王聰聰，鄭振佳，盧曉明，李寧陽(yáng)，喬旭光*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018）

黑蒜是一種大蒜（Allium sativumL.）深加工產(chǎn)品，由新鮮大蒜在一定溫度和濕度條件下加工而成，其顏色黑亮、酸甜軟糯，沒(méi)有生大蒜的辛辣口感，深受消費(fèi)者青睞[1-2]。黑蒜在加工過(guò)程中由于發(fā)生糖類(lèi)熱降解反應(yīng)，生成了5-羥甲基糠醛（5-hydroxzymethylfurfural，5-HMF）。5-HMF具有一定的毒性，其半致死劑量為大鼠口服3 100 mg/kgmb、小鼠口服1 910 mg/kgmb[3]、小鼠尾靜脈注射871.12 mg/kgmb[4]，毒性靶器官為腎臟[5-6]。5-HMF能誘導(dǎo)腺瘤引起小鼠扁平異常隱窩灶和大鼠結(jié)腸癌[7-8]，也能通過(guò)磺化和氯化生成具有誘變作用和細(xì)胞毒性的物質(zhì)[9]。但也有報(bào)道指出，5-HMF是很多中藥的活性成分，具有許多藥理活性[10]，如抗炎[11]、抗氧化性及抗細(xì)胞增殖活性[12]、預(yù)防和治療糖尿病[13]、Ca2+拮抗活性和改善血液流變學(xué)特性等[14]。本研究測(cè)定了黑蒜加工過(guò)程中5-HMF及相關(guān)物質(zhì)的含量變化，并分析了它們的相關(guān)性，旨在揭示5-HMF在黑蒜中的生成規(guī)律；此外，通過(guò)小鼠28 d經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)研究了5-HMF對(duì)黑蒜安全性的影響，以期為黑蒜的食用安全性提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)健康成年昆明小鼠（體質(zhì)量18～22 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007）、飼料購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

新鮮金鄉(xiāng)白皮多瓣大蒜產(chǎn)自山東省金鄉(xiāng)縣；不同品牌黑蒜為市售；5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑自配；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；TGL16離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PE-6800VET全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀 深圳普康電子有限公司；7020全自動(dòng)生化分析儀 日本日立集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 黑蒜的加工

取3 個(gè)保鮮盒，在底部加入飽和KCl溶液以控制濕度，將大小均勻、外皮完整的新鮮大蒜去掉最外層皮后置于保鮮盒內(nèi)自制的隔層上，每個(gè)保鮮盒內(nèi)放置12 頭大蒜，密封好后置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，設(shè)置溫度為80 ℃，恒溫恒濕加工16 d，每2 d從每個(gè)保鮮盒中取1.5 頭大蒜進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定，3 個(gè)保鮮盒為3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參考GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》[15]；5-HMF含量的測(cè)定采用高效液相色譜法[16]；還原糖含量的測(cè)定采用DNS法[17]；總酸含量的測(cè)定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[18]；總游離氨基酸含量的測(cè)定參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》[19]。以上結(jié)果均以黑蒜濕質(zhì)量計(jì)。

1.3.3 小鼠28 d經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)及指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)設(shè)5 組，包括對(duì)照組（生理鹽水）、黑蒜組（2 g/kgmb）以及5-HMF低、中、高劑量組（200、400、800 mg/kgmb），其中黑蒜為在1.3.1節(jié)條件下加工12 d制得，經(jīng)測(cè)定其5-HMF含量為0.91 mg/g。每組取10 只小鼠，雌雄各半，每個(gè)性別小鼠體質(zhì)量差異不超過(guò)平均體質(zhì)量的±20%。將受試物溶于水中，通過(guò)灌胃的方式給予，灌胃體積為10 mL/kgmb，每日同一時(shí)段灌胃1 次，連續(xù)給予28 d，各組灌胃體積一致。

每天觀察小鼠的一般臨床表現(xiàn)，每周記錄體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算體質(zhì)量增長(zhǎng)量；摘眼球取血，使用PE-6800VET全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀對(duì)全血進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定；分離血清，利用7020全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血生化指標(biāo)測(cè)定；進(jìn)行大體檢查；對(duì)臟器稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算臟/體比；取部分新鮮心臟、肝臟、脾臟和腎臟，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定后脫水、透明、浸蠟和包埋，切成4 μm薄片經(jīng)蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Excel和SPSS 18.0軟件分別對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和分析，利用單因素方差分析結(jié)合Duncan檢驗(yàn)在P＜0.05和P＜0.01水平評(píng)估組間數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異，利用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜加工過(guò)程中5-HMF及相關(guān)指標(biāo)含量的變化

2.1.1 黑蒜加工過(guò)程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由圖1可知，黑蒜的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。在加工過(guò)程中，大蒜受熱水分蒸發(fā)，使其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷降低，加工前期，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%以上，此時(shí)蒜樣濕軟不成型；加工后期水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降至40%左右，蒜樣柔軟且富有彈性。

圖1 黑蒜加工過(guò)程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.1 Changes of moisture contents during the aging process of black garlic

2.1.2 黑蒜加工過(guò)程中5-HMF含量的變化

由圖2可知，新鮮大蒜中不含5-HMF，黑蒜中5-HMF的含量隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，前期增長(zhǎng)緩慢，后期增長(zhǎng)迅速，在加工結(jié)束時(shí)達(dá)到最高（2.74 mg/g）。5-HMF是糖的熱解產(chǎn)物[20]，也是美拉德反應(yīng)的重要中間產(chǎn)物，能在晚期階段參與反應(yīng)生成類(lèi)黑精[16]。

圖2 黑蒜加工過(guò)程中5-HMF的含量變化Fig.2 Changes in 5-HMF content during the aging process of black garlic

2.1.3 黑蒜加工過(guò)程中還原糖含量的變化

由圖3可知，黑蒜中還原糖的含量隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，在第12天時(shí)達(dá)到最高（450 mg/g）。大蒜中含有豐富的多糖，在黑蒜的加工過(guò)程中，大蒜多糖不斷降解產(chǎn)生還原糖，還原糖又能參與美拉德反應(yīng)而消耗；因此，黑蒜中還原糖含量的變化是大蒜多糖降解和美拉德反應(yīng)共同作用的結(jié)果[21]。加工前期，大蒜多糖降解產(chǎn)生的還原糖多于美拉德反應(yīng)消耗的還原糖，同時(shí)水分含量下降，因此還原糖的含量升高；加工后期，美拉德反應(yīng)加速，消耗的還原糖多于大蒜多糖降解產(chǎn)生的還原糖，因此還原糖的含量降低。5-HMF主要通過(guò)美拉德反應(yīng)和糖類(lèi)脫水形成[22]，還原糖作為5-HMF的反應(yīng)底物對(duì)5-HMF的生成具有重要影響。加工至第12天時(shí)，黑蒜中的還原糖含量最高，此時(shí)5-HMF含量為0.91 mg/g。隨后還原糖含量開(kāi)始下降，5-HMF含量快速增加，在第16天時(shí)5-HMF含量已經(jīng)約達(dá)到第12天時(shí)的3 倍。

圖3 黑蒜加工過(guò)程中還原糖含量的變化Fig.3 Changes in reducing sugar content during the aging process of black garlic

2.1.4 黑蒜加工過(guò)程中總酸含量的變化

由圖4可知，黑蒜中總酸的含量隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在加工結(jié)束時(shí)達(dá)到最高（38.0 mg/g）。美拉德反應(yīng)是一個(gè)產(chǎn)酸的過(guò)程，其中間產(chǎn)物α-二羰基化合物能夠通過(guò)降解生成甲酸、乙酸等有機(jī)酸[23-24]。在果糖與4 種代表性氨基酸（賴(lài)氨酸、甘氨酸、組氨酸、半胱氨酸）的美拉德反應(yīng)模型中，反應(yīng)體系的酸度均隨美拉德反應(yīng)的進(jìn)行逐漸增加[25]。pH值是影響5-HMF形成的重要因素，在酸性條件下，5-羥甲基糠醛甚至可以在低溫時(shí)形成[26]。G?kmen等[27]報(bào)道在面團(tuán)中加入檸檬酸，導(dǎo)致pH值下降，所制備餅干中的5-HMF生成量增多。曾世通等[28]研究丙氨酸與葡萄糖美拉德反應(yīng)體系中5-HMF的形成規(guī)律，得出酸性條件促進(jìn)5-HMF的形成，而堿性條件抑制其形成的結(jié)論。結(jié)合圖2和圖4發(fā)現(xiàn)，隨著黑蒜加工時(shí)間的延長(zhǎng)，總酸含量越高，5-HMF增長(zhǎng)速度越快。

圖4 黑蒜加工過(guò)程中總酸含量的變化Fig.4 Changes in total acid content during the aging process of black garlic

2.1.5 黑蒜加工過(guò)程中總游離氨基酸含量的變化

由圖5可知，新鮮大蒜中總游離氨基酸含量為23.78 mg/g，黑蒜中總游離氨基酸含量隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，在第6天時(shí)達(dá)到最高（27.87 mg/g）。黑蒜加工過(guò)程中，由于水分含量的減少，樣品中的游離氨基酸含量出現(xiàn)短暫升高，同時(shí)氨基酸又能不斷參與美拉德反應(yīng)而消耗，因此后期含量降低。游離氨基酸含有氨基，5-HMF含有羰基，因此游離氨基酸也可與5-HMF發(fā)生美拉德反應(yīng)[29-31]，從而減少了5-HMF的積累。

圖5 黑蒜加工過(guò)程中總游離氨基酸含量的變化Fig.5 Changes in total free amino acid content during the aging process of black garlic

2.2 5-HMF含量與其他理化指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

對(duì)黑蒜加工過(guò)程中5-HMF含量與其他理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，如表1所示，5-HMF含量與還原糖、總酸、總游離氨基酸含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.689、0.874、-0.897。5-HMF含量與還原糖含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明還原糖含量越高越有利于5-HMF的積累，這是因?yàn)檫€原糖作為5-HMF的底物能夠促進(jìn)5-HMF的生成。5-HMF與總酸含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明酸性條件下更適于5-HMF的生成，當(dāng)加工至第8天，黑蒜中總酸含量達(dá)到20 mg/g后，5-HMF生成速率明顯加快。5-HMF與總游離氨基酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明游離氨基酸能抑制5-HMF的積累。

表1 黑蒜加工過(guò)程中5-HMF含量與其他理化指標(biāo)的相關(guān)性Table 1 Correlation between contents of 5-HMF and other compounds during the aging process of black garlic

2.3 市售黑蒜樣品中5-HMF的含量

為進(jìn)行黑蒜的安全性評(píng)價(jià)，對(duì)市售黑蒜中5-HMF含量進(jìn)行了測(cè)定。如表2所示，市售黑蒜中5-HMF的含量最高為0.64 mg/g，平均為0.34 mg/g。

表2 市售黑蒜中5-HMF含量Table 2 Content of 5-HMF in commercial black garlic

2.4 小鼠28 d經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 一般觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的小鼠毛色正常，未觀察到明顯的異常癥狀和體征，也無(wú)死亡情況的發(fā)生。

2.4.2 小鼠每周體質(zhì)量變化情況

小鼠每周體質(zhì)量的增長(zhǎng)情況如表3所示，在實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠的體質(zhì)量都在不斷增長(zhǎng)，雄性小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯快于雌性小鼠，但是各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同性別對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

表3 小鼠每周體質(zhì)量變化（n＝5）Table 3 Effects of black garlic and 5-HMF on body mass of mice every week (n = 5)

2.4.3 小鼠血液學(xué)指標(biāo)

黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響如表4所示，各項(xiàng)指標(biāo)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同性別對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），表明黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠血液學(xué)指標(biāo)無(wú)不良影響。

表4 黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（n ＝5）Table 4 Effects of black garlic and 5-HMF on hematological indexes of mice (n = 5）

2.4.4 小鼠血液生化指標(biāo)

黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響如表5所示，雄性小鼠中，5-HMF高劑量組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活力與對(duì)照組相比顯著升高，其他各項(xiàng)指標(biāo)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同性別對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），表明黑蒜和中、低劑量的5-HMF對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)無(wú)不良影響。

表5 黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響（n＝5）Table 5 Effects of black garlic and 5-HMF on blood biochemical indexes of mice (n = 5）

2.4.5 小鼠臟/體比

28 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠的臟器系數(shù)的分析結(jié)果見(jiàn)表6，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同性別對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），表明黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠臟/體比無(wú)不良影響。

表6 黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠臟/體比的影響（n ＝5）Table 6 Effects of black garlic and 5-HMF on visceral organ/body mass ratios of mice (n = 5）

2.4.6 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)所有小鼠進(jìn)行大體解剖和觀察，發(fā)現(xiàn)各個(gè)劑量組和對(duì)照組的心、肝、脾、腎等臟器的組織形狀、色澤、硬度均未見(jiàn)異常變化。如圖6所示，鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)5-HMF高、中劑量組的腎臟發(fā)生輕度細(xì)胞變性，主要為部分腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性，對(duì)照組、黑蒜組和5-HMF低劑量組正常，綜合分析可得5-HMF對(duì)小鼠的未觀察到有害作用劑量為200 mg/kgmb。各個(gè)劑量組的其他組織未見(jiàn)明顯的病理學(xué)改變。美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)項(xiàng)目研究也發(fā)現(xiàn)用5-HMF喂養(yǎng)小鼠3 個(gè)月后，劑量為188 mg/kgmb及以上組雄性小鼠腎臟細(xì)胞質(zhì)輕度改變的發(fā)生率顯著增加[6]。Bauer-Marinovic等[5]研究表明，小鼠每天通過(guò)飲水?dāng)z入536 mg/kgmb劑量的HMF 12 周后腎內(nèi)可見(jiàn)輕微病變。王月明等[32]通過(guò)急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑蒜屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。

圖6 黑蒜和5-HMF對(duì)小鼠腎臟組織病理學(xué)改變的影響（400×）Fig.6 Effects of black garlic and 5-HMF on histopathological changes of kidney tissues of mice (400 ×)

2.4.7 黑蒜的安全性評(píng)價(jià)

2.3節(jié)測(cè)得市售黑蒜中5-HMF的平均含量為0.34 mg/g，以體質(zhì)量60 kg的成年人每日食用30 g黑蒜計(jì)，人體每日通過(guò)黑蒜攝入5-HMF的量為0.17 mg/kgmb，而5-HMF的未觀察到有害作用劑量為200 mg/kgmb，約是人體通過(guò)黑蒜可能攝入量的1 176 倍，由此可認(rèn)為在正常食用黑蒜的情況下，5-HMF不會(huì)對(duì)黑蒜的食用安全性產(chǎn)生影響。

3 結(jié) 論

在黑蒜加工過(guò)程中，5-HMF的含量隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，且與還原糖和總酸含量分別呈顯著和極顯著正相關(guān)，與總游離氨基酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。還原糖會(huì)促進(jìn)5-HMF的生成，游離氨基酸會(huì)抑制5-HMF的積累，總酸含量的增加有利于5-HMF的生成。小鼠28 d經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)攝入2 g/kgmb劑量的黑蒜對(duì)小鼠的健康狀況和器官組織沒(méi)有不良影響，一定劑量的5-HMF單體能引起小鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶活力升高和腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生輕度變性，5-HMF對(duì)小鼠的未觀察到有害作用劑量為200 mg/kgmb。雖然一定劑量的5-HMF對(duì)小鼠有輕微毒性，但人體通過(guò)黑蒜攝入的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其對(duì)小鼠的未觀察到有害作用劑量，由此可認(rèn)為在正常食用黑蒜的情況下，5-HMF不會(huì)對(duì)黑蒜的食用安全性產(chǎn)生影響。