王 力，肖嵋方，陳弘培，劉 斌，曾 峰,*

（1.閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

衰老是一個由遺傳和環(huán)境共同介導(dǎo)的復(fù)雜生物過程，由多種因素如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和DNA損傷等引起[1]。在大多數(shù)情況下，與衰老有關(guān)的疾病和程序性細(xì)胞死亡主要由細(xì)胞氧化應(yīng)激引起[2]。越來越多的證據(jù)表明，天然活性物質(zhì)（如多肽）具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以提高機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力，減輕氧化損傷，并通過控制衰老過程中重要基因的表達(dá)和相關(guān)途徑的相互作用來延緩衰老，但目前鮮有具有明確抗衰老功效的藥物；因此，尋找抗衰老的天然活性物質(zhì)對于延緩衰老具有十分重要的意義[3]。

牡蠣是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要物種，對全世界的漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重大的經(jīng)濟(jì)效益，在營養(yǎng)和藥用方面也體現(xiàn)出極高的價值，是我國衛(wèi)生部公布的第一批藥食同源食品原料，含多種氨基酸、維生素，還富含鈣、磷、鐵、鋅、硒等營養(yǎng)成分，并具有治虛弱、解丹毒、降血壓、滋陰壯陽等功能[4]。福建省海洋貝類資源豐富，2016年海水貝類產(chǎn)量276.4×104t，占全省海水養(yǎng)殖產(chǎn)量的63.9%；養(yǎng)殖面積為82 389 hm2，占全省海水養(yǎng)殖面積的47.2%，而牡蠣是福建省沿海最重要的養(yǎng)殖貝類[5]。在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，牡蠣含有豐富的蛋白質(zhì)，使用中性蛋白酶酶解牡蠣肉糜得到的牡蠣多肽具有較強(qiáng)的羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，能顯著增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗氧化能力；此外，牡蠣多肽組分OE-I的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)其組分主要含有10 個肽序列[6]。Miao Jianyin等[7]探究復(fù)合蛋白酶酶解牡蠣肉（OM）的特性，用6 kDa超濾膜將牡蠣水解產(chǎn)物（OH）分離成OH-I（＜6 kDa）和OH-II（＞6 kDa）兩個組分，考察了OM、OH、OH-I和OH-II組分的抗氧化活性，并進(jìn)一步分析了OH-I和OH-II的抗疲勞作用，結(jié)果表明，OH-I具有很強(qiáng)的抗氧化活性，與對照組相比，OH-I能顯著延長小鼠的游泳時間。Umayaparvathi等[8]使用SU12蛋白酶酶解牡蠣，發(fā)現(xiàn)酶解制備的抗氧化肽有較強(qiáng)的過氧化氫自由基清除活性和羥自由基清除活性，通過超高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)一步純化活性肽段，共收集到7 種抗氧化肽，其中的SCAP 1、SCAP 3和SCAP 7這3 種多肽對DPPH自由基有很強(qiáng)的清除能力。宋文靜[9]發(fā)現(xiàn)用中性蛋白酶酶解的牡蠣蛋白和經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱分離純化后的組分均具有較好的DPPH自由基清除能力，并發(fā)現(xiàn)分離的牡蠣肽NA、NB組分對雙氧水誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用?？寡趸牡幕钚耘c其分子質(zhì)量大小密切相關(guān)，分子質(zhì)量較小的多肽活性相對較好，雖然已經(jīng)有研究證實(shí)了牡蠣多肽的抗氧化作用，但是關(guān)于其體內(nèi)抗氧化和延緩衰老的報道仍比較少，其作用機(jī)制尚不明晰，因此本實(shí)驗(yàn)將對牡蠣多肽延緩衰老的機(jī)制作進(jìn)一步研究。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的模式生物，具有生命周期短、繁殖能力強(qiáng)、飼養(yǎng)簡單、便于計(jì)數(shù)和觀察等特點(diǎn)，國際上公認(rèn)為線蟲在抗氧化和延緩衰老研究領(lǐng)域中具有優(yōu)勢[10-11]。Vayndorf等[12]研究了全蘋果提取物對線蟲壽命和體內(nèi)抗脅迫能力的影響，結(jié)果表明，經(jīng)全蘋果提取物處理后，線蟲的平均壽命和最長壽命均顯著延長，且具有劑量依賴性。金司儀[13]以秀麗隱桿線蟲為模式生物，探究了不同粒度的三七粉對線蟲壽命的影響，結(jié)果表明，三七粉可以延長線蟲的壽命，具有一定的抗衰老作用。本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲為模型，測定不同質(zhì)量濃度的牡蠣多肽組分OE-I對線蟲正常情況下壽命、急性氧化應(yīng)激情況下壽命和熱應(yīng)激情況下壽命的影響，以及線蟲體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、細(xì)胞凋亡、體內(nèi)抗氧化酶活力和相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，對牡蠣多肽的抗氧化活性以及抗衰老的作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為海洋生物資源的精深加工及抗衰老功能食品的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

野生N2型秀麗隱桿線蟲 福建上源生物科學(xué)技術(shù)有限公司。

牡蠣 福州市金山大潤發(fā)超市。

Western及細(xì)胞IP裂解液 上海碧云天生物技術(shù)公司；2’,7’-二乙酸二氯熒光素（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA） 中性蛋白酶（50 000 U/g）、VC、DPPH 北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；吖啶橙、鹽酸左旋咪唑、UNlQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Green染料法Mix 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 日本久保田株式會社；人工氣候箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀、ABI多功能聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、ABI7300實(shí)時熒光定量PCR儀 美國賽默飛公司；熒光顯微鏡 德國卡爾-蔡司股份公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣多肽的制備

稱取適量牡蠣肉糜，選用中性蛋白酶進(jìn)行酶解，固液比（牡蠣肉糜/超純水）為1∶10，加酶量1 400 U/g（以牡蠣肉糜質(zhì)量計(jì)），調(diào)節(jié)pH值為7.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間4.0 h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，5 000 r/min離心30 min，分離上清液即為牡蠣酶解液（oyster enzymatic hydrolysate，OE），采用截留分子質(zhì)量分別為10、5 kDa的超濾膜對酶解液進(jìn)行分級，收集得到3 個組分OE-I（＜5 kDa）、OE-II（5～10 kDa）與OE-III（＞10 kDa）樣品，分別冷凍干燥，儲存?zhèn)溆肹6]。

1.3.2 牡蠣多肽的體外抗氧化活性評價

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測定

取0.5 mL的DPPH溶液（0.4 mmol/L），分別加入0.5 mL不同質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液并混勻，同時以VC作為陽性對照，以超純水代替樣品為空白組，以超純水代替DPPH溶液為對照組，在避光、室溫的條件下反應(yīng)30 min，于517 nm波長處檢測其吸光度，每個質(zhì)量濃度樣品做3 個平行。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對照組的吸光度。

1.3.2.2 羥自由基清除能力測定

取0.5 mL的FeSO4溶液（15 mmol/L）和1 mL不同質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液混合，再加50 μL體積分?jǐn)?shù)為0.03%的H2O2啟動反應(yīng)，37 ℃孵育10 min，最后加入150 μL的水楊酸-乙醇溶液（20 mmol/L），在37 ℃反應(yīng)30 min，在562 nm波長處測定的吸光度為A1，以超純水代替水楊酸-乙醇為對照組，所測定的吸光度為A2，以超純水代替樣品為空白組，所測定的吸光度為A0，以VC作為陽性對照，每個質(zhì)量濃度樣品做3 個平行。按式（2）計(jì)算羥自由基清除率。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

取4.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2、50 mmol/L）分別與1 mL不同質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液混合，25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，再加入0.4 mL的鄰苯三酚溶液（25 mmol/L），混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，最后加入1 mL的HCl溶液（8 mmol/L）終止反應(yīng)，于325 nm波長處測定吸光度A1，以超純水代替鄰苯三酚溶液為對照組，所測定的吸光度為A2，以超純水代替樣品溶液為空白組，所測定的吸光度為A0，以VC作為陽性對照，每個質(zhì)量濃度樣品做3 個平行。按式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

1.3.2.4 亞鐵離子螯合能力測定

取50 μL不同質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的OE-I、OE-II與OE-III樣品溶液分別與185 μL的甲醇和5 μL的FeCl2溶液（2 mmol/L）混合，加入10 μL的菲啰嗪溶液（5 mmol/L）開始反應(yīng)，在室溫下靜置10 min后，在562 nm波長處測其吸光度A1，以超純水代替菲啰嗪溶液為對照組，所測定的吸光度為A2，以超純水代替樣品溶液為空白組，所測定的吸光度為A0，以乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）為陽性對照，每個質(zhì)量濃度樣品做3 個平行。按式（4）計(jì)算亞鐵離子螯合率。

1.3.3 線蟲同期化處理

挑選含有大量產(chǎn)卵期雌雄同體線蟲的培養(yǎng)基，用M9緩沖液（3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl溶解于1 L的超純水中，高壓滅菌后加入1 mL的1 mol/L MgSO4）吹洗培養(yǎng)基數(shù)次，使菌苔中附著的線蟲和蟲卵脫落，用滅菌的1.5 mL離心管收集含線蟲的洗液，加1 mL的M9緩沖液沖洗蟲體，1 000 r/min離心1 min棄上清液，重復(fù)3 次，再加入現(xiàn)配的1 mL細(xì)胞裂解液裂解線蟲，振蕩后，在顯微鏡下觀察，直至大部分蟲體裂解，將離心管于6 000 r/min下離心1 min，棄上清液，加M9緩沖液洗滌3 次，將洗滌后的蟲卵轉(zhuǎn)移至線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）上，在20 ℃恒溫下培養(yǎng)48 h后蟲卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，即完成同期化。

1.3.4 線蟲壽命實(shí)驗(yàn)

將同期化的線蟲隨機(jī)分為4 組，每組設(shè)置3 個平行，每板30 只，分別為空白組（0 μg/mL）及不同質(zhì)量濃度的OE-I（20、40、80 μg/mL）的實(shí)驗(yàn)組。將線蟲轉(zhuǎn)移到NGM上，然后在20 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，此時記為第0天，每2 d更換NGM培養(yǎng)基并記錄死蟲和活蟲的數(shù)量（用鉑金絲輕輕觸碰線蟲沒有反應(yīng)，即認(rèn)為是死蟲），直至所有線蟲死亡為止。根據(jù)線蟲生存和死亡的時間繪制生存曲線[14]。

1.3.5 線蟲急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節(jié)方法培養(yǎng)72 h后，將各組線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM上，此時每10 mL NGM培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)30%的雙氧水10 μL，每1 h記錄一次線蟲存活數(shù)量，直至線蟲全部死亡。根據(jù)線蟲生存和死亡的時間繪制生存曲線。

1.3.6 線蟲熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節(jié)方法培養(yǎng)72 h后，將各組線蟲轉(zhuǎn)移至35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h記錄一次線蟲存活數(shù)量，直至線蟲全部死亡。根據(jù)線蟲生存和死亡的時間繪制生存曲線。

1.3.7 線蟲體內(nèi)ROS水平的測定

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節(jié)方法培養(yǎng)72 h后，收集各組線蟲，用M9緩沖液沖洗3 次。ROS水平測定：將線蟲轉(zhuǎn)移到含20 μL H2DCF-DA的180 μL M9緩沖液中，室溫黑暗中孵育30 min，M9緩沖液沖洗3 次，用酶標(biāo)儀檢測線蟲的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485、530 nm[15]。

1.3.8 線蟲細(xì)胞凋亡染色測定

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節(jié)方法培養(yǎng)72 h后，收集各組線蟲，用M9緩沖液沖洗3 次。細(xì)胞凋亡染色測定：將線蟲轉(zhuǎn)移到200 μL的吖啶橙溶液（25 μg/mL）中，室溫黑暗中孵育1 h，用M9緩沖液洗除染液后，將線蟲轉(zhuǎn)移到空白NGM培養(yǎng)皿上，用鹽酸左旋咪唑溶液（60 μg/mL）麻醉線蟲，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%瓊脂糖載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察線蟲，拍照并計(jì)算熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485、530 nm。

1.3.9 線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的測定

收集同期化線蟲，將線蟲按照1.3.4節(jié)方法培養(yǎng)72 h，用M9緩沖液清洗3 次，然后加入200 μL的細(xì)胞裂解緩沖液，在冰上孵育1 h，用手持式勻漿機(jī)勻漿處理后在3 000 r/min下離心5 min，取上清液，分別用SOD、CAT、GSH-Px活力測定試劑盒檢測相應(yīng)酶活力[16]。

1.3.10 衰老相關(guān)基因表達(dá)水平的測定

收集培養(yǎng)72 h后的線蟲，用M9緩沖液沖洗。采用試劑盒提取總RNA并通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時熒光定量PCR采用SYBR染料法和ABI 7300 PCR系統(tǒng)進(jìn)行。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2.5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。引物的設(shè)計(jì)如表1所示，act-1為mRNA的內(nèi)參基因，基因表達(dá)量以2—ΔΔCt法計(jì)算[17]。

表1 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所用引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative polymerase chain reaction (qPCR)

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件、Origin 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖，用Image Pro Plus 6.0軟件定量線蟲的熒光強(qiáng)度，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS R26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對線蟲壽命的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及對線蟲抗氧化相關(guān)生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣多肽的體外抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度的牡蠣多肽組分對DPPH自由基的清除率如圖1所示，3 個組分多肽都表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，在2～10 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，牡蠣多肽組分的DPPH自由基清除率增大，3 個組分都表現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中組分OE-I的DPPH自由基清除率高于OE-III，OE-II的DPPH自由基清除率略低于OE-I，組分OE-I的DPPH自由基清除率最高。

圖1 OE-I、OE-II、OE-III及VC對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of OE-I, OE-II, OE-III and VC

2.1.2 羥自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度的牡蠣多肽組分對羥自由基的清除率如圖2所示，3 個組分多肽均具有一定的羥自由基清除能力，且其羥自由基清除能力與質(zhì)量濃度之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，OE-I組分的羥自由基清除能力較其他兩個組分高，明顯高于組分OE-III，且在高質(zhì)量濃度（10 mg/mL）下，組分OE-I的羥自由基清除能力接近陽性對照VC。

圖2 OE-I、OE-II、OE-III及VC的羥自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging capacity of OE-I, OE-II, OE-III and VC

2.1.3 超氧陰離子自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度的牡蠣多肽組分對超氧陰離子自由基的清除率如圖3所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，各組分的超氧陰離子自由基清除率均呈上升趨勢，且組分OE-I的清除率最高，與組分OE-III相比差異明顯。

圖3 OE-I、OE-II、OE-III及VC的超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging capacity of OE-I, OE-II,OE-III and VC

2.1.4 亞鐵離子螯合能力

不同質(zhì)量濃度牡蠣多肽組分的亞鐵離子螯合率如圖4所示，隨著質(zhì)量濃度的升高，各組分的亞鐵離子螯合能力均呈上升趨勢，且組分OE-I的活性最高，與其他兩組分相比差異明顯。牡蠣多肽具有高含量的谷氨酸及天冬氨酸，為牡蠣多肽提供了亞鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，其亞鐵離子螯合能力可能與氨基酸的組成有關(guān)[18]。

圖4 OE-I、OE-II、OE-III及EDTA的亞鐵離子螯合能力Fig.4 Ferrous ion chelating capacity of OE-I, OE-II, OE-III and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)

2.2 牡蠣多肽對線蟲壽命的影響

壽命是評價牡蠣多肽抗衰老效果最直接的指標(biāo)[19]。由表2可知，空白組平均壽命為14.53 d，最長壽命為15.71 d，OE-I中劑量組線蟲的平均壽命和最長壽命分別相比空白組延長了14.73%（P＜0.05）和25.59%（P＜0.05），OE-I高劑量組線蟲的平均壽命和最長壽命分別相比空白組延長了35.37%（P＜0.01）和43.92%（P＜0.05）。線蟲的生命曲線如圖5所示，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲的壽命隨著牡蠣多肽質(zhì)量濃度的升高而延長，且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明牡蠣多肽OE-I可以延長線蟲的壽命，發(fā)揮抗衰老作用。

表2 牡蠣多肽對線蟲壽命的影響Table 2 Effects of oyster peptides on the lifespan of C.elegans

圖5 線蟲的壽命曲線Fig.5 Lifespan curves of C.elegans

2.3 牡蠣多肽對線蟲急性氧化應(yīng)激的影響

由表3可知，空白組平均壽命為2.48 h，最長存活時間為6 h；OE-I高劑量組線蟲的平均壽命最長，與空白組相比有極顯著差異（P＜0.01）。線蟲的壽命曲線如圖6所示，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲壽命與牡蠣多肽質(zhì)量濃度有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明牡蠣多肽OE-I對雙氧水氧化損傷線蟲具有明顯的保護(hù)作用，相對于空白組，在OE-I干預(yù)后，20、40、80 μg/mL劑量組線蟲平均壽命分別延長了6.04%、7.26%及26.21%。

圖6 雙氧水急性氧化應(yīng)激損傷線蟲的壽命曲線Fig.6 Lifespan curves of C.elegans with H2O2-induced acute oxidative stress

表3 牡蠣多肽對雙氧水急性氧化應(yīng)激損傷線蟲壽命的影響Table 3 Effects of oyster peptides on the lifespan of C.elegans with H2O2-induced acute oxidative stress

2.4 牡蠣多肽對線蟲熱應(yīng)激壽命的影響

由表4可知，空白組線蟲的平均壽命為6.33 h，最長存活時間為10 h；在35 ℃時，不同質(zhì)量濃度的牡蠣多肽OE-I對線蟲抵抗熱應(yīng)激能力的分析結(jié)果顯示，OE-I中劑量組線蟲的平均壽命相比空白組延長了13.27%（P＜0.05），OE-I高劑量組線蟲的平均壽命相比空白組延長了22.91%（P＜0.01），牡蠣多肽OE-I中劑量組、高劑量組顯著增強(qiáng)了線蟲的熱應(yīng)激抵抗能力。如圖7所示，牡蠣多肽劑量組線蟲熱應(yīng)激下壽命與牡蠣多肽質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，OE-I高劑量組線蟲的壽命曲線相比空白組明顯右移。

表4 牡蠣多肽對線蟲熱應(yīng)激壽命的影響Table 4 Effects of oyster peptides on the lifespan of C.elegans under heat stress

圖7 熱應(yīng)激下線蟲的壽命曲線Fig.7 Lifespan curves of C.elegans under heat stress

2.5 牡蠣多肽對線蟲體內(nèi)ROS的影響

ROS作為最重要的氧化劑之一，其水平可以間接反映機(jī)體細(xì)胞的氧化程度，其蓄積會對機(jī)體造成氧化損傷[20]。由圖8可知，OE-I中劑量組和高劑量組線蟲細(xì)胞內(nèi)ROS相對含量較正常組顯著降低（P＜0.05），且OE-I高劑量組對線蟲細(xì)胞內(nèi)ROS的下調(diào)能力明顯優(yōu)于OE-I低劑量組。

圖8 牡蠣多肽對線蟲體內(nèi)ROS的影響Fig.8 Effects of oyster peptides on ROS accumulation in C.elegans

2.6 牡蠣多肽對線蟲細(xì)胞凋亡的影響

DNA損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，吖啶橙染色結(jié)果可以反映線蟲DNA的整合狀況，這是由于吖啶橙可以進(jìn)入凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，細(xì)胞在熒光燈照射下呈綠色[21]。如圖9A～D所示，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲蟲體總體呈淺綠色，而空白組線蟲蟲體呈亮綠色，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲蟲體的亮綠色面積小于空白組。此外，由圖9E可知，牡蠣多肽OE-I高劑量組的熒光強(qiáng)度極顯著低于空白組（P＜0.01）。吖啶橙染色結(jié)果的差異表明，牡蠣多肽OE-I可以減輕線蟲DNA的損傷，從而延長線蟲的壽命。

圖9 牡蠣多肽對線蟲細(xì)胞凋亡的影響Fig.9 Effects of oyster peptides on cell apoptosis in C.elegans

2.7 牡蠣多肽對線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的影響

CAT、SOD和GSH-Px是線蟲體內(nèi)主要的抗氧化酶，提高抗氧化酶活力可以清除線蟲體內(nèi)多余的自由基，從而促進(jìn)體內(nèi)氧化平衡[22]。如圖10所示，與空白組相比，牡蠣多肽OE-I各劑量組線蟲體內(nèi)3 種抗氧化酶活力隨著質(zhì)量濃度增加而升高。與空白組相比，OE-I低劑量組、中劑量組和高劑量組線蟲體內(nèi)GSH-Px活力分別是空白組的1.25 倍（P＜0.05）、2.1 倍（P＜0.01）和2.6 倍（P＜0.01）。與空白組相比，OE-I中劑量組和高劑量組線蟲體內(nèi)SOD活力提高，分別為空白組的1.11 倍和1.17 倍（P＜0.05）；OE-I中劑量組和高劑量組線蟲體內(nèi)CAT活力為空白組的1.38 倍（P＜0.05）和1.64 倍（P＜0.01）。以上結(jié)果表明牡蠣多肽OE-I能提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力，從而延長線蟲的壽命。

圖10 牡蠣多肽對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的影響Fig.10 Effects of oyster peptides on antioxidant enzyme activities in C.elegans

2.8 牡蠣多肽對線蟲衰老相關(guān)信號通路的影響

胰島素通路是影響線蟲壽命的典型通路之一，daf-2、daf-16和age-1是主要起調(diào)節(jié)作用的信號基因[23]。由圖11A可知，經(jīng)牡蠣多肽OE-I干預(yù)后，線蟲體內(nèi)daf-2和age-1mRNA的基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，OE-I高劑量組線蟲體內(nèi)的daf-2和age-1mRNA表達(dá)量較空白組相比分別降低了69.1%和42.4%（P＜0.01），daf-16mRNA相對表達(dá)量較空白組相比升高了80.2%（P＜0.01）。skn-1是抵抗氧化應(yīng)激最重要的機(jī)體防御分子，主要通過調(diào)節(jié)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)緩解氧化應(yīng)激引起的機(jī)體損傷；sod-3是線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶家族成員之一，與線蟲過氧化損傷和抗氧化酶有關(guān)。sod-3和mtl-1都是daf-16的下游基因，mtl-1對重金屬毒性和氧化應(yīng)激有一定的保護(hù)作用[24-25]。由圖11B可知，經(jīng)牡蠣多肽干預(yù)后，OE-I高劑量組線蟲體內(nèi)skn-1、sod-3和mtl-1mRNA相對表達(dá)量相比空白組分別升高了62.2%、51.4%和189.5%（P＜0.01），這與實(shí)驗(yàn)組線蟲體內(nèi)SOD抗氧化酶水平提高的結(jié)果相一致。以上結(jié)果表明，牡蠣多肽OE-I可以上調(diào)daf-16及其下游基因mtl-1和sod-3，并上調(diào)機(jī)體防御分子skn-1，以及下調(diào)daf-2和age-1，從而延長線蟲的壽命。

圖11 牡蠣多肽對秀麗隱桿線蟲衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.11 Effects of oyster peptides on expression of senescence-related genes in C.elegans

3 討 論

本研究以DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和亞鐵離子螯合能力為指標(biāo)，對牡蠣多肽體外抗氧化作用進(jìn)行了探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小分子組分OE-I（＜5 kDa）的抗氧化活性最強(qiáng)。在本課題組前期的研究中，對組分OE-I的氨基酸組成和序列進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)其主要含有10 個肽序列，前5 個豐度較高的多肽依次為SFGSGLTPQQQ、GEPGPEGPAGPIGPR、NAVNSLNSQP、GPQGLVGPAG、GEPGPEGPAGPI[6]。蔡樹杏等[26]研究發(fā)現(xiàn)通過酶解獲得的牡蠣酶解液中含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素和維生素，有較強(qiáng)的抗氧化活性。葉昱輝[27]采用酶解法酶解近江牡蠣，將牡蠣多肽進(jìn)行超濾分級并利用Sephadex G-25葡聚糖凝膠進(jìn)一步分離純化得到兩個組分，并對抗氧化活性高的組分進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13 條多肽序列，其中含有較多的七肽，經(jīng)牡蠣多肽干預(yù)后，UV輻照的HaCaT細(xì)胞活力有顯著提升，牡蠣多肽可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路的靶點(diǎn)基因的表達(dá)，從而調(diào)控HaCaT細(xì)胞的抗光老化效應(yīng)，說明牡蠣多肽可以很好地抑制細(xì)胞中ROS自由基的生成。Wang Qiukuan等[28]研究了太平洋牡蠣水解肽的抗氧化活性，將經(jīng)酶解之后的牡蠣多肽進(jìn)一步用Sephadex G-15凝膠過濾層析分離，隨后將分離的兩個生物活性肽用Kromasil C18柱進(jìn)行反相高效液相色譜純化，并測定其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩種新多肽在羥自由基和DPPH自由基清除能力方面表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，其分子質(zhì)量分別為518、440 Da。采用蛋白酶對牡蠣多肽進(jìn)行酶解，能夠得到大分子質(zhì)量的牡蠣多肽，為進(jìn)一步得到活性更高的牡蠣多肽，一般采用超濾法、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法和反向高效液相色譜法等對牡蠣大分子肽進(jìn)行分離純化，以獲取生物活性更高的小分子肽[29]。結(jié)合以上研究結(jié)果與本研究抗氧化實(shí)驗(yàn)相關(guān)結(jié)果，表明牡蠣多肽對于自由基有較強(qiáng)的結(jié)合能力，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且多肽的分子質(zhì)量越小，其抗氧化能力越強(qiáng)。

ROS是氧化代謝的有害產(chǎn)物，它們的積累會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織，加速機(jī)體衰老[30]。一旦機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，過量的ROS會對細(xì)胞造成功能性的氧化損傷，因此，減少ROS積累已被證明是延緩衰老的有效策略[31]。同時，細(xì)胞會產(chǎn)生各種非酶和酶類物質(zhì)來防止氧化反應(yīng)，包括維生素、硒、CAT、SOD和GSH-Px等，它們能催化超氧化物降解產(chǎn)生氧和過氧化氫，從而抑制ROS的積累[32]。線蟲體內(nèi)抗氧化酶被認(rèn)為是影響線蟲壽命的關(guān)鍵因素之一，線蟲體內(nèi)抗氧化能力與壽命有一定的相關(guān)性[33]。李玉英等[34]研究連翹花黃色素對線蟲在氧化應(yīng)激下的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)連翹花黃色素有很好的抗氧化活性，能顯著提高線蟲在氧化應(yīng)激下的壽命，降低線蟲體內(nèi)ROS水平，同時提高CAT、SOD和GSH-Px活力，緩解了線蟲體內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，證明線蟲壽命與抗氧化有關(guān)。陳純[35]通過線蟲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫薯提取物能顯著延長線蟲的壽命，緩解線蟲的衰老，線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力有所增加，相關(guān)抗衰老基因表達(dá)量也有所上調(diào)，并與紫薯提取物的質(zhì)量濃度有劑量關(guān)系。本研究以秀麗隱桿線蟲為模型生物，探究牡蠣多肽組分OE-I對線蟲壽命和體內(nèi)抗氧化能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡蠣多肽組分OE-I能顯著提高線蟲體內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px 3 種抗氧化酶的活力，降低線蟲體內(nèi)ROS水平，并減輕線蟲DNA損傷，對線蟲的壽命有顯著的延長作用。以上研究表明，線蟲壽命與抗氧化能力有一定的關(guān)聯(lián)性，而牡蠣多肽能增強(qiáng)線蟲體內(nèi)抗氧化能力，清除有害的自由基，減輕線蟲的氧化損傷；因此，牡蠣多肽可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的抗氧化能力發(fā)揮其抗衰老作用。

胰島素信號通路是研究機(jī)體衰老的重要信號通路之一，在胰島素信號通路中，受體蛋白與胰島素受體daf-2結(jié)合并激活age-1的表達(dá)，3-磷酸磷脂酰肌醇的水平增加，導(dǎo)致絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化，從而抑制daf-16的表達(dá)[36-37]。本研究結(jié)果表明，牡蠣多肽能顯著下調(diào)daf-2和age-1mRNA的表達(dá)水平，而daf-16的下游基因sod-3、mtl-1mRNA的相對表達(dá)量都顯著升高，sod-3與線蟲體內(nèi)SOD有關(guān)；因此，牡蠣多肽的抗衰老作用可能是通過上調(diào)sod-3的表達(dá)來減少ROS的積累。同時，daf-16和機(jī)體防御分子skn-1mRNA的相對表達(dá)量也顯著升高，證明了牡蠣多肽能通過胰島素信號通路daf-2/daf-16延長線蟲的壽命，并能促進(jìn)機(jī)體防御分子skn-1、sod-3和mtl-1mRNA的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)機(jī)體應(yīng)激抵抗，延長壽命。這與張曉寒等[16]研究發(fā)現(xiàn)根皮素通過調(diào)控daf-2、daf-16和sod-3mRNA的表達(dá)延長線蟲壽命的結(jié)果一致，證實(shí)了daf-16在調(diào)節(jié)線蟲壽命和抗氧化能力方面的重要性。

綜上所述，牡蠣多肽組分OE-I具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，能顯著增加線蟲體內(nèi)抗氧化酶的活力，減輕線蟲體內(nèi)ROS積累導(dǎo)致的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)控胰島素信號通路和氧化應(yīng)激調(diào)控因子skn-1、sod-3和mtl-1的表達(dá)，有效延長線蟲的壽命。今后將對牡蠣多肽組分OE-I進(jìn)一步分離純化，獲得單一的牡蠣多肽組分，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定并開展抗衰老功能評價，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等方法對牡蠣多肽的抗衰老作用機(jī)制進(jìn)行多層次的深入研究?？偠灾?，牡蠣多肽作為一種活性肽，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，對增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和延長壽命有一定的積極作用。