何俊瑜，顧津羽，胡春梅，宋雅萍，田 丹，肖桂云，任艷芳,,*

（1.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

病害是導(dǎo)致果蔬采后品質(zhì)下降和經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一，化學(xué)合成殺菌劑是當(dāng)前控制病害的主要手段。然而隨著長期使用化學(xué)藥劑所帶來的病原菌抗藥性、環(huán)境污染和健康風(fēng)險等問題的日趨嚴(yán)重，人們開始尋找安全、環(huán)保、高效的替代品以減少化學(xué)藥劑的使用[1]。目前，采用外源誘抗劑誘導(dǎo)和激發(fā)果蔬自身的抗病性已成為控制采后病害的新途徑[2]。

水楊酸（salicylic acid，SA）和一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物體內(nèi)普遍存在的兩種重要的活性物質(zhì)，不僅廣泛參與調(diào)控植物的生長和發(fā)育過程，而且能夠誘導(dǎo)植物對生物和非生物脅迫的抗性反應(yīng)[3-4]。近年來，許多研究表明SA和NO可以作為信號分子激活或誘導(dǎo)果實體內(nèi)的防御機(jī)制，增強(qiáng)果蔬的系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR），從而減少病害導(dǎo)致的果蔬腐爛及品質(zhì)劣變[5-7]。如采前乙酰水楊酸處理可以通過激活果實的苯丙烷代謝途徑、增強(qiáng)過氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）活性，從而誘導(dǎo)采后哈密瓜的抗病性[8]；SA處理顯著提高了溫州蜜柑果皮中H2O2和一些防御代謝產(chǎn)物的含量，同時促進(jìn)了果實中親油性聚羥基黃酮積累，從而抑制病原菌的生長[9]；外源NO處理明顯提高了甜瓜、火龍果、獼猴桃等采后果實中苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）、POD、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）和幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）的活性及抗病物質(zhì)（總酚、類黃酮、木質(zhì)素）的積累[6,10-11]。敬媛媛等[12]發(fā)現(xiàn)NO可以通過調(diào)節(jié)活性氧代謝提高甜瓜對采后病害的抗性。此外，也有研究表明SA和NO具有直接殺菌作用。如He Junyu等[13]發(fā)現(xiàn)SA能夠直接抑制Colletotichum gloeosporioides菌絲的生長，降低芒果采后炭疽病發(fā)生。Hu Lingang等[14]報道0.25～1.00 g/100 mL硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）（NO供體）能夠直接抑制Fusarium sulphureum的生長，防治馬鈴薯干腐病。

近年來研究發(fā)現(xiàn)SA和NO作為信號分子在誘導(dǎo)采后果實抗病性中表現(xiàn)出許多類似的防護(hù)作用機(jī)制，如激活相同的抗病相關(guān)蛋白或酶活性、促進(jìn)抗病物質(zhì)的積累、調(diào)節(jié)活性氧平衡等[9-10,15]，表明SA和NO在參與誘導(dǎo)果實采后的抗病性中并不是孤立存在的，可能存在相互作用。李翠丹等[16]研究表明NO可能參與SA誘導(dǎo)的采后番茄果實抗病反應(yīng)。Shi Jingying等[17]研究發(fā)現(xiàn)NO通過促進(jìn)桃果實中SA積累誘導(dǎo)了果實對Monilinia fructicola的抗病性。目前，有關(guān)SA和NO二者互作關(guān)系的研究主要集中在植物的抗鹽[3]、抗旱[18]和抗重金屬[19-20]等非生物脅迫下，且表現(xiàn)出協(xié)同增效作用，而關(guān)于SA和NO在誘導(dǎo)植物抗病性中互作效應(yīng)的研究仍十分缺乏，二者之間是否存在協(xié)同作用尚不清楚。

芒果（Mangifera indicaL.）是世界上重要的熱帶水果，其色澤誘人、口感香甜，且富含豐富的營養(yǎng)，深受各國消費者喜愛。然而芒果果實采后極易受到各種病原物侵染，其中炭疽病是危害最為嚴(yán)重的一種病害，可導(dǎo)致芒果采后損失率高達(dá)30%～60%[21]。因此，如何控制采后芒果的腐爛是一個亟需解決的問題。前人及本課題組研究表明SA和NO單獨處理均可明顯提高采后芒果的抗病性，降低貯藏期間果實的發(fā)病率，提高貯藏品質(zhì)[13,22-23]，但SA和NO在抗病誘導(dǎo)過程中是否存在協(xié)同作用，目前還鮮見有關(guān)研究報道。為此，本實驗以芒果果實為材料，采用SA和SNP單獨及復(fù)合處理，重點研究其對接種炭疽病菌生長、果實相關(guān)抗病酶活性和抗病物質(zhì)含量的影響，探討SA和NO誘導(dǎo)采后芒果果實抗病性的協(xié)同效應(yīng)和可能的機(jī)制，為今后更好地利用誘抗劑控制園藝產(chǎn)品采后病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為‘臺農(nóng)’芒果（Mangifera indicaLinn.cv.Tainong），采自廣西省百色市果園，果實為7～8成熟，采摘后當(dāng)天常溫運(yùn)回貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗室。挑選果色均一、果形正常、無機(jī)械和病害損傷的新鮮果實用于后續(xù)實驗。

水楊酸（分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硝普鈉 美國Sigma-Aldrich公司；L-苯丙氨酸、幾丁質(zhì)、蝸牛酶、昆布多糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；其他常用試劑和藥品（均為分析純）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch全波長酶標(biāo)儀 美國Bio Tek儀器有限公司；5804R型高速冷凍離心機(jī) 上海艾本德中國有限公司；S210-K pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DL-CJ-2NDII超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；JXFSTPRP-48冷凍研磨儀 上海凈信科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實處理

將挑選好的果實用體積分?jǐn)?shù)0.05%次氯酸鈉（有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥10%）浸泡3 min，無菌水沖洗3 次后室溫條件下自然晾干。將果實隨機(jī)分成4 組，分別進(jìn)行蒸餾水（對照組）、2 mmol/L SA（SA處理組）、0.25 mmol/L SNP（SNP處理組）、2 mmol/L SA+0.25 mmol/L SNP（SA+SNP處理組）浸果處理5 min，SA和SNP處理濃度為本實驗前期篩選出具有較好保鮮和抑制病害的濃度[13,24]。之后取出自然晾干。將芒果放入鋪有多層軟紙的塑料盒中室溫下誘導(dǎo)24 h后，進(jìn)行炭疽病菌接種。接種后的果實分成兩組，一組用于病斑直徑和發(fā)病率的觀察和測定，每2 d統(tǒng)計一次果實病斑直徑和發(fā)病率；每個處理30 個果，重復(fù)3 次。另一組用于果實取樣測定抗病相關(guān)指標(biāo)，每2 d取一次樣，取樣部位為距離接種病斑邊緣0.5～1.5 cm的果肉組織，樣品用液氮迅速冷凍后，裝入錫箔紙袋中于-80 ℃冰箱保存；每個處理40 個果，重復(fù)3 次。所有果實均在（25±1）℃、相對濕度90%～95%的條件下貯藏。

1.3.2 果實損傷接種

損傷接種參照He Junyu等[13]的方法。接種前，取28 ℃下PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的芒果炭疽病病菌（Colletotichum gloeosporioidesPenz），在無菌條件下用無菌水（含體積分?jǐn)?shù)0.01% Tween-80）配制成孢子懸浮液，并用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1.0×106spores/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。接種時，芒果果實表面先用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液擦拭滅菌后，用滅菌釘在果實赤道表面刺1 個孔（深3 mm、直徑4 mm），在孔中注入20 μL孢子懸浮液。

1.3.3 病斑直徑和發(fā)病率測定

病斑直徑測定采用十字交叉法，每次測定10 個果實，結(jié)果取平均值，單位為cm。病斑直徑≥4.5 mm則確定為發(fā)病。發(fā)病率按下式計算。

1.3.4 抗病物質(zhì)總酚、木質(zhì)素、類黃酮含量測定

總酚含量的測定采用Folin-Cioealteu法[13]，以每克鮮果實含有沒食子酸的質(zhì)量表示，單位為mg/g。

木質(zhì)素含量測定參考He Junyu等[13]的方法，以含每克鮮果實的反應(yīng)液在280 nm波長處的光密度值（OD280nm）表示。

類黃酮含量測定采用Li Guangjin等[25]的方法，略有調(diào)整，將1 mL提取物添加到0.3 mL 5 g/100 mL NaNO2中，6 min后，加入150 μL 10 g/100 mL AlCl3·6H2O，5 min后加入0.5 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，在510 nm波長處測定吸光度，其含量表示為每克鮮質(zhì)量中含有的蘆丁質(zhì)量，單位為mg/g。

1.3.5 抗病相關(guān)酶活力測定

PAL、PPO、GLU和CHI活力測定參考He Junyu等[13]的方法。以每克鮮果實每小時290 nm波長處吸光度增加0.01為1 個PAL活力單位（U）；以每分鐘每克鮮果實420 nm波長處吸光度增加0.01為1 個PPO活力單位（U）；以每克鮮果實樣品每秒酶分解昆布多糖產(chǎn)生1 nmol葡萄糖為一個GLU活力單位（U）；以每小時每克鮮果實樣品中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μmolN-乙酰葡萄糖胺為一個CHI活力單位（U）。

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4 hydroxylase，C4H）和對香豆酰-CoA連接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）活力的測定參照范存斐等[5]的方法。以反應(yīng)液每分鐘在340 nm波長處吸光度增加0.01為一個C4H活力單位（U）；以反應(yīng)液每分鐘在333 nm波長處吸光度增加0.001為一個4CL活力單位（U）。POD活力測定參考Ren Yanfang等[24]的方法，以反應(yīng)液每分鐘內(nèi)在470 nm波長處吸光度增加1為一個POD活力單位（U）。

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的測定參照Goffner等[26]的方法并略作修改。取冷凍的果肉組織3 g，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.25，含15 mmol/Lβ-巰基乙醇、2 g/100 mL聚乙二醇和1 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮），冰浴下充分研磨成勻漿，在4 ℃、12 500 r/min下離心25 min，上清液用于CAD活力測定。以反應(yīng)液每分鐘內(nèi)340 nm波長處吸光度變化0.001為1 個CAD活力單位（U）。

以上酶活力單位均為U/g。

1.3.6 丙二醛和H2O2含量的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法[24]，用nmol/g表示。H2O2含量采用四氯化鈦法[24]，用μmol/g表示。單位均以鮮質(zhì)量計。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和皮爾遜相關(guān)性分析；利用鄧肯氏多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著性水平為0.05。采用OriginPro 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對接種炭疽病菌后芒果發(fā)病率和病斑直徑的影響

與對照相比，SA和SNP無論單獨處理還是復(fù)合處理均明顯減緩了接種芒果炭疽病的發(fā)病進(jìn)程（圖1A），降低了病斑直徑（圖1B），且以復(fù)合處理的效果最佳。接種炭疽病菌后，對照果實在6 d時全部染病，而此時SA、SNP和SA+SNP處理組的發(fā)病率分別為對照組的80.27%、77.82%和70.64%。在接種后第10天，SA、SNP和SA+SNP處理組病斑直徑分別比對照組降低了19.80%、22.64%和35.87%。

圖1 SA和SNP處理對接種炭疽病菌后芒果果實發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.1 Effects of SA and SNP treatment on disease incidence (A) and lesion diameter (B) of mango fruits inoculated with C.gloeosporioides

2.2 不同處理對接種炭疽病菌后芒果MDA和H2O2含量的影響

MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一，其含量是衡量膜脂損傷程度的一個指標(biāo)。如圖2A所示，在接種炭疽病菌后，各處理組芒果果實MDA含量均呈上升趨勢。與對照組相比，SA、SNP單一和復(fù)合處理組的MDA含量均保持較低水平。在接種后10 d，SA+SNP處理組的芒果果實中MDA含量最低，分別為對照組、SA和SNP處理組的60.43%、80.08%和85.51%，說明SA與SNP復(fù)合處理可有效降低接種病原菌后果實細(xì)胞膜的傷害程度。

圖2B顯示，接種后不同處理組果實中H2O2含量明顯上升，在接種后2 d時達(dá)到峰值，此時SA、SNP單一和復(fù)合處理組的H2O2含量顯著高于對照組（P＜0.05），分別較對照組高13.64%、17.33%和23.55%。之后H2O2含量迅速下降，接種4 d后H2O2含量又持續(xù)增加，與對照組相比，SA、SNP單一和復(fù)合處理降低了H2O2含量的增加幅度，接種10 d后，其H2O2含量分別為對照組的78.51%、74.03%和66.28%（P＜0.05）。可見，SA和SNP處理明顯增加了接種果實初期H2O2含量，并有效降低后期H2O2的積累，從而降低膜脂過氧化程度。

圖2 SA和SNP處理對接種炭疽病后芒果果實中MDA（A）和H2O2（B）含量的影響Fig.2 Effects of SA and SNP treatment on the contents of MDA (A)and H2O2 (B) in mango fruit inoculated with C.gloeosporioides

2.3 不同處理對接種炭疽病菌后芒果苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力的影響

由圖3A可知，接種炭疽病菌后對照組和各處理組芒果果實PAL活力總體表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢，且各處理組的果實中PAL活力整體較對照組高。在接種后第10天，SA、SNP和SA+SNP處理組PAL活力分別為對照組的1.21、1.58 倍和1.42 倍。在整個貯藏期間，除了接種后第10天，SNP處理組中PAL活力最高外，總體以SA+SNP處理組PAL活力最高。

如圖3B、C所示，接種炭疽病后芒果果實C4H活力在貯藏期間緩慢上升，而4CL活力總體呈先增加后下降趨勢。在整個貯藏期間，SA、SNP單一和復(fù)合處理組果實中C4H和4CL活力均顯著高于對照組（P＜0.05），其中以SA和SNP復(fù)合處理組的C4H和4CL活力最高，在接種后第10天，SA+SNP處理組中C4H和4CL活力分別是對照組的1.32 倍和1.64 倍。

圖3 SA和SNP處理對接種炭疽病菌后芒果果實中PAL（A）、C4H（B）和4CL（C）活力的影響Fig.3 Effects of SA and SNP treatment on the activities of PAL (A),C4H (B) and 4CL (C) in mango fruit inoculated with C.gloeosporioides

2.4 不同處理對接種炭疽病菌后芒果POD和PPO活力的影響

POD和PPO是苯丙烷代謝途徑末端的兩個氧化酶，可氧化果實中的酚類化合物。此外，POD還與植物體內(nèi)活性氧代謝緊密相關(guān)。如圖4A可知，隨著貯藏時間的延長，接種后芒果果實POD活力逐漸增加。接種后第2天，對照組果實中的POD活力顯著高于其他處理組，而接種4 d后，SA、SNP和SA+SNP處理組的POD活力顯著高于對照組（P＜0.05），在第10天時，分別較對照組提高了29.36%、39.39%和46.03%（P＜0.05）。

由圖4B可知，接種后芒果果實PPO活力總體表現(xiàn)為隨著貯藏時間的延長，呈先增加后降低的趨勢，其中SA處理組和SA+SNP處理組果實PPO活力在接種后的第6天達(dá)到最大值，而SNP處理組和對照組果實在接種后第8天達(dá)到最大值。在整個貯藏期間，接種后的SA、SNP和SA+SNP處理組果實中PPO活力均顯著高于對照組（P＜0.05），平均值分別比對照組增加了26.14%、29.88%和50.52%，以SA+SNP處理組的PPO活力最高。

圖4 SA和SNP處理對接種炭疽病后芒果果實中POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig.4 Effects of SA and SNP treatment on the activities of POD (A)and PPO (B) in mango fruit inoculated with C.gloeosporioides

2.5 不同處理對接種炭疽病菌后芒果CAD活力的影響

CAD是木質(zhì)素合成的重要酶。由圖5可知，接種后芒果果實CAD活力隨貯藏時間的延長呈先升高后下降的趨勢，且無論SA、SNP單一處理組還是復(fù)合處理組，其CAD活力均顯著高于對照組（P＜0.05），說明SA和SNP處理均能明顯增強(qiáng)CAD活力，總體以SA+SNP復(fù)合處理組CAD活力最高。

圖5 SA和SNP處理對接種炭疽病菌后芒果果實中CAD活力的影響Fig.5 Effects of SA and SNP treatment on CAD activity in mango fruit inoculated with C.gloeosporioides

2.6 不同處理對接種炭疽病菌后芒果CHI和GLU活力的影響

由圖6A可知，隨著接種后時間的延長，各處理組接種芒果中CHI活力呈先升高后下降的趨勢，在接種后第8天達(dá)到最大值。與對照組相比，SA、SNP和SA+SNP處理整體上顯著提高了接種果實中CHI活力。在接種后第10天，SA、SNP和SA+SNP處理組CHI活力分別是對照組的1.73、1.75 倍和1.97 倍。由圖6B可以看出，隨著貯藏時間的延長，各處理組果實GLU活力逐漸增加。與對照相比，SA、SNP和SA+SNP處理明顯提高了接種芒果果實的GLU活力。整個貯藏期間，SA、SNP和SA+SNP處理組GLU活力平均值比對照組分別增加了30.06%、33.18%和48.98%。

圖6 SA和SNP處理對接種炭疽病菌后芒果果實中CHI（A）和GLU（B）活力的影響Fig.6 Effects of SA and SNP treatment on the activities CHI (A) and GLU (B) in mango fruit inoculated with C.gloeosporioides

2.7 不同處理對接種炭疽病菌后芒果木質(zhì)素、總酚和類黃酮含量的影響

由圖7A～C可知，接種炭疽病菌后，對照組和各處理組果實中木質(zhì)素、總酚和類黃酮含量總體均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與對照組相比，整個貯藏期間SA、SNP和SA+SNP處理后的接種果實中木質(zhì)素含量平均值分別增加了26.01%、29.58%和43.37%，總酚含量平均值分別增加了28.41%、37.76%和48.93%，類黃酮含量平均值分別增加了54.66%、40.37%和65.40%。由此可見，SNP和SA處理，特別是SA+SNP處理，可有效增加接種后的果實體內(nèi)抗病物質(zhì)的含量。

圖7 SA和SNP處理對接種炭疽病菌后芒果果實中木質(zhì)素（A）、總酚（B）和類黃酮（C）含量的影響Fig.7 Effects of SA and SNP treatment on the contents of lignin (A), total phenols (B) and flavonoids (C) in mango fruit inoculated with C.gloeosporioides

2.8 芒果炭疽病發(fā)病率、病斑直徑與膜脂過氧化、抗病物質(zhì)和抗病相關(guān)酶活力的相關(guān)性分析

芒果果實接種炭疽病菌后，果實發(fā)病率、病斑直徑與膜脂過氧化指標(biāo)、抗病物質(zhì)含量和抗病相關(guān)酶活力的相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示，發(fā)病率和病斑直徑均與PAL、4CL、C4H、CAD、PPO和POD活力呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），與木質(zhì)素、總酚、類黃酮含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），說明苯丙烷途徑中關(guān)鍵酶活力的升高促進(jìn)了芒果果實中酚類、木質(zhì)素和類黃酮等抗病物質(zhì)的合成和積累，從而提高了果實抗炭疽病的能力。發(fā)病率和病斑直徑均與GLU和CHI活力呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），說明病程相關(guān)蛋白在芒果抗炭疽病過程中發(fā)揮著重要作用。此外，發(fā)病率和病斑直徑與MDA含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞降低了果實抗病性。由此推測，SNP、SA和SA+SNP處理通過提高果實中病程相關(guān)蛋白和苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶活力，促進(jìn)抗病物質(zhì)的合成，保持細(xì)胞膜的完整性，從而提高了果實炭疽病抗性。

表1 芒果果實中發(fā)病率和病斑直徑與抗病物質(zhì)、相關(guān)酶、膜脂過氧化的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of lesion diameter and disease incidence with resistance-associated enzymes and compounds and membrane lipid peroxidation in mango fruit inoculated with C.gloeosporioides

3 討 論

近年來，應(yīng)用外源激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗病性已經(jīng)成為控制果實采后病害的重要策略[4-5]。SA和NO是植物中普遍存在的兩種調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的抗病反應(yīng)中起著重要的作用。已有研究表明適宜濃度的外源SA或SNP處理能明顯提高采后芒果果實的抗病性，降低炭疽病害的發(fā)生率和病害程度[13,22]。本研究結(jié)果表明SA和SNP單獨處理均明顯降低了芒果表面接種炭疽菌病斑的生長（圖1），這與前人研究結(jié)果一致。相對于單獨SA或SNP處理，SA+SNP處理對病害生長的抑制效果更好（圖1），這表明SA和SNP處理不僅能夠提高采后芒果的抗病性，而且二者可能具有協(xié)同作用。與本研究結(jié)果相類似，張永福等[27]研究表明SA+SNP處理相對于單獨SNP處理明顯降低了葡萄的腐爛指數(shù)和果粒脫落率。李翠丹等[16]研究表明NO參與SA誘導(dǎo)的采后番茄果實的抗病性反應(yīng)。Shine等[28]認(rèn)為NO和SA信號途徑共同調(diào)節(jié)多個作用點從而有助于SAR。Wang Caixia等[29]研究發(fā)現(xiàn)與單獨SA或DETA-NONOate（NO供體）相比，SA和DETA-NONOate共同處理會進(jìn)一步加強(qiáng)SAR，提高擬南芥對Pseudomonas syringaeDC 3000的抗性，但認(rèn)為二者可能是通過獨立的途徑賦予SAR。

病原物侵染時，植物體內(nèi)往往會發(fā)生一系列防御反應(yīng)，其中抗病相關(guān)蛋白或酶活性的改變以及抗病物質(zhì)的大量生成是其重要的應(yīng)對方式。PAL、C4H和4CL是植物苯丙烷代謝途徑的重要酶，CAD和POD是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，與植物生長發(fā)育和抵御病原菌入侵關(guān)系密切。PPO通過催化酚類化合物的氧化反應(yīng)促進(jìn)抗菌酚類物質(zhì)或劇毒醌類物質(zhì)的生成，從而對病原物起到直接殺死和限制其在體內(nèi)擴(kuò)展的作用[10]。本研究表明SA和SNP單一和復(fù)合處理均能提高芒果果實中PAL、C4H、4CL、CAD、POD和PPO活力（圖3～5），以及木質(zhì)素、總酚和類黃酮含量（圖7）。相關(guān)性分析結(jié)果表明這些抗病酶活力和抗病物質(zhì)含量與果實發(fā)病率和病斑直徑呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（表1），說明SA和SNP處理提高芒果果實炭疽病抗性與其增強(qiáng)苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力及抗病物質(zhì)含量相關(guān)。這與SA處理在厚皮甜瓜[5]、哈密瓜[30]、草莓[31]和橙子[32]以及NO處理在采后火龍果[10]、獼猴桃[11]和芒果[22]上的研究結(jié)果相一致。越來越多的證據(jù)證明，植物的防御反應(yīng)，包括酶的激活和次生代謝物的產(chǎn)生，不是僅受一個信號通路的調(diào)控，而是一個協(xié)同調(diào)節(jié)過程[33]。本研究發(fā)現(xiàn)SA+SNP處理對苯丙烷代謝相關(guān)酶（PAL、C4H、4CL、CAD、POD和PPO）活力和抗病物質(zhì)（木質(zhì)素、總酚和類黃酮）合成的促進(jìn)作用顯著高于SA和SNP單一處理，表明二者在提高芒果果實抗病性方面的協(xié)同作用與其共同調(diào)控苯丙烷代謝相關(guān)酶和進(jìn)一步促進(jìn)抗病物質(zhì)合成與積累有關(guān)。有研究表明NO可以促進(jìn)SA的積累，而SA也能誘導(dǎo)NO生成，二者作為信號分子具有自我放大的作用[34-35]。SA和NO可以協(xié)同作用，通過靶向相同的效應(yīng)蛋白及其基因來傳遞防御信號，從而提高抗病性。如在大豆懸浮細(xì)胞中，SA與NO協(xié)同作用促進(jìn)了宿主細(xì)胞的凋亡。NO的缺乏可削弱SA誘導(dǎo)煙草植株對于煙草花葉病毒的SAR，但是SA在NO缺乏的情況下仍然可以激活部分SAR響應(yīng)，表明在SAR信號途徑中，SA的全部功能發(fā)揮需要NO，而NO則完全依賴于SA功能[36]。Zhu Honghui等[37]研究也表明SA和NO協(xié)同促進(jìn)叢枝菌根真菌接種的三葉草根中苯丙氨酸途徑和酚類物質(zhì)積累。Wang Yu等[38]研究表明NO通過SA依賴或SA獨立的途徑調(diào)節(jié)煙草葉片中不同抗性基因的表達(dá)，說明植物體內(nèi)存在復(fù)雜的信號通路，更有助于調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)，使植物在任何情況下都能及時有效地激活所需的基因。

H2O2的積累被認(rèn)為是病原菌侵染植物組織最早期的防御響應(yīng)，一方面，積累的H2O2對病原菌有直接毒性；另一方面，H2O2還可作為第二信使調(diào)控植物防御系統(tǒng)[39]。研究發(fā)現(xiàn)，接種Botrytis cinerea的葡萄果實[40]和接種Trichothecium roseum的甜瓜果實[41]中迅速產(chǎn)生的H2O2含量與果實抗病性顯著正相關(guān)，認(rèn)為是H2O2作為信號分子誘導(dǎo)了果實的抗病性。此外，低濃度H2O2對細(xì)胞起保護(hù)作用，而高濃度的H2O2會對植物細(xì)胞造成毒害[12]。本研究表明，與對照組相比，SA和SNP處理特別是SA和SNP復(fù)合處理顯著提高了接種初期果實中的H2O2含量（圖2）。這與SNP和SA處理在柑橘果實上的研究結(jié)果[9,39]相一致。廖云霞等[42]研究表明經(jīng)β-氨基丁酸處理的葡萄果實進(jìn)行損傷接種B.cinerea后，其果實內(nèi)活性氧產(chǎn)生量明顯升高，同時伴隨著抗病相關(guān)物質(zhì)含量的顯著提升。由此推測，SA和SNP處理可以通過誘導(dǎo)芒果抗性早期信號分子H2O2積累，進(jìn)而引起防御相關(guān)酶活力的提高和抗病相關(guān)物質(zhì)的積累，提高果實抗病力，且二者在誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生中具有協(xié)同效應(yīng)。然而，在接種后期SA和SNP單一和復(fù)合處理果實中的H2O2含量均低于對照組（圖2），POD活力明顯高于對照組（圖4），膜脂過氧化程度也明顯低于對照組（圖2）。因此認(rèn)為，SA和SNP單一和復(fù)合處理有效提高了POD活力，一方面促進(jìn)木質(zhì)素的合成積累，增強(qiáng)果實的抗病能力；另一方面減少H2O2的積累，降低了H2O2對果實細(xì)胞膜脂的傷害，提高了果實的抗病能力。

GLU和CHI是兩種重要的病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PR），分別屬于PR-2和PR-3家族，它們可以通過降解病原菌的細(xì)胞壁成分β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)，從而抑制病原菌的生長，此外，GLU還能通過誘導(dǎo)細(xì)胞壁釋放寡糖從而激活植物體內(nèi)的系統(tǒng)防衛(wèi)反應(yīng)[10,42]。已有研究表明SA在增強(qiáng)橙子對綠霉病[32]、蘋果對灰霉病[43]和冬棗對黑霉病[44]的抗病性過程中伴隨有GLU和CHI活性的升高。同樣，NO在提高火龍果[10]、芒果[22]對炭疽病抗病性過程中也伴隨有GLU和CHI活性的升高。本研究也得到類似的結(jié)果研究（圖6）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，SA+SNP處理進(jìn)一步增加了果實中GLU和CHI活力（圖6）。Klessig等[34]研究發(fā)現(xiàn)SA對于NO介導(dǎo)激活PR表達(dá)非常重要，在缺乏SA的轉(zhuǎn)細(xì)菌SA羥化酶基因煙草中，NO不能誘導(dǎo)PR基因表達(dá)。Shen Yanfei等[45]發(fā)現(xiàn)SA和殼聚糖復(fù)合處理誘導(dǎo)了比各自單獨處理更高的CHI和GLU活力，最大程度地降低了葡萄的病害發(fā)生程度。由此可以推斷，SA和SNP處理可以通過誘導(dǎo)芒果果實CHI和GLU活力的升高，減輕由C.gloeosporioides侵染造成的采后病害。

綜上，SA和SNP單一和復(fù)合處理均能有效減緩芒果果實接種炭疽病菌后的發(fā)病進(jìn)程，抑制病斑的擴(kuò)展，并通過引起接種前期H2O2含量激增，誘導(dǎo)芒果果實PAL、C4H、4CL等抗病相關(guān)酶活性的升高，促進(jìn)總酚、類黃酮和木質(zhì)素的積累，同時保持細(xì)胞膜的完整性，從而提高炭疽病抗性，其中以SA+SNP處理效果最好，二者在提高芒果炭疽病抗性方面存在協(xié)同效應(yīng)。