陶 嘉，唐 超，孟凡強，周煒瑋，周立邦，陸兆新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，這導(dǎo)致肥胖及其他各種代謝性疾病發(fā)生率顯著提升，例如高血脂癥、高血壓、動脈粥樣硬化等疾病，尤其是心腦血管疾病已經(jīng)成為我國死亡率第一的疾病，這引發(fā)了大眾的廣泛關(guān)注。肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官，并且脂類代謝的紊亂主要發(fā)生在肝臟，所以肝臟內(nèi)異常的脂質(zhì)代謝會導(dǎo)致脂肪肝、肝細胞相關(guān)的慢性疾病、高血脂癥等代謝綜合征的發(fā)生[1-2]。

進入肝臟的游離脂肪酸被氧化后產(chǎn)生能量，或者被儲存合成為甘油三酯。游離脂肪酸有一定的脂毒性，會引發(fā)細胞功能障礙和細胞凋亡。棕櫚酸（palmitic acid，PA）是人類血漿中最豐富的一類飽和脂肪酸[3]，非脂肪組織的細胞長期暴露于較高濃度的PA時，會刺激細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，脂質(zhì)積累，甚至是細胞凋亡的現(xiàn)象。因為肝臟中甘油三酯的積聚是發(fā)生脂肪肝的主要原因，所以很多研究人員以PA為誘導(dǎo)劑構(gòu)建脂肪肝模型，通過降低脂質(zhì)積聚程度來評價活性物質(zhì)的降脂潛力[4-8]。

黑木耳，又名光木耳、黑菜、樹雞，屬于真菌門，擔子菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬。其廣泛種植于東南亞，中國產(chǎn)量第一，是中國人十分喜愛的中國傳統(tǒng)美食[9]，黑木耳性平味甘，具有滋補、潤燥、養(yǎng)血益胃的作用[10]。關(guān)于木耳及其活性成分的降脂作用，已有很多報道，Huang Zirui等[11]發(fā)現(xiàn)，黑木耳70%醇提物具有降低血脂和預(yù)防脂肪肝變性的作用，Zhang Tingting等[12]發(fā)現(xiàn)黑木耳及其多糖具有降血脂和改善腸道菌群的作用，張淑曼等[13]發(fā)現(xiàn)毛木耳蛋白具有保護酒精性脂肪肝損傷的作用，但是目前關(guān)于黑木耳多肽的功能活性的研究較少。

本實驗以黑木耳為原料，通過提取蛋白，將其酶解成多肽后，超濾獲得不同分子質(zhì)量的多肽。用PA誘導(dǎo)人類肝癌HepG2細胞構(gòu)建脂肪肝細胞模型后，在培養(yǎng)基中加入黑木耳多肽，通過共培養(yǎng)探究木耳多肽對細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳 采購于沈陽家樂福超市。

硫酸銨、乙醇（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素溶液 生工生物工程（上海）股份有限公司；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM） 美國HyClone公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；TransZol up plus RNA Kit試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SYBR Green染料 翌圣生物科技(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101s磁力攪拌器 上海力辰儀器科技有限公司；Centrifuge 5804R高速離心機 德國Eppendorf公司；ALPHA 1-4LSC冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；Orion 3 STAR pH儀、Series water jacke細胞培養(yǎng)箱、A24811聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；7500實時熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司；InfiniteF200酶標儀 瑞士Tecan公司；L8900氨基酸自動分析儀（配BioBasic SCX陽離子交換柱和紫外檢測器）日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多肽的制備

將黑木耳烘干，用磨粉機磨碎后過100 目篩，得到木耳粉。將木耳粉與蒸餾水以1∶80（m/V）混勻后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9，而后置于磁力攪拌器中30 ℃攪拌1.5 h，攪拌結(jié)束后，8 000 r/min離心10 min收集上清液，并加入硫酸銨，收集硫酸銨飽和度40%～50%的沉淀于透析袋中，透析24 h，每隔2 h換一次水，即得到木耳蛋白粗提物。在蛋白粗提物中加入風味蛋白酶，酶解條件為pH 7.5、溫度45 ℃、加酶量20 U/mg、底物質(zhì)量濃度7 g/L，酶解2 h后，沸水浴10 min滅酶活，然后邊攪拌邊緩慢加入1.5 倍體積的無水乙醇，10 000 r/min離心10 min棄去沉淀，得到木耳多肽液。最后利用超濾管將多肽液分離為分子質(zhì)量＜3 kDa、3～10 kDa、10～30 kDa和＞30 kDa部分，分別凍干用于后續(xù)實驗。

1.3.2 氨基酸組成的測定

參考文獻[14]進行樣品的前處理，將1.3.1節(jié)凍干的樣品置于酸水解管中，加入5 mL 6 mol/L鹽酸，用氮氣吹走瓶內(nèi)空氣后，用酒精噴燈封管，將水解管置于110 ℃烘箱中反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后，將其放置在室溫中冷卻，轉(zhuǎn)移水解液至旋蒸瓶中，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干后，加入2 mL pH 2.2的檸檬酸緩沖液復(fù)溶，將復(fù)溶液稀釋至適當濃度后，過0.22 μm的濾膜，裝至樣品瓶，于氨基酸自動分析儀檢測，樣品與茚三酮在135 ℃條件下衍生，分別測定440 nm和570 nm波長處的吸光度。參考文獻[15]進行氨基酸的定性和定量分析。

1.3.3 HepG2細胞培養(yǎng)

用含10%（體積分數(shù)）FBS的高糖DMEM溶液（即正常培養(yǎng)基）培養(yǎng)HepG2細胞，置于37 ℃、5%（體積分數(shù)）CO2的細胞培養(yǎng)箱生長，待其生長到對數(shù)生長期的時候進行傳代或?qū)嶒灐?/p>

1.3.4 HepG2細胞脂肪肝模型的建立

將2×105個/mL的細胞懸液接種于6 孔板（1 mL/孔），培養(yǎng)12 h后細胞貼壁，而后將細胞分為陰性對照組、空白對照組和PA組：陰性對照組和PA組培養(yǎng)液分別更換為含體積分數(shù)1%的磷酸緩沖液（10 mmol/L、pH 7.2，后同）、含PA（終濃度為100、200、300、400 μmol/L）的正常培養(yǎng)基[16]，空白對照組用正常培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，參考文獻[17]測定細胞存活率，并根據(jù)細胞存活率的結(jié)果選擇含一定濃度PA的正常培養(yǎng)基孵育24 h，然后按照檢測試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)TG含量，以選擇合適的PA處理濃度（200 μmol/L）來建立HepG2細胞的脂肪肝模型。

1.3.5 多肽處理與細胞內(nèi)物質(zhì)水平的測定

將2×105個/mL的HepG2細胞懸液接種于6 孔板（1 mL/孔），培養(yǎng)12 h后細胞貼壁，吸棄培養(yǎng)基，加入含體積分數(shù)10%多肽溶液的正常培養(yǎng)基（含不同分子質(zhì)量（＜3 kDa、3～10 kDa、10～30 kDa、＞30 kDa）及不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、2.0 mg/mL）的多肽組分），空白對照組添加正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，參考1.3.4節(jié)中方法測定細胞存活率。將1.3.4節(jié)空白對照組和200 μmol/L PA組孵育24 h后小心吸棄培養(yǎng)液，用2 mL的磷酸緩沖液小心清洗細胞兩次后，空白對照組添加正常培養(yǎng)基；200 μmol/L PA孵育后的細胞添加含體積分數(shù)10%磷酸緩沖液的正常培養(yǎng)基，即為模型組；200 μmol/L PA孵育后的細胞添加含體積分數(shù)10%的多肽溶液的正常培養(yǎng)基（即含不同分子質(zhì)量（＜3 kDa、3～10 kDa、10～30 kDa、＞30 kDa）的質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL的多肽組），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，參考1.3.4節(jié)中方法測定各組TG含量，篩選出的多肽組分進一步測定細胞內(nèi)物質(zhì)水平。用磷酸緩沖液清洗細胞兩次，將孔板置于冰上，每孔加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的細胞裂解液100 μL，用移液槍反復(fù)吹打結(jié)合細胞刮棒將板底細胞收集至EP管中，于冰上裂解2～5 min后，將其4 ℃、8 000 r/min離心5 min后收集上清液，按照檢測試劑盒的說明檢測TC、LDL、HDL、CAT、SOD、MDA水平，結(jié)果均以蛋白質(zhì)量計。

1.3.6 細胞外AST、ALT活力測定

取1.3.5節(jié)一定分子質(zhì)量和一定質(zhì)量濃度多肽組分培養(yǎng)24 h后的細胞，收集細胞培養(yǎng)液，按照AST、ALT試劑盒說明書檢測酶活力。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測相關(guān)基因表達

取1.3.5節(jié)一定分子質(zhì)量和一定質(zhì)量濃度多肽組分培養(yǎng)24 h后的細胞，使用TransZol up plus RNA Kit試劑盒提取細胞的RNA，而后使用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，并以此為模版，進行后續(xù)的qPCR實驗。反應(yīng)體系為：2μL cDNA，上下游引物各0.6 μL，雙蒸水6.4 μL，SYBR mix 10 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃、5 min，循環(huán)擴增95℃、15 s，60 ℃、1 min（40 個循環(huán)），熔煉曲線95℃、15 s，60 ℃、1 min，95℃、15 s，而后使用2-ΔΔCt的方法計算基因相對水平。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 23軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用鄧肯多重比較組間差異性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂HepG2細胞模型的建立

2.1.1 棕櫚酸對HepG2細胞存活率的影響

不同濃度的PA與HepG2細胞共培養(yǎng)24 h后細胞的存活率如圖1所示，與空白對照組和陰性對照組相比，在PA濃度低于200 μmol/L時，細胞存活率沒有顯著降低（P＞0.05），此時不影響細胞的正常生長，而當PA濃度高于300 μmol/L時，細胞存活率顯著下降（P＜0.05），說明此時PA對細胞產(chǎn)生了毒性作用。因此后續(xù)實驗選用含0（陰性對照組）、100、150、200 μmol/L PA的培養(yǎng)基建立高脂細胞模型。

圖1 PA對HepG2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of PA on cell viability of HepG2 cells

2.1.2 棕櫚酸對HepG2細胞TG含量的影響

由圖2可知，與陰性對照組相比，HepG2細胞在含PA培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，濃度為150、200 μmol/L的PA組細胞內(nèi)TG含量顯著升高（P＜0.05），200 μmol/L的PA組TG含量為陰性對照組的1.70 倍。Mayer等[7]將HepG2細胞暴露于250 μmol/L PA中24 h，細胞內(nèi)TG水平升高為正常細胞的1.50 倍。Alnahdi等[16]也將HepG2細胞置于含300 μmol/L PA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，觀察細胞內(nèi)脂滴的積累程度，發(fā)現(xiàn)其脂滴含量增加。因此，結(jié)合PA對HepG2細胞細胞存活率的影響，選擇200 μmol/L PA孵育24 h建立HepG2細胞的脂肪肝模型。

圖2 PA對HepG2細胞TG含量的影響Fig.2 Effect of PA on TG content in HepG2 cells

2.2 黑木耳降脂多肽的篩選

2.2.1 黑木耳多肽對HepG2細胞存活率的影響

通過超濾技術(shù)將黑木耳多肽按照分子質(zhì)量大小分為4 部分（＜3 kDa、3～10 kDa、10～30 kDa、＞30 kDa），不同質(zhì)量濃度黑木耳多肽與HepG2細胞共培養(yǎng)24 h后細胞的存活率如圖3所示，黑木耳多肽質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/mL時，細胞存活率與空白對照組相比沒有顯著性的變化（P＞0.05），這說明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各分子質(zhì)量黑木耳多肽并不影響細胞的正常生長，可以在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)進行后續(xù)實驗。

圖3 黑木耳多肽對HepG2細胞存活率的影響Fig.3 Effect of Auricularia auricula polypeptides on cell viability of HepG2 cells

2.2.2 黑木耳多肽對脂肪肝細胞的降脂作用

不同分子質(zhì)量黑木耳多肽的降脂效果如圖4所示，＜3 kDa和3～10 kDa的黑木耳多肽表現(xiàn)出較好的降脂活性，0.5 mg/mL時就可以顯著降低細胞內(nèi)TG的含量，而＞10 kDa的黑木耳多肽質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，也不能顯著下降細胞內(nèi)TG水平。隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，＜3 kDa和3～10 kDa的黑木耳多肽降脂效果也在提升，當質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，＜3 kDa 黑木耳多肽處理的細胞內(nèi)TG含量與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。由此可知，＜3 kDa的黑木耳多肽對高脂HepG2細胞模型的降脂效果最好，所以選?。? kDa的黑木耳多肽用于后續(xù)實驗，并將其命名為AAP-3。

圖4 不同分子質(zhì)量黑木耳多肽的降脂作用Fig.4 Lipid-lowering effects of Auricularia auricula polypeptides with different molecular masses

2.3 AAP-3的活性研究

2.3.1 AAP-3氨基酸組成分析

AAP-3中氨基酸的組成如表2所示，其中質(zhì)量分數(shù)最高的氨基酸為谷氨酸，相對含量為13.24%，質(zhì)量分數(shù)最低的為半胱氨酸，相對含量為0.66%，必需氨基酸相對含量為45.44%，非必需氨基酸相對含量為54.56%，必需氨基酸與非必需氨基酸相對含量之比為0.83，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白產(chǎn)品[18]。

表2 AAP-3的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of AAP-3

研究發(fā)現(xiàn)，食物蛋白肽的降脂活性與氨基酸疏水性有很大聯(lián)系。Takeshita等[19]發(fā)現(xiàn)大豆多肽的疏水性氨基酸有降血脂的作用，馬志鷹[20]從駱駝血液中分離出3 種降脂肽的疏水氨基酸相對含量分別為39.01%、38.83%、39.82%，徐霞[21]發(fā)現(xiàn)可降血脂的藜麥多肽，其疏水性氨基酸相對含量為37.88%，這些具有降脂活性的活性多肽疏水性氨基酸相對含量都較高。而AAP-3疏水性氨基酸的相對含量為38.8%，與大多具有降脂活性的多肽一樣，疏水性氨基酸占比較高。

2.3.2 AAP-3對HepG2細胞內(nèi)TC含量的影響

由圖5可知，相比于空白對照組，模型組細胞TC含量顯著升高（P＜0.05），這與Youn等[6]用PA處理HepG2細胞后的結(jié)果一致，PA會誘導(dǎo)胞內(nèi)的TC含量提升。膽固醇代謝和脂質(zhì)代謝是緊密相關(guān)的，F(xiàn)ungwe[22]、Ibrahim[23]等發(fā)現(xiàn)過高的膽固醇攝入會提高TG水平，并證明膽固醇可以抑制脂肪酸的氧化分解，并在這一過程中提高TG水平。

圖5 AAP-3對HepG2細胞TC含量的影響Fig.5 Effect of AAP-3 on TC content in HepG2 cells

與模型組相比，0.5 mg/mL AAP-3對TC含量沒有顯著性影響（P＞0.05），1.0 mg/mL和2.0 mg/mL的AAP-3對細胞內(nèi)TC含量都有顯著性下調(diào)作用（P＜0.05），隨AAP-3劑量的升高，胞內(nèi)TC含量降低。模型組的TC水平是空白對照組的1.43 倍，2.0 mg/mL AAP-3處理后，TC水平是空白對照組的1.12 倍，說明AAP-3具有降低膽固醇的作用。

2.3.3 AAP-3對HepG2細胞HDL和LDL含量的影響

HDL可以將血液中過剩的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟，LDL負責將膽固醇轉(zhuǎn)運到肝外組織細胞[24]。當過度肥胖時，會導(dǎo)致體內(nèi)HDL含量下降和LDL含量上升，還會造成TC的積累，提高動脈粥樣硬化的風險[25]。由圖6可知，與空白對照組相比，模型組細胞內(nèi)LDL含量顯著性上升（P＜0.05），HDL含量顯著性下降（P＜0.05），說明在PA的刺激下，細胞內(nèi)脂蛋白的表達出現(xiàn)異常。

圖6 AAP-3對HepG2細胞LDL（A）和HDL（B）含量的影響Fig.6 Effect of AAP-3 on LDL (A) and HDL (B) contents in HepG2 cells

AAP-3顯著降低了胞內(nèi)的LDL含量，當樣品質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，細胞內(nèi)LDL含量為（2.18±0.10）mmol/g，雖然未恢復(fù)至正常水平（（1.68±0.07）mmol/g），但相較于模型組仍顯著降低。與空白對照組比，模型組細胞內(nèi)的HDL含量下降了38.46%，樣品組隨著多肽劑量的升高，胞內(nèi)HDL的含量不斷升高，當樣品質(zhì)量濃度達到1.0 mg/mL時，細胞內(nèi)HDL含量與空白對照組已無顯著性差異（P＞0.05），當樣品質(zhì)量濃度達到2.0 mg/mL時，細胞內(nèi)HDL含量較空白對照組顯著升高（P＜0.05），這與薛海晶[26]發(fā)現(xiàn)用黑木耳超微粉灌胃高血脂小鼠可提高其血清中HDL-C水平的研究結(jié)果一致。這說明AAP-3可以提高細胞內(nèi)HDL的含量，降低胞內(nèi)LDL水平。

2.3.4 AAP-3對HepG2細胞的保護作用

AST與ALT水平是評價肝細胞損傷的重要指標，當肝細胞受損，細胞膜的通透性改變，內(nèi)部的AST和ALT就會泄露，導(dǎo)致胞外二者水平升高[27]。由圖7可知，模型組細胞外ALT和AST的活力相較于空白對照組顯著提高（P＜0.05），說明PA對肝細胞造成了損傷，使細胞內(nèi)容物外泄。

圖7 AAP-3對HepG2細胞外ALT（A）和AST（B）活力的影響Fig.7 Effect of AAP-3 on extracellular ALT (A) and AST (B) activity in HepG2 cells

AST和ALT活力隨添加的AAP-3質(zhì)量濃度升高而降低，具有劑量依賴性。樣品質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/mL時，細胞外ALT水平已與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。胞外AST的含量在AAP-3質(zhì)量濃度大于或等于1.0 mg/mL時，與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。說明APP-3有效降低了胞外AST和ALT的含量，對于PA造成的肝細胞損傷有一定保護作用。張淑曼等[13]研究發(fā)現(xiàn)毛木耳蛋白也有護肝功效，可降低酒精性損傷的肝細胞外的AST和ALT的水平，提高肝細胞的完整度。

2.3.5 AAP-3對HepG2細胞的抗氧化作用

脂質(zhì)積累也會給細胞帶來氧化損傷，使抗氧化酶活力降低，MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，其含量可反映過氧化的程度，而氧化損傷又會進一步影響正常代謝，從而形成惡性循環(huán)，這也符合非酒精型脂肪肝會出現(xiàn)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等特征[28-29]。由表3可知，模型組相較于空白對照組，抗氧化酶CAT和SOD活力均顯著降低，細胞內(nèi)過氧化物MDA含量也顯著提高（P＜0.05）。

表3 AAP-3對HepG2細胞內(nèi)CAT、SOD活力和MDA含量的影響Table 3 Effect of AAP-3 on catalase (CAT) and SOD activity and MDA content in HepG2 cells

樣品組中SOD活力隨AAP-3劑量升高而升高，MDA含量隨AAP-3劑量升高而減少，當AAP-3質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，細胞內(nèi)SOD活力和MDA含量與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05），但其并未顯著提升細胞內(nèi)CAT的活力。這表明AAP-3有一定抗氧化活性，對SOD活力有保護作用，對MDA的積累有清除作用，但是對CAT的活力影響較小，這表明AAP-3能增強HepG2細胞的脂質(zhì)抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化程度[30-31]。

2.3.6 AAP-3對HepG2細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用

SREBP-1c可促進FAS的表達，最終推動脂肪酸的合成，在TG和TG合成中發(fā)揮重要作用[32]，其異常高表達會導(dǎo)致肝臟TG積累和脂代謝紊亂。FAS為脂肪酸合酶的簡稱，它可催化生成長鏈脂肪酸，是脂肪合成的關(guān)鍵步驟[33]，下調(diào)FAS的表達量可降低脂肪的合成。Jiao Xinyao等[34]研究發(fā)現(xiàn)藍莓多酚提取物具有減肥的功效，實驗中肥胖小鼠肝臟內(nèi)脂滴增多，脂肪變性嚴重，且肝臟內(nèi)FAS和SREBP-1c的表達水平顯著上升，而補充藍莓多酚提取物可有效降低二者的表達，進而推測其通過抑制脂肪合成的作用來達到減肥的作用。

由圖8可知，相較于空白對照組，模型組中FAS、SREBP-1c的表達量顯著性升高（P＜0.05），這說明PA促進了細胞內(nèi)脂質(zhì)的合成。樣品組中隨AAP-3劑量的升高，F(xiàn)AS、SREBP-1c的表達量逐步降低，雖然2.0 mg/mL時仍高于模型組的表達量，卻顯著低于模型組的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05）。據(jù)此可推測AAP-3可通過抑制脂肪酸形成進而降低胞內(nèi)TG水平。

圖8 AAP-3對HepG2細胞中脂肪合成基因mRNA表達量的影響Fig.8 Effect of AAP-3 on the mRNA expression of genes associated with lipogenesis in HepG2 cells

脂肪分解需先將甘油三酯分解為甘油和脂肪酸，而后脂肪酸通過β氧化釋放能量，甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）可將甘油三酯酶解成甘油和脂肪酸，所以是分解脂肪的重要生物酶[35]。PPAR-α與PGC-1α都與線粒體氧化代謝有關(guān)[36]，二者表達量上調(diào)可以增加線粒體內(nèi)的能量代謝，加快脂肪的β氧化[37]。AMPK在調(diào)節(jié)代謝組織能量平衡中發(fā)揮著核心作用，與脂肪生成基因的下調(diào)和脂肪分解基因的上調(diào)有關(guān)，可促進脂肪分解的同時減少脂肪合成[38]，從而減少葡萄糖、脂質(zhì)和膽固醇的產(chǎn)生，是維持脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的能量調(diào)節(jié)基因[39]，被認為是治療糖尿病、肥胖或血脂異常等代謝性疾病的重要分子靶點[38]。

由圖9可知，模型組相較于空白對照組，PPAR-α、ATGL、AMPK、PGC-1α脂肪分解基因的mRNA表達量顯著降低（P＜0.05），說明PA一定程度下調(diào)了脂肪分解相關(guān)基因。而相較于模型組，樣品組中這些基因表達量都有所上調(diào)，并且總體上隨著劑量上升逐步上調(diào)。其中，樣品質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，AMPK和PPAR-α的表達量顯著高于空白對照組（P＜0.05），ATGL的表達量與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05），PGC-1α的表達量仍顯著低于空白對照組（P＜0.05），這些表明AAP-3一定程度上促進了脂肪分解基因的表達。

圖9 AAP-3對HepG2細胞中脂肪分解基因mRNA表達量的影響Fig.9 Effect of AAP-3 on the mRNA expression of genes associated with lipolysis in HepG2 cells

3 結(jié) 論

本實驗通過PA誘導(dǎo)HepG2細胞建立脂肪肝模型。利用風味蛋白酶對黑木耳蛋白進行酶解處理，超濾得到不同分子質(zhì)量的黑木耳多肽，其中分子質(zhì)量小于3 kDa的AAP-3具有較好的降脂、降膽固醇和抗氧化活性。具體表現(xiàn)在200 μmol/L PA與HepG2細胞共培養(yǎng)24 h后，細胞內(nèi)TG水平上升至陰性對照組的1.70 倍，2.0 mg/mL AAP-3與高脂HepG2細胞共培養(yǎng)24 h，TC水平降低至空白對照組的1.12 倍。與此同時，與模型組相比，AAP-3也提高了HDL水平，降低了LDL水平，一定程度上恢復(fù)了細胞正常的脂質(zhì)代謝。對于PA帶來的細胞損傷，AAP-3也降低胞外AST和ALT水平，說明其保護了細胞完整度，減少胞內(nèi)酶外泄。同時AAP-3提高了胞內(nèi)SOD活力，減少胞內(nèi)MDA的積累，一定程度上緩解了由脂質(zhì)代謝紊亂帶來的氧化應(yīng)激反應(yīng)。脂質(zhì)代謝的過程十分復(fù)雜，最終影響脂質(zhì)代謝的途徑主要分為脂質(zhì)的獲取、儲存與消耗[36]。通過檢測HepG2細胞內(nèi)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的表達水平可知，AAP-3可以下調(diào)FAS、SREBP-1c脂質(zhì)合成基因的表達量，提高PPAR-α、ATGL、PGC-1α等分解脂質(zhì)的基因表達水平，以此來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本實驗結(jié)果初步表明黑木耳多肽具有體外降脂的功效，具有一定的研究價值，也為今后多肽類物質(zhì)的細胞功能評價提供了參考。