生的丙酮酸會(huì)在乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的催化下生成糖酵解終產(chǎn)物——乳酸[12]。丙酮酸還原為乳酸的過程又被成為單純?nèi)樗岚l(fā)酵過程。糖酵解速率直接影響肉宰后品質(zhì)[13]。因此研究肉貯藏過程糖酵解途徑中關(guān)鍵控制酶的活性變化規(guī)律，明確貯藏溫度對(duì)這些關(guān)鍵酶活性的影響，對(duì)確保宰后肉品質(zhì)具有重要意義，同時(shí)可為鮮肉貯藏方式的選擇提供理論指導(dǎo)。

圖1 肌肉宰后糖酵解及相關(guān)代謝途徑[14]Fig.1 Glycolysis and related metabolic pathways in postmortem muscle[14]

目前，冰溫貯藏技術(shù)已被應(yīng)用于各類禽畜肉的宰后保鮮，但是從糖酵解代謝機(jī)理角度來探討冰溫條件對(duì)鮮肉貯藏過程中品質(zhì)及糖酵解相關(guān)代謝酶活性的變化規(guī)律鮮有報(bào)道。本研究以豬里脊肉為原料，以（4.0±0.2）℃冷藏作為對(duì)照，研究（-1.0±0.2）℃冰溫貯藏對(duì)豬肉品質(zhì)及宰后糖酵解途徑中相關(guān)酶活性的影響，以期為冰溫貯藏技術(shù)在肉及肉制品加工貯藏產(chǎn)業(yè)中的運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬里脊肉（‘大白豬’）購自天津二商迎賓肉類食品有限公司。選擇體質(zhì)量、身體健康狀況相近的適齡大白豬，屠宰后立即取8 條脊椎骨內(nèi)側(cè)小里脊條，放入內(nèi)置冰塊的便攜式保溫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

聚乙烯自封袋購自桐城市名生復(fù)合包裝有限公司。

磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、ADP、1,6-二磷酸果糖、NADH、3-磷酸甘油酸、ALD、GAPDH、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、β-巰基乙醇、LDH、PGK、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 上海源葉生物有限公司；6-磷酸葡萄糖、G6PDH、PK、聚乙烯吡咯烷酮、Tris-HCl、6-磷酸果糖、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、PGK檢測(cè)試劑盒、G6PDH檢測(cè)試劑盒、PK檢測(cè)試劑盒、HK檢測(cè)試劑盒、GAPDH檢測(cè)試劑盒、PFK檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；TPI檢測(cè)試劑盒 上海酶聯(lián)生物有限公司；HK、3-磷酸甘油醛、TPI、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、PFK、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES）、ALD檢測(cè)試劑盒、LDH檢測(cè)試劑盒 美國Sigma公司；KCl、MgSO4、葡萄糖 福晨化學(xué)試劑有限公司；甘油 天津大茂化學(xué)試劑公司；二硫赤鮮醇上海生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Testo 205便攜式pH計(jì) 德圖儀表（深圳）有限公司；ME204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；A41-1012-119R.B（USA-Dbs）色差儀 美國Hunter Lab公司；TG16-WS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Spark 10M-酶標(biāo)儀 帝肯上海貿(mào)易有限公司；FA2004A電子天平 上海精天儀器有限公司；GQB-700KB溫度梯度箱 天津捷盛東輝保鮮科技有限公司；FLUKO勻漿機(jī)FA25 上海魯碩實(shí)業(yè)有限公司；IKA T10高速組織勻漿機(jī) 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

剔除小里脊條表面脂肪、筋膜后分割成48 塊大小約為6 cm×4 cm×2 cm、質(zhì)量為40 g左右長方體小塊，采用自封袋包裝，分別置于（4.0±0.2）℃和（-1.0±0.2）℃溫度梯度箱貯藏，整個(gè)過程在1 h內(nèi)完成。分別于0.5、2、6、12、24、72、120、168 h取樣，進(jìn)行汁液損失率、色澤、pH值測(cè)定，然后迅速采用液氮凍結(jié)置于-80 ℃冰箱貯藏待后續(xù)相關(guān)酶活力測(cè)定。

1.3.2 汁液損失率測(cè)定

參照Honikel[15]的方法，準(zhǔn)確稱量樣品貯藏前質(zhì)量（m1/g）、貯藏后質(zhì)量（m2/g），根據(jù)下式計(jì)算汁液損失率。

1.3.3 色澤測(cè)定

使用色差儀對(duì)豬里脊肉進(jìn)行色澤測(cè)定，每塊樣品分別測(cè)定3 次，每次取不同的面，記錄L*值（亮度）、a*值（紅度）和b*值（黃度），結(jié)果取平均值。

1.3.4 pH值測(cè)定

使用Testo 205便攜式pH計(jì)測(cè)定樣品pH值。將探頭插入樣品幾何中心，每次穿刺深度大于2 cm，保證肌肉組織與探頭充分接觸，待示數(shù)穩(wěn)定后直接讀數(shù)，每塊樣品重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 酶活力測(cè)定

1.3.5.1 粗酶液的制備

參考王芳[16]的方法并稍作修改。稱取樣品10 g，加30 mL提取液（50 mmol/Lβ-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)12.5%甘油、8 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris-HCl、0.5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.5）后在液氮條件下研磨，將肌肉組織勻漿后全部裝入離心管中，5 095×g、4 ℃下離心10～15 min，收集上清液，在4 ℃低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 酶活力的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用酶偶聯(lián)法測(cè)定糖酵解及相關(guān)代謝途徑中9 種酶的活力[17]。該法利用的原理為NADH和NADPH均在340 nm波長處有光吸收，并且都能產(chǎn)生熒光，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為340 nm和460 nm，而NAD+和NADP+則無此特性。向反應(yīng)體系中加入過量的底物、輔助因子和偶聯(lián)酶，使底物在待測(cè)酶、偶聯(lián)酶催化下反應(yīng)，生成或消耗NADH和NADPH。使用酶標(biāo)儀測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)340 nm及460 nm波長處吸光度的變化，計(jì)算出相應(yīng)酶的活力。各酶活力測(cè)定具體操作和計(jì)算公式參照各試劑盒的說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用Excel 2010和Origin 9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）以及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度對(duì)豬肉汁液損失率的影響

豬肉宰后會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜生理生化反應(yīng)，導(dǎo)致肌肉纖維蛋白的持水性降低，發(fā)生不同程度的汁液流失且伴隨營養(yǎng)物質(zhì)損失。豬肉的保水能力是重要的品質(zhì)參數(shù)[18]。由圖2可知，隨著宰后時(shí)間的延長，豬肉的汁液損失率逐漸升高。在168 h時(shí)，4 ℃貯藏條件下豬肉的汁液損失率為2.16%，-1 ℃貯藏條件下豬肉的汁液損失率為1.73%，在25 h后，-1 ℃樣品汁液損失率均低于4 ℃樣品（P＜0.05）。說明冰溫貯藏條件有利于降低豬肉宰后汁液損失。You等[19]在過冷貯藏對(duì)牛排品質(zhì)的影響研究中得出相似結(jié)論。

圖2 不同貯藏溫度對(duì)汁液損失率的影響Fig.2 Effects of different storage temperatures on drip loss

2.2 不同貯藏溫度對(duì)豬肉色澤的影響

貯藏期間微生物滋生和自身生理生化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肉的色澤發(fā)生變化。色澤是評(píng)價(jià)鮮肉品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)之一，直接影響消費(fèi)者的購買欲望[20]。由圖3A可知，在貯藏期間肉的L*值呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，貯藏初期L*值升高是因?yàn)橹簼B出引起肉表面折光率變化[21]，隨著貯藏時(shí)間的延長，肌肉長期暴露在空氣中，肌紅蛋白被氧化成高鐵肌紅蛋白，亮度下降[22]。a*值的變化如圖3B所示，貯藏期間豬肉的a*值先減小后增大。宰后豬肉中肌紅蛋白與空氣中的氧氣接觸迅速轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色的氧合肌紅蛋白，使得鮮肉a*值初值處于較高水平[23]；但隨著氧化的進(jìn)行，高鐵肌紅蛋白逐漸取代氧合肌紅蛋白，肉的顏色從鮮紅色向深褐色轉(zhuǎn)變，a*值下降；而后期a*值再次增大可能是肉中某些乳酸菌及其他微生物的作用，導(dǎo)致高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為具有紅色澤的肌紅蛋白衍生物所致[24]。-1 ℃貯藏組a*值則大于4 ℃貯藏組，這與Christensen等[25]的研究結(jié)論相同，過高的溫度導(dǎo)致可溶性肌紅蛋白含量降低，a*值降低。豬肉貯藏過程中b*值變化趨勢(shì)和L*值變化趨勢(shì)類似（圖3C），b*值的變化可能與豬肉內(nèi)部一系列化學(xué)反應(yīng)及脂肪氧化有關(guān)。整體來看，貯藏期間-1 ℃貯藏條件下的豬肉L*值與b*值均小于4 ℃貯藏組，這是因?yàn)? ℃貯藏組汁液損失更為嚴(yán)重，對(duì)肉表面折光率影響更大，導(dǎo)致L*值更高。

圖3 不同貯藏溫度對(duì)色差值的影響Fig.3 Effect of different storage temperatures on color difference

2.3 不同貯藏溫度對(duì)豬肉pH值的影響

動(dòng)物肌肉一般呈中性，但宰后由于肌肉進(jìn)行無氧代謝產(chǎn)生乳酸，pH值降低。當(dāng)pH值下降至極限值后，隨著糖酵解酶失活及蛋白質(zhì)分解所產(chǎn)生的氨類及胺類等堿性含氮物質(zhì)，肉的pH值逐漸升高。pH值的下降速率與極限pH值直接影響肉的品質(zhì)[26]。

如圖4所示，在宰后24 h內(nèi)，-1 ℃和4 ℃貯藏條件下的豬肉pH值均值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別由最初的6.38和6.33分別降至5.56和5.51，之后隨著貯藏時(shí)間的延長，pH值逐漸升高。與4 ℃貯藏相比，-1 ℃貯藏的豬肉樣品pH值下降速率更為緩慢且極限pH值更高。說明冰溫可以減小宰后pH值的下降程度，進(jìn)而延緩豬肉成熟進(jìn)程。李培迪[27]在冰溫貯藏羊肉的研究中得到了相同的結(jié)論。

圖4 不同貯藏溫度對(duì)豬肉pH值的影響Fig.4 Effect of different storage temperatures on pH

2.4 不同貯藏溫度對(duì)糖酵解及相關(guān)代謝途徑酶活力的影響

糖酵解影響著豬肉宰后的成熟與腐敗，糖酵解及相關(guān)代謝途徑酶活性的變化對(duì)肉品質(zhì)的發(fā)展至關(guān)重要[28]，不同溫度貯藏過程中豬里脊肉糖酵解酶活力變規(guī)律化如圖5所示。

由圖5可知，隨著貯藏時(shí)間延長，PFK、ALD、GAPDH、PGK、PK、G6PDH活力逐漸降低最后穩(wěn)定，HK、TPI、LDH活力在貯藏初期急劇升高后逐漸降低，這與鄭曉寒[29]的研究結(jié)果一致。宰后ATP的快速消耗與磷酸肌酸緩沖體系的消耗會(huì)在短期內(nèi)提高HK、TPI、LDH等酶活力，但隨著pH值的不斷降低，逐漸偏離酶的最適pH值，且某些代謝產(chǎn)物對(duì)酶活性具有抑制作用，因此貯藏中后期這些酶活力不斷下降。

豬肉宰后由于血液循環(huán)停止，肌肉供氧中斷，主要進(jìn)行糖酵解反應(yīng)。在糖酵解反應(yīng)中，HK、PFK催化的反應(yīng)為不可逆反應(yīng)，ALD和PFK對(duì)糖酵解的調(diào)控有著至關(guān)重要的作用。在無氧條件下，糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸經(jīng)單純?nèi)樗岚l(fā)酵最終被還原生成乳酸，催化上述反應(yīng)的酶為LDH，其活力能直接反映豬肉宰后無氧代謝的能力[30]。由圖5可知，在0.5～12 h貯藏期間，-1 ℃處理組樣品中HK、PFK、LDH活力顯著低于4 ℃處理組（P＜0.05），說明冰溫可以有效降低糖酵解關(guān)鍵調(diào)控酶活力。冰溫對(duì)于PGK活性也有一定的抑制效果。不同溫度處理對(duì)ALD、TPI、GAPDH、PK活性影響的效果差異不大。除糖酵解途徑外，宰后少部分葡萄糖進(jìn)入戊糖磷酸途徑產(chǎn)生五碳糖、二氧化碳、無機(jī)磷酸和NADPH，G6PDH是促使葡萄糖分子的代謝轉(zhuǎn)移至戊糖磷酸途徑的關(guān)鍵酶。在宰后2～12 h內(nèi)，-1 ℃條件下G6PDH活力顯著高于4 ℃處理組，說明4 ℃條件下豬肉的分解代謝速率比-1 ℃條件下更快[31]。

圖5 不同貯藏溫度對(duì)糖酵解及相關(guān)代謝途徑酶活力的影響Fig.5 Effects of different storage temperatures on glycolytic enzyme activities

2.5 糖酵解途徑相關(guān)酶活力及豬肉品質(zhì)間的相關(guān)性分析

糖酵解速率直接影響肉宰后乳酸堆積，進(jìn)而改變pH值變化速率及極限pH值，最終造成肉的色澤、持水力等品質(zhì)差異[32]。本課題前期研究了豬肉宰后乳酸含量的變化[31]，因此將本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的4 ℃與-1 ℃貯藏下豬肉相關(guān)指標(biāo)及乳酸含量進(jìn)行Perason相關(guān)性分析，結(jié)果分別見表1、2。

表1 4 ℃貯藏條件下糖酵解及相關(guān)途徑中酶活力及豬肉品質(zhì)間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between glycolytic enzyme activities and pork quality during storage at 4 ℃

表2 -1 ℃貯藏條件下糖酵解途徑中相關(guān)酶活力及豬肉品質(zhì)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between glycolytic enzyme activities and pork quality during storage at -1 ℃

如表1、2所示，在4 ℃和-1 ℃條件下，豬肉的pH值與乳酸含量及LDH活力呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），乳酸含量與LDH活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。此外，4 ℃條件下，乳酸含量與HK、TPI、LDH活力呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01）。在糖酵解的過程中，肌糖原被分解并經(jīng)過一系列的反應(yīng)最終產(chǎn)生乳酸，乳酸含量直接影響肉宰后pH值，隨著乳酸含量的增加，pH值不斷下降至及極限值；貯藏后期，底物的消耗、糖酵解及相關(guān)酶活力逐漸降低及蛋白質(zhì)變性產(chǎn)生胺及氨類堿性物質(zhì)，導(dǎo)致pH值逐漸升高最后趨于平緩。說明冰溫環(huán)境通過抑制貯藏前期HK、PFK、LDH等糖酵解酶及相關(guān)代謝關(guān)鍵酶活力，減緩糖酵解反應(yīng)速率，延緩乳酸積累，從而控制貯藏前期pH值下降速率，延緩豬肉品質(zhì)劣變。

在4 ℃和-1 ℃條件下，pH值與L*值和b*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與a*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。Moreno等[33]研究表明，pH值下降速率和程度與肉的品質(zhì)密切相關(guān)，極限pH值越高，肉的保水能力越好，汁液損失越少，這與本文的結(jié)果一致。pH值下降速率過快，肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而大大降低其保水能力，導(dǎo)致肉汁液損失嚴(yán)重、顏色蒼白、質(zhì)地松軟，被稱為PSE（pale, soft, and exudative）肉。相反，pH下值降速率過慢，則會(huì)造成外表干燥，質(zhì)地粗硬，形成色澤深暗的DFD（dark, firm and dry）肉[34]。

糖酵解酶活力之間同樣存在一定的相關(guān)性。4 ℃與-1 ℃環(huán)境下，HK活力與PFK活力呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.717和0.713，這與李喬等[35]的研究結(jié)論相同。糖酵解反應(yīng)是一系列復(fù)雜的反應(yīng)，除溫度、pH值等直接影響因素外，還受底物濃度、激活劑、抑制劑等間接因素影響。HK活性受PFK活性的間接調(diào)控，因?yàn)镠K活性與6-磷酸葡萄糖濃度有關(guān)，當(dāng)PFK活性降低時(shí)，6-磷酸葡萄糖積累并導(dǎo)致HK活性下降。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了豬里脊肉在冰溫（-1 ℃）和冷藏（4 ℃）貯藏條件下品質(zhì)指標(biāo)和宰后糖酵解及相關(guān)代謝途徑中9 種酶的活力變化。結(jié)果表明：-1 ℃處理組樣品汁液損失率、色澤、pH值等品質(zhì)指標(biāo)均優(yōu)于4 ℃處理組樣品。貯藏初期，-1 ℃處理組的HK、PFK、LDH活力顯著低于4 ℃處理組。綜合各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)以及酶活力指標(biāo)可知，冰溫通過抑制貯藏前期HK、PFK、LDH等糖酵解酶活性，減緩乳酸堆積及肉pH值降低，改善豬肉貯藏品質(zhì)。雖然本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了冰溫可以通過影響糖酵解酶活性進(jìn)而改變?nèi)庠谫A藏過程中的乳酸含量、間接影響著肉品質(zhì)的變化，但肉的品質(zhì)還受到品種、飼養(yǎng)條件、屠宰方式、微生物侵染等因素的綜合影響。本實(shí)驗(yàn)通過研究冰溫貯藏對(duì)豬肉宰后品質(zhì)及糖酵解途徑相關(guān)酶活性的影響，揭示了冰溫貯藏對(duì)豬肉宰后糖酵解代謝與品質(zhì)之間影響機(jī)制，對(duì)于肉類貯藏條件的優(yōu)化及貯藏過程種的代謝研究與控制具有一定參考價(jià)值，為豬肉宰后貯藏保鮮提供了指導(dǎo)思路。