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        水溶性豆渣酸性多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制

        2022-03-03 08:33:56胡彥波王思琪石曾卉翟麗媛
        食品科學(xué) 2022年3期
        關(guān)鍵詞:信號(hào)質(zhì)量

        胡彥波,王思琪,石曾卉,翟麗媛,趙 珺*

        (長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130022)

        巨噬細(xì)胞是人體固有免疫的第一道防線,可以通過對(duì)凋亡細(xì)胞、微生物和腫瘤細(xì)胞的吞噬和降解維持機(jī)體的平衡[1-2]。當(dāng)人體受到病理或機(jī)械損傷刺激時(shí),會(huì)激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS),并分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6等一系列細(xì)胞因子,從而抵御病原體入侵,保護(hù)宿主免受侵害[3-5]。因此,激活巨噬細(xì)胞是宿主提高免疫能力的重要途徑。

        巨噬細(xì)胞表面存在許多多糖的受體,這些受體能夠識(shí)別多糖類物質(zhì)并激活巨噬細(xì)胞,從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[6-8]。據(jù)報(bào)道,天然多糖和低聚糖作為潛在的免疫調(diào)節(jié)劑,可以通過識(shí)別巨噬細(xì)胞表面受體并啟動(dòng)信號(hào)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9]。Liu Kaisheng等研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能夠通過結(jié)合RAW264.7巨噬細(xì)胞系膜表面Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)激活下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)信號(hào)通路,促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等免疫調(diào)節(jié)因子[10]。Liu Chaoran等研究發(fā)現(xiàn)豬苓多糖能夠誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞系活化,促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO和ROS,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力,其作用機(jī)制可能與激活巨噬細(xì)胞的核因子(nuclear factor,NF)-κB有關(guān)[11]。

        豆渣是豆制品加工過程中的主要副產(chǎn)物,目前主要作為飼料或廢棄物丟棄,造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[12-13]。先前研究表明,水溶性豆渣多糖(soluble soybean polysaccharides,SSPS)是豆渣的有效成分之一,具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物活性[14-15]。此外,SSPS由于其良好的物理和化學(xué)性質(zhì)已被應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。例如利用SSPS可以防止魚糜的蛋白質(zhì)變性、促進(jìn)水溶液中乳糖的結(jié)晶、提高乳酸菌肽的抗菌活性等[16-18]。目前針對(duì)SSPS的提取、分離純化和結(jié)構(gòu)分析已有部分的研究報(bào)道[19-21],但針對(duì)其免疫活性以及構(gòu)效關(guān)系的研究鮮少報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為模型,研究SSPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化作用,包括NO和ROS的釋放、相關(guān)細(xì)胞因子的分泌;并進(jìn)一步研究其對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化的機(jī)制,從而評(píng)價(jià)SSPS的免疫調(diào)節(jié)作用,以期為后續(xù)豆渣的深入開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞系 美國(guó)典型微生物菌種保藏中心;SSPS 實(shí)驗(yàn)室自制;DMEM高糖完全培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)HyClone公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 美國(guó)Sigma公司;NO檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所;TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒 美國(guó)Cloud-Clone公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        EnSpire全功能微孔板檢測(cè)儀 美國(guó)PerkinElmer公司;3K15臺(tái)式高速離心機(jī) 上海亞榮生化儀器廠;HF90CO2培養(yǎng)箱、HF-1200LC生物安全柜 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;IX71倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司;PP1152電泳儀、MP-8001電泳槽 北京凱元信瑞儀器有限公司;TS-8S脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;ChemiDoc?XRS+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-rad公司;CytoFLEX S流式細(xì)胞儀美國(guó)Beckman公司。

        1.3 方法

        1.3.1 水溶性豆渣多糖的制備

        參照文獻(xiàn)[21]采用水提醇沉法提取SSPS,并根據(jù)SSPS的帶電荷情況和分子質(zhì)量情況,利用DEAE-纖維素柱層析、Sephadex G-100和Sepherose CL-6B凝膠柱層析對(duì)SSPS進(jìn)行分離純化,制備SSPS的不同組分:水溶性豆渣中性多糖(soluble soybean neutral polysaccharide,SSPS-N)、水溶性豆渣酸性多糖A1(soluble soybean acidic polysaccharide A1,SSPS-A1)、水溶性豆渣酸性多糖A2(soluble soybean acidic polysaccharide A2,SSPS-A2)、水溶性豆渣酸性多糖純級(jí)分c(component c of soluble soybean acidic polysaccharide A1, SSPS-A1-c)、水溶性豆渣中性多糖純級(jí)分b(component b of soluble soybean neutral polysaccharide,SSPS-N-b),具體制備流程如圖1所示(其中SSPS-A1-a、SSPS-A1-b、SSPS-N-a、SSPS-N-c的含量較低,未做研究),計(jì)算不同組分的得率(某組分與上一級(jí)組分的質(zhì)量比×100%)。

        圖1 SSPS的制備流程圖Fig.1 Flow chart for the preparation of SSPS

        1.3.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

        小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%青霉素-鏈霉素雙抗)中,置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù),后同)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)進(jìn)行傳代[22],將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.3.3 RAW264.7細(xì)胞NO濃度的測(cè)定

        將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板(100 μL/孔),5% CO2、37 ℃培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后樣品組每孔分別加入200 μL含100 μg/mL(終質(zhì)量濃度)SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b的DMEM高糖完全培養(yǎng)基,空白對(duì)照組加入200 μL DMEM高糖完全培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組加入200 μL含1 μg/mL LPS的DMEM高糖完全培養(yǎng)基,每組3 個(gè)重復(fù)孔,孵育24 h,5% CO2、37 ℃過夜培養(yǎng)。取100 μL不同濃度(0、20、40、60、80、100 μmol/L)的NaNO2溶液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%磺胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%萘胺各50 μL。室溫反應(yīng)20 min后,用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處反應(yīng)液吸光度,根據(jù)NaNO2溶液濃度和吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)NO檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度。

        1.3.4 水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化作用

        1.3.4.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定

        將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板(100 μL/孔),5% CO2、37 ℃培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后使用SSPS-A1-c終質(zhì)量濃度為0(即空白對(duì)照組,后同)、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL,100 μL/孔,處理24 h。然后向每孔中加入20 μL噻唑藍(lán)溶液(5 mg/mL)處理細(xì)胞4 h,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。然后吸棄培養(yǎng)基,向每孔中加入150 μL二甲基亞砜,振蕩10 min溶解結(jié)晶,用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度,處理組與空白對(duì)照組吸光度的比值乘以100即細(xì)胞存活率,空白對(duì)照組的RAW264.7細(xì)胞存活率為100%。

        1.3.4.2 NO和ROS水平的測(cè)定

        采用質(zhì)量濃度0、25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞24 h(培養(yǎng)方法同1.3.4.1節(jié)),測(cè)定RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS的水平。NO濃度的測(cè)定方法與1.3.3節(jié)相同。ROS水平的測(cè)定方法:細(xì)胞孵育24 h后吸棄上清液,1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液收集細(xì)胞,然后使用磷酸緩沖液(50 mmol/L、pH 7.4,后同)洗一次,1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液,分別加入100 μL含2 μmol/L間二氯熒光素二乙酸酯(dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)的無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,37 ℃孵育10 min后,使用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次,以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。最后加入300 μL磷酸緩沖液,通過流式細(xì)胞儀測(cè)定不同多糖處理組的RAW264.7細(xì)胞熒光強(qiáng)度,以不同處理組的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度表征ROS水平。

        1.3.4.3 TNF-α、1L-1β、IL-6質(zhì)量濃度的測(cè)定

        將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板(100 μL /孔),5% CO2、37 ℃培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后用不同質(zhì)量濃度SSPS-A1-c(0、25、50、100 μg/mL)處理RAW264.7細(xì)胞后培養(yǎng)24 h,收集上清液,參照TNF-α、1L-1β和IL-6的ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清液中各細(xì)胞因子質(zhì)量濃度。

        1.3.5 水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化機(jī)制的研究

        1.3.5.1 MAPKs信號(hào)通路分析

        將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板(100 μL/孔),5% CO2、37 ℃培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后使用不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c(0、25、50、100 μg/mL)處理30 min,采用Western blot方法[23]檢測(cè)MAPKs信號(hào)通路相關(guān)c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-teminal kinase,JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和蛋白激酶-38(phosphor,p38)以及磷酸化蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步使用JNK抑制劑SP600125(20 μmol/L)、ERK抑制劑U0126(25 μmol/L)和p38抑制劑SB203580(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h后,與100 μg/mL SSPS-A1-c共處理30 min和24 h。30 min后采用Western-blot方法檢測(cè)加入抑制劑后相關(guān)蛋白(JNK、磷酸化JNK(phospho-JNK,p-JNK)、ERK、磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)、p38和磷酸化p38(phospho-p38,p38))的表達(dá)情況。24 h后采用1.3.3節(jié)方法測(cè)定NO濃度,采用1.3.4.3節(jié)方法測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度。

        1.3.5.2 NF-κB信號(hào)通路分析

        將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板(100 μL/孔),5% CO2、37 ℃培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c(0、25、50、100 μg/mL)處理30 min,采用Western blot方法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)IκB-α的降解程度。進(jìn)一步使用NF-κB抑制劑BAY-117082(2.5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h后,與100 μg/mL SSPSA1-c共處理30 min和24 h。30 min后采用Western blot方法檢測(cè)加入抑制劑后相關(guān)蛋白的表達(dá)。24 h后采用NO檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO濃度,采用1.3.4.3節(jié)方法測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P<0.001表示差異高度顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 水溶性豆渣多糖的分離純化

        以豆渣為原料,按照?qǐng)D1所示的技術(shù)路線圖制備SSPS。首先,采用熱水煮提和70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇醇沉的方法獲得了SSPS,多糖得率為1.8%。利用DEAE-纖維素柱層析對(duì)SSPS進(jìn)行分離純化,dH2O洗脫獲得水溶性豆渣中性多糖SSPS-N(得率70.8%);0.19 mol/L NaCl和0.34 mol/L NaCl洗脫獲得水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1(得率11.6%)和SSPS-A2(得率2.6%)。進(jìn)一步利用Sephadex G-100分離純化SSPS-N獲得純組分SSPS-N-b,其得率為65.5%;Sepherose CL-6B分離純化SSPS-A1獲得純組分SSPS-A1-c,其得率為20.8%。鑒于在分離純化過程中,其他組分的得率和純度較低,因此選擇SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

        2.2 水溶性豆渣多糖組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO濃度的影響

        使用制備的5 種主要多糖組分SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b處理RAW264.7細(xì)胞,然后檢測(cè)不同處理組細(xì)胞上清液中NO的濃度。研究表明,巨噬細(xì)胞被激活后產(chǎn)生NO,并與超氧陰離子自由基反應(yīng)形成過氧亞硝基陰離子,協(xié)助機(jī)體對(duì)抗外來抗原,實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[24]。因此,通過考察多糖處理RAW264.7細(xì)胞后NO的濃度,篩選出具有免疫活性的多糖組分。如圖2所示,RAW264.7細(xì)胞經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照組LPS刺激后NO濃度高度顯著增加(P<0.001)。與空白對(duì)照組相比,SSPS-N和SSPS-N-b處理后細(xì)胞NO濃度無顯著變化;而SSPS、SSPS-A1和SSPS-A1-c處理細(xì)胞后NO濃度高度顯著增加(P<0.001)。課題組前期研究結(jié)果表明,SSPS-A1和SSPS-A1-c主要由阿拉伯半乳聚糖(arabic galactans,AG)和聚半乳糖醛酸組成[21],先前研究報(bào)道AG結(jié)構(gòu)域具有免疫調(diào)節(jié)的活性[25],由此推測(cè),豆渣中分離純化制備的酸性多糖可能是豆渣發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要組分。鑒于SSPS-A1-c由SSPS-A1純化得到,純度更高,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)以SSPS-A1-c為研究對(duì)象,初步研究其免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。

        圖2 SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO濃度的影響Fig.2 Effects of SSPS, SSPS-A1, SSPS-A1-c, soluble soybean neutral polysaccharide (SSPS-N) and component b ofSSPS-N on the production of nitric oxide in RAW264.7 cells

        2.3 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化作用研究

        2.3.1 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

        采用0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞,研究SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用。如圖3所示,與空白對(duì)照組相比,不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率影響不同。當(dāng)質(zhì)量濃度低于400 μg/mL時(shí),SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率均無顯著影響(P>0.05),說明SSPS-A1-c的質(zhì)量濃度低于400 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞沒有毒性。當(dāng)SSPS-A1-c質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率呈高度顯著的降低趨勢(shì)(P<0.001),說明過高質(zhì)量濃度的多糖樣品對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的毒性,從而降低其存活率[26]。因此,綜合細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理,并在此質(zhì)量濃度下,評(píng)價(jià)SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

        圖3 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of SSPS-A1-c on the proliferation of RAW264.7 cells

        2.3.2 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS的影響

        采用25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞,檢測(cè)SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS的影響。如圖4所示,RAW264.7細(xì)胞經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照組LPS刺激后NO和ROS水平高度顯著增加(P<0.001)。與空白對(duì)照組相比,當(dāng)使用25 μg/mL的SSPS-A1-c處理后,細(xì)胞NO濃度增加,當(dāng)濃度增加到50 μg/mL和100 μg/mL,NO濃度高度顯著增加(P<0.001),在100 μg/mL時(shí)NO濃度與LPS刺激后NO濃度相當(dāng);當(dāng)使用25 μg/mL的SSPS-A1-c處理后,細(xì)胞ROS水平呈現(xiàn)高度顯著升高(P<0.001),隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加,ROS水平明顯增加并呈現(xiàn)劑量依賴性。上述研究結(jié)果說明SSPS-A1-c在一定質(zhì)量濃度下可激活并提高巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO和ROS的能力。

        圖4 不同質(zhì)量濃度SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO(A)和ROS(B)水平的影響Fig.4 Effects of different concentrations of SSPS-A1-c on the production of NO (A) and ROS (B) in RAW264.7 cells

        2.3.3 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度的影響

        采用25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞,檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度。研究表明,巨噬細(xì)胞被激活后通過細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子的釋放[27]。因此,可以檢測(cè)SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞后相關(guān)因子的質(zhì)量濃度,從而確定巨噬細(xì)胞的活化程度。如圖5所示,與空白對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組的TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度高度顯著增加(P<0.001)。隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加,TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度也呈現(xiàn)高度顯著增加(P<0.001)。與空白對(duì)照組相比,當(dāng)SSPS-A1-c的質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí),IL-1β的分泌量沒有顯著變化(P>0.05),而TNF-α和IL-6的質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)出明顯變化;當(dāng)質(zhì)量濃度增加為50 μg/mL和100 μg/mL時(shí),TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)出高度顯著變化(P<0.001)。說明在高質(zhì)量濃度SSPS-A1-c對(duì)細(xì)胞因子的分泌具有明顯的促進(jìn)作用,且呈現(xiàn)出濃度依賴性。

        圖5 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α(A)、IL-1β(B)和IL-6(C)質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of SSPS-A1-c on the secretion of TNF-α (A), IL-1β (B)and IL-6 (C) in RAW264.7 cells

        綜上所述,SSPS-A1-c可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS,分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子,從而促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活化。

        2.4 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化機(jī)制

        MAPKs和NF-κB是與巨噬細(xì)胞活化緊密相關(guān)的兩條經(jīng)典炎癥信號(hào)通路。MAPKs家族主要包括ERK、JNK和p38,MAPKs可參與巨噬細(xì)胞的活化,因此在免疫活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮極其重要的作用。在靜息狀態(tài)下,NF-κB與IκB-α在胞質(zhì)中結(jié)合,當(dāng)該信號(hào)通路被激活后,IκB-α在胞質(zhì)中降解[28-31]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過研究MAPKs和NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,初步確定了SSPS-A1-c活化RAW264.7細(xì)胞的機(jī)制。

        2.4.1 MAPKs信號(hào)通路

        為探究SSPS-A1-c誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活化是否與MAPKs通路有關(guān),本實(shí)驗(yàn)采用25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞30 min后,收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)。如圖6A所示,不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c均可以明顯促進(jìn)JNK、ERK和p38的磷酸化;同時(shí)其磷酸化呈現(xiàn)劑量依賴性,隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加,磷酸化程度(p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38/p-38的相對(duì)表達(dá)量)明顯升高,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),磷酸化的程度最大,JNK、ERK和p38的磷酸化程度分別為空白對(duì)照組的9.5、5.2 倍和2.0 倍。說明SSPS-A1-c可以通過促進(jìn)JNK、ERK和p38的磷酸化活化巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步使用JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑U0126和p38抑制劑SB203580預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞,然后與SSPS-A1-c共處理,測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)量。從Western blot和蛋白表達(dá)量的相對(duì)灰度分析結(jié)果中可以看出(圖6B),當(dāng)加入JNK、ERK和p38的抑制劑后,可以明顯降低蛋白的表達(dá);此外,不同抑制劑(SP600125、U0126、SB203580)與SSPS-A1-c共處理24 h后NO的濃度以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(圖6C)。這些結(jié)果均表明SSPS-A1-c通過MAPKs通路激活巨噬細(xì)胞。

        圖6 SSPS-A1-c對(duì)MAPKs信號(hào)通路的影響Fig.6 Effect of SSPS-A1-c on MAPKs signaling pathway

        2.4.2 NF-κB信號(hào)通路

        本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)SSPS-A1-c誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活化是否與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。采用25、50、100 μg/mL SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞30 min 后,收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)。如圖7A1所示,隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加,IκB-α的降解程度逐漸增加,當(dāng)使用100 μg/mL SSPS-A1-c處理30 min后,僅有26.8%的IκB-α未降解,大部分的IκB-α發(fā)生了降解。為進(jìn)一步研究NF-κB信號(hào)通路在SSPS-A1-c誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活化中的作用,采用BAY-117082預(yù)處理巨噬細(xì)胞,然后與SSPS-A1-c共處理,從Western blot蛋白表達(dá)量的相對(duì)灰度分析結(jié)果中可以看出(圖7A2),IκB-α的降解程度明顯下降;此外,NO的濃度以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低(圖7B)。這些結(jié)果均表明SSPS-A1-c通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化。

        圖7 SSPS-A1-c對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.7 Effect of SSPS-A1-c on NF-κB signaling pathway

        研究表明,多糖具有增強(qiáng)免疫的活性。但由于多糖分子質(zhì)量較大,直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)相對(duì)困難,一般會(huì)與免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)MAPK和NF-κB信號(hào)通路,從而活化免疫細(xì)胞[32]。本實(shí)驗(yàn)純化的水溶性豆渣酸性多糖均一級(jí)分SSPS-A1-c能夠活化巨噬細(xì)胞內(nèi)MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)了MAPKs相關(guān)蛋白JNK、ERK和p38的磷酸化以及NF-κB信號(hào)通路中IκB-α的降解,使巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF、IL-1β和IL-6等免疫調(diào)節(jié)因子的能力增強(qiáng),從而活化巨噬細(xì)胞。

        目前,隨著大分子多糖的結(jié)構(gòu)研究越來越深入,對(duì)多糖的構(gòu)效關(guān)系研究也逐漸深入。大量的研究表明,多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。例如從金針菇、杏鮑菇和雞油菌子實(shí)體中分離純化的連接不同側(cè)鏈的3-甲基-半乳聚糖,均可以通過MAPK和NF-κB信號(hào)通路激活RAW264.7細(xì)胞,其中雞油菌中3-甲基-半乳聚糖的分子質(zhì)量與激活RAW264.7細(xì)胞的效果密切相關(guān)[23,32-33],說明3-甲基-半乳聚糖可能在真菌多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮了重要作用;此外,從植物酸漿中純化的富含阿拉伯糖和半乳糖的均一多糖結(jié)構(gòu)域,同樣可以通過MAPK和NF-κB信號(hào)通路激活RAW264.7細(xì)胞[34]。課題組前期研究結(jié)果[21]表明,水溶性豆渣酸性多糖均一級(jí)分SSPS-A1-c同樣含有由半乳糖和阿拉伯多糖組成的AG型果膠,其結(jié)果特征與植物酸漿中的均一多糖結(jié)構(gòu)[35]較為相似,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)SSPS-A1-c可以通過MAPKs和NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是AG型果膠結(jié)構(gòu)域。

        3 結(jié) 論

        本實(shí)驗(yàn)主要研究了SSPS的免疫調(diào)節(jié)作用,明確其發(fā)揮功能的主要級(jí)分為水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1-c。進(jìn)一步研究了SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化作用及其機(jī)制,結(jié)果表明,SSPS-A1-c可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS,同時(shí)促進(jìn)TNF-α、IL-1β和IL-6等免疫調(diào)節(jié)因子的分泌,并呈現(xiàn)劑量依賴性;SSPS-A1-c可以促進(jìn)MAPKs相關(guān)蛋白JNK、ERK和p38磷酸化,同時(shí)促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路中IκB-α的降解,說明其作用機(jī)制與MAPKs和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。綜上所述,水溶性豆渣酸性多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用,該研究成果將為豆渣多糖的綜合開發(fā)利用提供新的思路,同時(shí)為食品功能性因子開發(fā)提供參考。

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