胡彥波，王思琪，石曾卉，翟麗媛，趙 珺*

（長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

巨噬細(xì)胞是人體固有免疫的第一道防線，可以通過對(duì)凋亡細(xì)胞、微生物和腫瘤細(xì)胞的吞噬和降解維持機(jī)體的平衡[1-2]。當(dāng)人體受到病理或機(jī)械損傷刺激時(shí)，會(huì)激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）和活性氧（reactive oxygen species，ROS），并分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6等一系列細(xì)胞因子，從而抵御病原體入侵，保護(hù)宿主免受侵害[3-5]。因此，激活巨噬細(xì)胞是宿主提高免疫能力的重要途徑。

巨噬細(xì)胞表面存在許多多糖的受體，這些受體能夠識(shí)別多糖類物質(zhì)并激活巨噬細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[6-8]。據(jù)報(bào)道，天然多糖和低聚糖作為潛在的免疫調(diào)節(jié)劑，可以通過識(shí)別巨噬細(xì)胞表面受體并啟動(dòng)信號(hào)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9]。Liu Kaisheng等研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能夠通過結(jié)合RAW264.7巨噬細(xì)胞系膜表面Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）激活下游絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等免疫調(diào)節(jié)因子[10]。Liu Chaoran等研究發(fā)現(xiàn)豬苓多糖能夠誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞系活化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO和ROS，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，其作用機(jī)制可能與激活巨噬細(xì)胞的核因子（nuclear factor，NF）-κB有關(guān)[11]。

豆渣是豆制品加工過程中的主要副產(chǎn)物，目前主要作為飼料或廢棄物丟棄，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[12-13]。先前研究表明，水溶性豆渣多糖（soluble soybean polysaccharides，SSPS）是豆渣的有效成分之一，具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物活性[14-15]。此外，SSPS由于其良好的物理和化學(xué)性質(zhì)已被應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。例如利用SSPS可以防止魚糜的蛋白質(zhì)變性、促進(jìn)水溶液中乳糖的結(jié)晶、提高乳酸菌肽的抗菌活性等[16-18]。目前針對(duì)SSPS的提取、分離純化和結(jié)構(gòu)分析已有部分的研究報(bào)道[19-21]，但針對(duì)其免疫活性以及構(gòu)效關(guān)系的研究鮮少報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為模型，研究SSPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化作用，包括NO和ROS的釋放、相關(guān)細(xì)胞因子的分泌；并進(jìn)一步研究其對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化的機(jī)制，從而評(píng)價(jià)SSPS的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為后續(xù)豆渣的深入開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞系 美國(guó)典型微生物菌種保藏中心；SSPS 實(shí)驗(yàn)室自制；DMEM高糖完全培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)HyClone公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 美國(guó)Sigma公司；NO檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒 美國(guó)Cloud-Clone公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EnSpire全功能微孔板檢測(cè)儀 美國(guó)PerkinElmer公司；3K15臺(tái)式高速離心機(jī) 上海亞榮生化儀器廠；HF90CO2培養(yǎng)箱、HF-1200LC生物安全柜 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；IX71倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；PP1152電泳儀、MP-8001電泳槽 北京凱元信瑞儀器有限公司；TS-8S脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ChemiDoc?XRS+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-rad公司；CytoFLEX S流式細(xì)胞儀美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性豆渣多糖的制備

參照文獻(xiàn)[21]采用水提醇沉法提取SSPS，并根據(jù)SSPS的帶電荷情況和分子質(zhì)量情況，利用DEAE-纖維素柱層析、Sephadex G-100和Sepherose CL-6B凝膠柱層析對(duì)SSPS進(jìn)行分離純化，制備SSPS的不同組分：水溶性豆渣中性多糖（soluble soybean neutral polysaccharide，SSPS-N）、水溶性豆渣酸性多糖A1（soluble soybean acidic polysaccharide A1，SSPS-A1）、水溶性豆渣酸性多糖A2（soluble soybean acidic polysaccharide A2，SSPS-A2）、水溶性豆渣酸性多糖純級(jí)分c（component c of soluble soybean acidic polysaccharide A1, SSPS-A1-c）、水溶性豆渣中性多糖純級(jí)分b（component b of soluble soybean neutral polysaccharide，SSPS-N-b），具體制備流程如圖1所示（其中SSPS-A1-a、SSPS-A1-b、SSPS-N-a、SSPS-N-c的含量較低，未做研究），計(jì)算不同組分的得率（某組分與上一級(jí)組分的質(zhì)量比×100%）。

圖1 SSPS的制備流程圖Fig.1 Flow chart for the preparation of SSPS

1.3.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%青霉素-鏈霉素雙抗）中，置于37 ℃、5%（體積分?jǐn)?shù)，后同）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)進(jìn)行傳代[22]，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 RAW264.7細(xì)胞NO濃度的測(cè)定

將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板（100 μL/孔），5% CO2、37 ℃培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后樣品組每孔分別加入200 μL含100 μg/mL（終質(zhì)量濃度）SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入200 μL DMEM高糖完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入200 μL含1 μg/mL LPS的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，每組3 個(gè)重復(fù)孔，孵育24 h，5% CO2、37 ℃過夜培養(yǎng)。取100 μL不同濃度（0、20、40、60、80、100 μmol/L）的NaNO2溶液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%磺胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%萘胺各50 μL。室溫反應(yīng)20 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處反應(yīng)液吸光度，根據(jù)NaNO2溶液濃度和吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)NO檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度。

1.3.4 水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化作用

1.3.4.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定

將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板（100 μL/孔），5% CO2、37 ℃培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后使用SSPS-A1-c終質(zhì)量濃度為0（即空白對(duì)照組，后同）、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL，100 μL/孔，處理24 h。然后向每孔中加入20 μL噻唑藍(lán)溶液（5 mg/mL）處理細(xì)胞4 h，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。然后吸棄培養(yǎng)基，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度，處理組與空白對(duì)照組吸光度的比值乘以100即細(xì)胞存活率，空白對(duì)照組的RAW264.7細(xì)胞存活率為100%。

1.3.4.2 NO和ROS水平的測(cè)定

采用質(zhì)量濃度0、25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞24 h（培養(yǎng)方法同1.3.4.1節(jié)），測(cè)定RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS的水平。NO濃度的測(cè)定方法與1.3.3節(jié)相同。ROS水平的測(cè)定方法：細(xì)胞孵育24 h后吸棄上清液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液收集細(xì)胞，然后使用磷酸緩沖液（50 mmol/L、pH 7.4，后同）洗一次，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，分別加入100 μL含2 μmol/L間二氯熒光素二乙酸酯（dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）的無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37 ℃孵育10 min后，使用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。最后加入300 μL磷酸緩沖液，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定不同多糖處理組的RAW264.7細(xì)胞熒光強(qiáng)度，以不同處理組的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度表征ROS水平。

1.3.4.3 TNF-α、1L-1β、IL-6質(zhì)量濃度的測(cè)定

將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板（100 μL /孔），5% CO2、37 ℃培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后用不同質(zhì)量濃度SSPS-A1-c（0、25、50、100 μg/mL）處理RAW264.7細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，收集上清液，參照TNF-α、1L-1β和IL-6的ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清液中各細(xì)胞因子質(zhì)量濃度。

1.3.5 水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化機(jī)制的研究

1.3.5.1 MAPKs信號(hào)通路分析

將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板（100 μL/孔），5% CO2、37 ℃培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后使用不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c（0、25、50、100 μg/mL）處理30 min，采用Western blot方法[23]檢測(cè)MAPKs信號(hào)通路相關(guān)c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-teminal kinase，JNK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和蛋白激酶-38（phosphor，p38）以及磷酸化蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步使用JNK抑制劑SP600125（20 μmol/L）、ERK抑制劑U0126（25 μmol/L）和p38抑制劑SB203580（5 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞2 h后，與100 μg/mL SSPS-A1-c共處理30 min和24 h。30 min后采用Western-blot方法檢測(cè)加入抑制劑后相關(guān)蛋白（JNK、磷酸化JNK（phospho-JNK，p-JNK）、ERK、磷酸化ERK（phospho-ERK，p-ERK）、p38和磷酸化p38（phospho-p38，p38））的表達(dá)情況。24 h后采用1.3.3節(jié)方法測(cè)定NO濃度，采用1.3.4.3節(jié)方法測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度。

1.3.5.2 NF-κB信號(hào)通路分析

將1.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96 孔板（100 μL/孔），5% CO2、37 ℃培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c（0、25、50、100 μg/mL）處理30 min，采用Western blot方法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)IκB-α的降解程度。進(jìn)一步使用NF-κB抑制劑BAY-117082（2.5 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞2 h后，與100 μg/mL SSPSA1-c共處理30 min和24 h。30 min后采用Western blot方法檢測(cè)加入抑制劑后相關(guān)蛋白的表達(dá)。24 h后采用NO檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO濃度，采用1.3.4.3節(jié)方法測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶性豆渣多糖的分離純化

以豆渣為原料，按照?qǐng)D1所示的技術(shù)路線圖制備SSPS。首先，采用熱水煮提和70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇醇沉的方法獲得了SSPS，多糖得率為1.8%。利用DEAE-纖維素柱層析對(duì)SSPS進(jìn)行分離純化，dH2O洗脫獲得水溶性豆渣中性多糖SSPS-N（得率70.8%）；0.19 mol/L NaCl和0.34 mol/L NaCl洗脫獲得水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1（得率11.6%）和SSPS-A2（得率2.6%）。進(jìn)一步利用Sephadex G-100分離純化SSPS-N獲得純組分SSPS-N-b，其得率為65.5%；Sepherose CL-6B分離純化SSPS-A1獲得純組分SSPS-A1-c，其得率為20.8%。鑒于在分離純化過程中，其他組分的得率和純度較低，因此選擇SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 水溶性豆渣多糖組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO濃度的影響

使用制備的5 種主要多糖組分SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b處理RAW264.7細(xì)胞，然后檢測(cè)不同處理組細(xì)胞上清液中NO的濃度。研究表明，巨噬細(xì)胞被激活后產(chǎn)生NO，并與超氧陰離子自由基反應(yīng)形成過氧亞硝基陰離子，協(xié)助機(jī)體對(duì)抗外來抗原，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[24]。因此，通過考察多糖處理RAW264.7細(xì)胞后NO的濃度，篩選出具有免疫活性的多糖組分。如圖2所示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照組LPS刺激后NO濃度高度顯著增加（P＜0.001）。與空白對(duì)照組相比，SSPS-N和SSPS-N-b處理后細(xì)胞NO濃度無顯著變化；而SSPS、SSPS-A1和SSPS-A1-c處理細(xì)胞后NO濃度高度顯著增加（P＜0.001）。課題組前期研究結(jié)果表明，SSPS-A1和SSPS-A1-c主要由阿拉伯半乳聚糖（arabic galactans，AG）和聚半乳糖醛酸組成[21]，先前研究報(bào)道AG結(jié)構(gòu)域具有免疫調(diào)節(jié)的活性[25]，由此推測(cè)，豆渣中分離純化制備的酸性多糖可能是豆渣發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要組分。鑒于SSPS-A1-c由SSPS-A1純化得到，純度更高，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以SSPS-A1-c為研究對(duì)象，初步研究其免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。

圖2 SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO濃度的影響Fig.2 Effects of SSPS, SSPS-A1, SSPS-A1-c, soluble soybean neutral polysaccharide (SSPS-N) and component b ofSSPS-N on the production of nitric oxide in RAW264.7 cells

2.3 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化作用研究

2.3.1 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

采用0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞，研究SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用。如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率影響不同。當(dāng)質(zhì)量濃度低于400 μg/mL時(shí)，SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率均無顯著影響（P＞0.05），說明SSPS-A1-c的質(zhì)量濃度低于400 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞沒有毒性。當(dāng)SSPS-A1-c質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率呈高度顯著的降低趨勢(shì)（P＜0.001），說明過高質(zhì)量濃度的多糖樣品對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的毒性，從而降低其存活率[26]。因此，綜合細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理，并在此質(zhì)量濃度下，評(píng)價(jià)SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

圖3 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of SSPS-A1-c on the proliferation of RAW264.7 cells

2.3.2 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS的影響

采用25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞，檢測(cè)SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS的影響。如圖4所示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照組LPS刺激后NO和ROS水平高度顯著增加（P＜0.001）。與空白對(duì)照組相比，當(dāng)使用25 μg/mL的SSPS-A1-c處理后，細(xì)胞NO濃度增加，當(dāng)濃度增加到50 μg/mL和100 μg/mL，NO濃度高度顯著增加（P＜0.001），在100 μg/mL時(shí)NO濃度與LPS刺激后NO濃度相當(dāng)；當(dāng)使用25 μg/mL的SSPS-A1-c處理后，細(xì)胞ROS水平呈現(xiàn)高度顯著升高（P＜0.001），隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加，ROS水平明顯增加并呈現(xiàn)劑量依賴性。上述研究結(jié)果說明SSPS-A1-c在一定質(zhì)量濃度下可激活并提高巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO和ROS的能力。

圖4 不同質(zhì)量濃度SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO（A）和ROS（B）水平的影響Fig.4 Effects of different concentrations of SSPS-A1-c on the production of NO (A) and ROS (B) in RAW264.7 cells

2.3.3 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度的影響

采用25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞，檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度。研究表明，巨噬細(xì)胞被激活后通過細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子的釋放[27]。因此，可以檢測(cè)SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞后相關(guān)因子的質(zhì)量濃度，從而確定巨噬細(xì)胞的活化程度。如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組的TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度高度顯著增加（P＜0.001）。隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度也呈現(xiàn)高度顯著增加（P＜0.001）。與空白對(duì)照組相比，當(dāng)SSPS-A1-c的質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，IL-1β的分泌量沒有顯著變化（P＞0.05），而TNF-α和IL-6的質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)出明顯變化；當(dāng)質(zhì)量濃度增加為50 μg/mL和100 μg/mL時(shí)，TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)出高度顯著變化（P＜0.001）。說明在高質(zhì)量濃度SSPS-A1-c對(duì)細(xì)胞因子的分泌具有明顯的促進(jìn)作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。

圖5 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C）質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of SSPS-A1-c on the secretion of TNF-α (A), IL-1β (B)and IL-6 (C) in RAW264.7 cells

綜上所述，SSPS-A1-c可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS，分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子，從而促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活化。

2.4 SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化機(jī)制

MAPKs和NF-κB是與巨噬細(xì)胞活化緊密相關(guān)的兩條經(jīng)典炎癥信號(hào)通路。MAPKs家族主要包括ERK、JNK和p38，MAPKs可參與巨噬細(xì)胞的活化，因此在免疫活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮極其重要的作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與IκB-α在胞質(zhì)中結(jié)合，當(dāng)該信號(hào)通路被激活后，IκB-α在胞質(zhì)中降解[28-31]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究MAPKs和NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，初步確定了SSPS-A1-c活化RAW264.7細(xì)胞的機(jī)制。

2.4.1 MAPKs信號(hào)通路

為探究SSPS-A1-c誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活化是否與MAPKs通路有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用25、50、100 μg/mL的SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞30 min后，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)。如圖6A所示，不同質(zhì)量濃度的SSPS-A1-c均可以明顯促進(jìn)JNK、ERK和p38的磷酸化；同時(shí)其磷酸化呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加，磷酸化程度（p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38/p-38的相對(duì)表達(dá)量）明顯升高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，磷酸化的程度最大，JNK、ERK和p38的磷酸化程度分別為空白對(duì)照組的9.5、5.2 倍和2.0 倍。說明SSPS-A1-c可以通過促進(jìn)JNK、ERK和p38的磷酸化活化巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步使用JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑U0126和p38抑制劑SB203580預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞，然后與SSPS-A1-c共處理，測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)量。從Western blot和蛋白表達(dá)量的相對(duì)灰度分析結(jié)果中可以看出（圖6B），當(dāng)加入JNK、ERK和p38的抑制劑后，可以明顯降低蛋白的表達(dá)；此外，不同抑制劑（SP600125、U0126、SB203580）與SSPS-A1-c共處理24 h后NO的濃度以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（圖6C）。這些結(jié)果均表明SSPS-A1-c通過MAPKs通路激活巨噬細(xì)胞。

圖6 SSPS-A1-c對(duì)MAPKs信號(hào)通路的影響Fig.6 Effect of SSPS-A1-c on MAPKs signaling pathway

2.4.2 NF-κB信號(hào)通路

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)SSPS-A1-c誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活化是否與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。采用25、50、100 μg/mL SSPS-A1-c處理RAW264.7細(xì)胞30 min 后，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)。如圖7A1所示，隨著SSPS-A1-c質(zhì)量濃度的增加，IκB-α的降解程度逐漸增加，當(dāng)使用100 μg/mL SSPS-A1-c處理30 min后，僅有26.8%的IκB-α未降解，大部分的IκB-α發(fā)生了降解。為進(jìn)一步研究NF-κB信號(hào)通路在SSPS-A1-c誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活化中的作用，采用BAY-117082預(yù)處理巨噬細(xì)胞，然后與SSPS-A1-c共處理，從Western blot蛋白表達(dá)量的相對(duì)灰度分析結(jié)果中可以看出（圖7A2），IκB-α的降解程度明顯下降；此外，NO的濃度以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低（圖7B）。這些結(jié)果均表明SSPS-A1-c通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化。

圖7 SSPS-A1-c對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.7 Effect of SSPS-A1-c on NF-κB signaling pathway

研究表明，多糖具有增強(qiáng)免疫的活性。但由于多糖分子質(zhì)量較大，直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)相對(duì)困難，一般會(huì)與免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)MAPK和NF-κB信號(hào)通路，從而活化免疫細(xì)胞[32]。本實(shí)驗(yàn)純化的水溶性豆渣酸性多糖均一級(jí)分SSPS-A1-c能夠活化巨噬細(xì)胞內(nèi)MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)了MAPKs相關(guān)蛋白JNK、ERK和p38的磷酸化以及NF-κB信號(hào)通路中IκB-α的降解，使巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF、IL-1β和IL-6等免疫調(diào)節(jié)因子的能力增強(qiáng)，從而活化巨噬細(xì)胞。

目前，隨著大分子多糖的結(jié)構(gòu)研究越來越深入，對(duì)多糖的構(gòu)效關(guān)系研究也逐漸深入。大量的研究表明，多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。例如從金針菇、杏鮑菇和雞油菌子實(shí)體中分離純化的連接不同側(cè)鏈的3-甲基-半乳聚糖，均可以通過MAPK和NF-κB信號(hào)通路激活RAW264.7細(xì)胞，其中雞油菌中3-甲基-半乳聚糖的分子質(zhì)量與激活RAW264.7細(xì)胞的效果密切相關(guān)[23,32-33]，說明3-甲基-半乳聚糖可能在真菌多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮了重要作用；此外，從植物酸漿中純化的富含阿拉伯糖和半乳糖的均一多糖結(jié)構(gòu)域，同樣可以通過MAPK和NF-κB信號(hào)通路激活RAW264.7細(xì)胞[34]。課題組前期研究結(jié)果[21]表明，水溶性豆渣酸性多糖均一級(jí)分SSPS-A1-c同樣含有由半乳糖和阿拉伯多糖組成的AG型果膠，其結(jié)果特征與植物酸漿中的均一多糖結(jié)構(gòu)[35]較為相似，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)SSPS-A1-c可以通過MAPKs和NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是AG型果膠結(jié)構(gòu)域。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了SSPS的免疫調(diào)節(jié)作用，明確其發(fā)揮功能的主要級(jí)分為水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1-c。進(jìn)一步研究了SSPS-A1-c對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化作用及其機(jī)制，結(jié)果表明，SSPS-A1-c可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和ROS，同時(shí)促進(jìn)TNF-α、IL-1β和IL-6等免疫調(diào)節(jié)因子的分泌，并呈現(xiàn)劑量依賴性；SSPS-A1-c可以促進(jìn)MAPKs相關(guān)蛋白JNK、ERK和p38磷酸化，同時(shí)促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路中IκB-α的降解，說明其作用機(jī)制與MAPKs和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。綜上所述，水溶性豆渣酸性多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，該研究成果將為豆渣多糖的綜合開發(fā)利用提供新的思路，同時(shí)為食品功能性因子開發(fā)提供參考。