劉曉鳴，張媛媛，林曉蓉，高 雄，周偉堅(jiān)，李 斌,3，陳忠正,3,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東 廣州 510070；3.廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

茶（Camellia sinensis（L.） O.Kuntze）作為普通食品，富含茶多酚、生物堿、維生素、多糖和芳香物質(zhì)等天然化合物，這些化合物賦予茶葉特殊的風(fēng)味和生理活性[1]。香葉醇（geraniol，GOH）是茶葉揮發(fā)性物質(zhì)的重要組成成分，具有調(diào)節(jié)血清膽固醇、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗炎等多種功效[2-4]。作為食品原料的溪黃草，富含唇形科（Iabtea）香茶菜屬（Rabdosia）植物的典型活性物冬凌草甲素（oridonin，ORI），其對多種腫瘤細(xì)胞具有生長抑制、誘導(dǎo)調(diào)亡和自噬等生物活性作用[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，ORI與相關(guān)活性物聯(lián)用具有提升活性物功效的作用。將ORI與香菇多糖聯(lián)用處理HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能起協(xié)同抑制細(xì)胞增殖的作用，并經(jīng)由阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮協(xié)同抗癌活性[8]，將ORI與馬法蘭聯(lián)用也發(fā)現(xiàn)具協(xié)同抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖的作用，并發(fā)現(xiàn)也是通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)抗癌活性[9]。

乳腺癌作為常見的惡性腫瘤，在女性中發(fā)病率最高，且呈逐年上升的趨勢。流行病學(xué)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國及日本等亞洲國家的乳腺癌發(fā)病率普遍低于歐美地區(qū)，認(rèn)為與亞洲國家喜食水果蔬菜的飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)[10]。大量的研究揭示，蔬菜和水果等植物源食品中含豐富的天然化學(xué)物質(zhì)，它們在人體攝入后可通過相加、協(xié)同等作用在體內(nèi)發(fā)揮生物活性，對癌癥、阿爾茨海默癥等慢性疾病的預(yù)防起到積極作用[11]。茶葉作為富含生物活性物的世界三大無酒精飲料之一，其揮發(fā)性組分中的GOH已被證明具有抑制乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肝癌等多種癌細(xì)胞增殖的生物活性[12]，但其與ORI聯(lián)用是否具有促進(jìn)抗癌效果的研究鮮見報(bào)道。本研究選取人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系為模型，探討GOH和ORI聯(lián)用對癌細(xì)胞生長的影響及可能的作用機(jī)制。研究的開展有助于增進(jìn)對飲食中天然活性物間協(xié)同增效的認(rèn)識，并引導(dǎo)優(yōu)化日常飲食結(jié)構(gòu)促進(jìn)疾病預(yù)防。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；ORI（純度≥98%） 北京普博欣生物科技有限公司；GOH（純度≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶、杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS） 美國Gibco公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡試劑盒 美國Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3、Caspase-9分光光度法檢測試劑盒 南京凱基生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VERSA max酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；HH2型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；Ckx41顯微鏡日本Olympus公司；FACSJAZZ流式細(xì)胞儀 美國BD公司；Centrifuge 5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；OmegaLumG化學(xué)發(fā)光儀 美國Aplegen公司；渦旋混合儀 江蘇麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔2 d繼代一次。培養(yǎng)液組成為89%（體積分?jǐn)?shù)）1640培養(yǎng)基、10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS、1%（體積分?jǐn)?shù)）青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）。

1.3.2 細(xì)胞增殖抑制率的測定

取生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞，利用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2.5×104個/mL，接種于96 孔板，每孔200 μL，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，棄去100 μL舊培養(yǎng)液，分別添加100 μL含ORI（0.625、1.25、2.5、5、7.5、10 μg/mL）或GOH（12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）的無血清培養(yǎng)基（即1640培養(yǎng)基，后同），對照組添加無血清培養(yǎng)基，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出96 孔板，將孔板中培養(yǎng)液棄去，每孔加入10 μL噻唑藍(lán)（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）溶液（5 mg/mL）37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，棄去MTT溶液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，置于搖床100 r/min振蕩15 min，用酶標(biāo)儀測定其在550 nm波長處的吸光度A。按式（1）計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，根據(jù)曲線擬合出ORI和GOH單獨(dú)作用時的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

1.3.3 抗癌交互作用及參數(shù)計(jì)算

參考Chou Tingchao等[13-14]的報(bào)道。細(xì)胞鋪板培養(yǎng)同1.3.2節(jié)，根據(jù)ORI和GOH單獨(dú)作用時的IC50值，分別以O(shè)RI和GOH質(zhì)量濃度為0.125 IC50、0.25 IC50、0.50 IC50、1.0 IC50和2 IC50作為聯(lián)合作用的質(zhì)量濃度，在對應(yīng)的質(zhì)量濃度兩兩混合或單獨(dú)添加GOH、ORI，對照組為無血清培養(yǎng)基。按照1.3.2節(jié)方法測定細(xì)胞增殖抑制率，根據(jù)聯(lián)合作用的效果，計(jì)算化合物對腫瘤細(xì)胞MCF-7的交互作用參數(shù)，即聯(lián)合作用指數(shù)（combination index，CI）和劑量減少指數(shù)（dose reduction index，DRI）。CI＞1、CI＝1和CI＜1分別表示藥物間具有拮抗、加和及協(xié)同作用；DRI表示在相同作用水平下，協(xié)同使用時的藥物劑量與單獨(dú)使用的藥物劑量比值，藥物聯(lián)合作用的CI及DRI值采用CompuSy軟件輔助計(jì)算。

1.3.4 MCF-7細(xì)胞凋亡率的測定

取生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞，利用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104個/mL，接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，每皿6 mL，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去舊培養(yǎng)液，根據(jù)1.3.3節(jié)所得協(xié)同抑制MCF-7細(xì)胞增殖效果最佳組合，以無血清培養(yǎng)基對照組，分別添加6 mL含GOH（102.81 μg/mL）、ORI（4.32 μg/mL）和GOH（102.81 μg/mL）+ORI（4.32 μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基，記為GOH、ORI、GOH+ORI組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)皿收集舊培養(yǎng)液，細(xì)胞經(jīng)DPBS洗2 遍，每皿加入2 mL胰酶，消化后，500×g、4 ℃離心5 min，收集細(xì)胞，同樣條件DPBS洗2 次，離心棄上清后，加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸，取200 μL于新離心管中作為空白對照，其余的加入5 μL Annexin V試劑，避光反應(yīng)15 min后，加入10 μL碘化丙啶（propidine iodide，PI）試劑，混勻后于流式細(xì)胞儀上檢測。

1.3.5 活性氧水平檢測

細(xì)胞鋪皿、樣品處理、收集細(xì)胞同1.3.4節(jié)，用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3 次，用無血清培養(yǎng)基稀釋2’,7’-二氯二氫熒光素-雙乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至終質(zhì)量濃度為10 μmol/L，將細(xì)胞懸浮于稀釋后的DCFH-DA中，37 ℃孵育20 min，離心后用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，并加入200 μL DPBS溶液重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 線粒體膜電位檢測

細(xì)胞鋪皿、樣品處理、收集細(xì)胞同1.3.4節(jié)，DPBS清洗后，加入JC-1染色工作液，37 ℃孵育30 min，離心后使用JC-1染色緩沖液清洗2 次，加入200 μL DPBS溶液重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.7 凋亡蛋白活化程度檢測

Caspase-3、Caspase-9蛋白活化程度檢測采用分光光度法進(jìn)行，細(xì)胞鋪皿、樣品處理、收集細(xì)胞同1.3.4節(jié)，DPBS清洗后，加入含苯甲基磺酰氟（終濃度為1 mmol/L）的裂解液，充分裂解后，14 000×g離心15 min，取上清即為細(xì)胞總蛋白，使用Braford法測定各樣品的蛋白濃度，按照試劑盒步驟進(jìn)行測定。

細(xì)胞色素c相對表達(dá)量的檢測采用Western blot方法進(jìn)行，蛋白收集步驟與上述一致，使用BCA法測定各樣品的蛋白質(zhì)量濃度，將提取得到的蛋白樣品與上樣緩沖液按4∶1的體積比混合，沸水浴10 min，冷卻后取蛋白樣品各20 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓80 V電泳30 min，然后電壓120 V電泳120 min），電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜，用TBST溶液洗膜4 次（每次5 min），將聚偏氟乙烯膜置于封閉液中室溫封閉1 h后進(jìn)行一抗（1∶1 000）孵育（4 ℃過夜）；洗膜后加入TBST溶液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，洗膜后進(jìn)行增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，OmegaLum G化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并拍照記錄結(jié)果，采用測定蛋白條帶灰度值，按式（2）計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.3.8 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞鋪板、樣品處理、收集細(xì)胞同1.3.4節(jié)，DPBS清洗后于體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中4 ℃固定過夜，500×g離心5 min，4 ℃預(yù)冷的DPBS洗滌細(xì)胞沉淀2 次，加入PI和RNase A于37 ℃孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用FlourChem 5500軟件進(jìn)行蛋白條帶光密度分析，采用CytExpert軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡與線粒體膜電位分析，采用Flowjo軟件進(jìn)行ROS水平、細(xì)胞周期分析，采用Oringin 8.0軟件作圖，計(jì)算樣品對MCF-7細(xì)胞的IC50值，采用Duncan事后檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GOH與ORI單獨(dú)作用對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

如圖1所示，以不同質(zhì)量濃度GOH、ORI分別處理MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞增殖抑制率隨GOH、ORI質(zhì)量濃度的增加而增加，并呈濃度依賴關(guān)系。經(jīng)計(jì)算擬合GOH和ORI作用于MCF-7細(xì)胞48 h的IC50值分別為102.81 μg/mL和4.32 μg/mL。結(jié)果表明GOH和ORI均能有效抑制MCF-7細(xì)胞生長。

圖1 GOH與ORI單獨(dú)作用對MCF-7細(xì)胞的影響（n＝3）Fig.1 Effect of GOH and ORI alone on the proliferation of MCF-7 cells(n = 3)

2.2 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

根據(jù)圖1得到的IC50，設(shè)計(jì)不同質(zhì)量濃度的GOH和ORI聯(lián)用處理MCF-7細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示，GOH及ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率呈劑量依賴關(guān)系，在其IC50值質(zhì)量濃度時可抑制86%的細(xì)胞增殖，明顯高于單獨(dú)作用時的效果。為評價聯(lián)合作用效果，根據(jù)Chou-Talalay聯(lián)合用藥指數(shù)法及運(yùn)用CompuSy軟件計(jì)算，得出GOH和ORI在0.125 IC50、0.25 IC50、0.50 IC50、1.0 IC50和2 IC50時的聯(lián)合作用指數(shù)CI（表1），所得CI均小于1，表明GOH和ORI聯(lián)用具協(xié)同作用，且質(zhì)量濃度在各對應(yīng)IC50值（GOH IC50＝102.81 μg/mL，ORI IC50＝4.32 μg/mL）時CI值小，且DRI值均大于1，協(xié)同抑制細(xì)胞增殖效果最佳，后續(xù)選擇此質(zhì)量濃度進(jìn)行機(jī)理探究。

圖2 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞的影響（n＝3）Fig.2 Effect of GOH combined with ORI on the proliferation of MCF-7 cells (n = 3)

表1 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞的抗癌活性（n=3）Table 1 Anticancer activity of GOH combined with ORI on MCF-7 cells (n = 3)

2.3 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

對處理的細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染后，運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。由圖3可知，對照組僅有（2.80±0.72）%的細(xì)胞凋亡率，ORI和GOH單獨(dú)處理時細(xì)胞凋亡率分別為（7.13±1.14）%和（12.82±0.92）%，兩者聯(lián)用時細(xì)胞凋亡率顯著增加到（79.24±1.38）%。結(jié)果表明，GOH聯(lián)合ORI可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制MCF-7細(xì)胞增殖。

圖3 GOH及ORI單獨(dú)及聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響（n＝ 3）Fig.3 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the apoptosis of MCF-7 cells (n = 3)

2.4 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

采用DCFH-DA熒光探針結(jié)合熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行檢測，由圖4可知，與對照組相比，GOH和ORI單獨(dú)處理均能顯著增加MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平，且后者的作用效果顯著高于前者，當(dāng)GOH和ORI聯(lián)用處理時，MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于GOH和ORI單獨(dú)處理組。ORI和GOH單獨(dú)處理組、聯(lián)用處理組MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別提高至對照組的1.42、13.28、27.03 倍，表明GOH和ORI聯(lián)用可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，造成氧化損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖4 GOH及ORI單獨(dú)及聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響（n＝ 3）Fig.4 Effect of GOH and ORI alone and in combination on intracellular ROS generation in MCF-7 cells (n = 3)

2.5 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

采用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位變化，線粒體功能紊亂的標(biāo)志是線粒體膜電位下降，線粒體功能與細(xì)胞色素c的釋放息息相關(guān)，因此線粒體膜電位變化在線粒體通路的凋亡中起著關(guān)鍵作用。由圖5可知，與對照組（5.37%）相比，ORI與GOH單獨(dú)處理時，綠色熒光細(xì)胞百分比分別提高至13.36%和20.75%，均能顯著降低線粒體膜電位，當(dāng)ORI與GOH聯(lián)合處理時，綠色熒光細(xì)胞百分比提高至49.59%，線粒體膜電位下降程度顯著高于ORI與GOH單獨(dú)處理組。說明GOH聯(lián)合ORI可通過降低MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位造成線粒體功能紊亂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖5 GOH及ORI單獨(dú)及聯(lián)合作用對MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位的影響（n＝ 3）Fig.5 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the mitochondrial membrane potential of MCF-7 cells (n = 3)

2.6 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的影響

為深入探討GOH和ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，采用試劑盒分光光度法及Western blot技術(shù)分別檢測了細(xì)胞凋亡啟動及執(zhí)行的Caspase家族蛋白（包括Caspase-3和Caspase-9）活化程度和線粒體通路標(biāo)志蛋白細(xì)胞色素c相對表達(dá)量。由圖6可知，GOH聯(lián)合ORI能夠上調(diào)Caspase-3、Caspase-9活化程度，分別是對照組的1.91、1.79 倍；與對照組相比，ORI單獨(dú)用藥對Caspase-3活化程度無顯著影響，但能顯著提高Caspase-9的活化程度；GOH單獨(dú)用藥組與對照組相比，Caspase-3和Caspase-9活化程度均得到顯著提高。由圖7可知，ORI和GOH單獨(dú)用藥及兩者聯(lián)用都能顯著促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素c的釋放，細(xì)胞色素c相對表達(dá)量分別是對照組的1.71、2.56、3.01 倍。結(jié)果表明，GOH聯(lián)合ORI能促使MCF-7細(xì)胞線粒體內(nèi)膜細(xì)胞色素c釋放，激活Caspase-3和Caspase-9，從而通過線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

圖6 GOH及ORI單獨(dú)及聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞凋亡蛋白的影響（n＝ 3）Fig.6 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the activation of apoptosis-related proteins in MCF-7 cells (n = 3)

圖7 GOH及ORI單獨(dú)及聯(lián)合作用對MCF-7細(xì)胞細(xì)胞色素c相對表達(dá)量的影響（n＝3）Fig.7 Effect of GOH and ORI alone and in combination on the expression level of cytochrome c in MCF-7 cells (n = 3)

2.7 GOH與ORI聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分布的變化是細(xì)胞凋亡的重要評價指標(biāo)，采用流式細(xì)胞儀檢測GOH和ORI單獨(dú)和聯(lián)合使用對MCF-7細(xì)胞周期的變化。由圖8可知，ORI和GOH單獨(dú)及聯(lián)用后，細(xì)胞在S期比例均顯著提高至（26.77±3.77）%、（28.42±0.06）%和（38.41±1.61）%，分別為對照的2.02、2.15、2.91 倍。結(jié)果表明，GOH和ORI兩者聯(lián)用能夠阻止細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，細(xì)胞大量聚集在S期并發(fā)生凋亡。

圖8 GOH和ORI單獨(dú)及聯(lián)用對MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響（n＝3）Fig.8 Effect of GOH and/or ORI on the cell cycle of MCF-7 cells (n = 3)

3 討 論

生物活性物質(zhì)聯(lián)用對于其功能發(fā)揮具重要意義。生物活性物質(zhì)聯(lián)用常表現(xiàn)為大于單獨(dú)使用效果之和的協(xié)同作用，或是等于單獨(dú)作用效果之和的相加作用，亦或是減弱單獨(dú)使用效果的拮抗作用[15]。姜黃中的姜黃素與胡椒堿聯(lián)用表現(xiàn)很好的協(xié)同效果[16]，茶葉中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯與紫杉醇聯(lián)用也表現(xiàn)很好的協(xié)同功效[17]。GOH作為除黑茶外的各類茶葉中重要的揮發(fā)性物質(zhì)，在茶葉的品質(zhì)和功能發(fā)揮中扮演重要角色。有研究表明，將GOH和5-氟尿嘧啶聯(lián)合處理Caco-2和SW620細(xì)胞時表現(xiàn)協(xié)同作用，聯(lián)合處理腫瘤小鼠時依然表現(xiàn)很好的協(xié)同作用，能使小鼠腫瘤體積減少量由GOH單獨(dú)作用時的26%上升到53%[18]。本研究設(shè)計(jì)將GOH與ORI聯(lián)用探討對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長的影響，結(jié)果表明兩者聯(lián)用具較好的協(xié)同效應(yīng)，能顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖，推測ORI與GOH聯(lián)用能增加癌細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性[19]，促進(jìn)ORI的有效吸收有關(guān)。本研究結(jié)果在細(xì)胞水平證實(shí)了茶葉中的揮發(fā)性物質(zhì)GOH與其他食品原料中的活性物所具有的協(xié)作效應(yīng)，為將茶葉與其他食品復(fù)配發(fā)展茶食品發(fā)揮預(yù)防保健作用提供重要參考。

近年來抗癌機(jī)制的研究往往集中于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞自噬等方面[20-22]。其中，細(xì)胞周期的調(diào)控失調(diào)是導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控的重要原因，因此細(xì)胞周期的調(diào)控成為癌癥控制的關(guān)鍵[23]。有研究表明，GOH可通過誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用[24]，也可引起人肺癌細(xì)胞A549阻滯在G0/G1期，顯著抑制A549細(xì)胞生長[25]，并對MCF-7細(xì)胞呈劑量依賴關(guān)系產(chǎn)生了類似的效應(yīng)[26]。另外，ROS作為細(xì)胞代謝過程中由線粒體產(chǎn)生的含氧活性化合物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。高濃度的ROS可氧化細(xì)胞成分如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等而破壞細(xì)胞完整性，致使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激[27]，出現(xiàn)自由基攻擊線粒體膜磷脂，致使線粒體膜電位喪失和細(xì)胞色素c等膜間蛋白從線粒體中釋放[28]。有報(bào)道指出，ORI可誘導(dǎo)內(nèi)源性（或線粒體依賴）和外源性（或死亡受體依賴）凋亡途徑，通過激活Caspase-9和Caspase-3誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡[29]，或通過激活A(yù)MPK通路誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡[30]。本研究利用GOH和ORI聯(lián)合處理MCF-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能將MCF-7細(xì)胞增殖阻滯于S期，并檢測到細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞色素c相對表達(dá)量、Caspase-9與Caspase-3的活化程度均得到升高，證實(shí)ORI與GOH聯(lián)用具協(xié)同抑制MCF-7細(xì)胞增殖作用并主要經(jīng)由激活線粒體凋亡通路和促進(jìn)細(xì)胞周期的阻滯有關(guān)。

綜上所述，GOH聯(lián)合ORI能夠協(xié)同抑制MCF-7細(xì)胞生長，并主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS造成氧化損傷，引起線粒體功能紊亂并使細(xì)胞色素c從線粒體間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase-9和Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)抗癌活性。