李虹，黃曉欣，劉勇，田卉玄，王澤億，王宇航

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488

酸棗仁為鼠李科棗屬多年生落葉灌木或小喬木植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。其味甘、酸，性平，歸肝、膽、心經(jīng)，可以養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗，臨床常用于治療虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是養(yǎng)心益肝安神的首選藥[2-3]。

中藥有“逢子必炒”炮制理論，酸棗仁作為典型的種子類藥材，有“生熟異治”用藥之說，其主要炮制品為炒酸棗仁，有關(guān)生、炒酸棗仁差異的研究，現(xiàn)多從化學成分、藥理作用展開。劉曉等[4]建立了生、炒酸棗仁水提液指紋圖譜，在生酸棗仁中確定了10 個共有峰，在炒酸棗仁中確定了12 個共有峰。李振雨等[5]建立了生、炒酸棗仁70%甲醇提取液指紋圖譜，在生酸棗仁中確定了17 個共有峰，在炒酸棗仁中確定了15 個共有峰。蔡瑾瑾等[6]對生、炒酸棗仁脂肪油成分分析表明，炒制對酸棗仁各成分相對質(zhì)量分數(shù)均有影響。翟旭峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁炒制后，其鎮(zhèn)靜、催眠作用增強。吳巧敏等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在改善大鼠學習和記憶能力方面，生酸棗仁優(yōu)于炒酸棗仁。目前，有關(guān)酸棗仁炒制前后滋味變化的研究未見報道。中藥藥性理論是臨證立法、組方配伍的重要依據(jù)[9]，其中，五味是中藥藥性理論的重點之一，藥性理論中所提“辛、酸、甘、苦、咸”五味既可能是中藥自身的味道，也是中藥功效的高度概括[10]，不等同于中藥本身的滋味。中藥本身的味道多基于口嘗獲得，然而人工口嘗主觀性較強且個體差異大，難以對中藥的滋味做出客觀評價。

ASTREE 型電子舌是對傳統(tǒng)分析技術(shù)的補充，能夠?qū)ψ涛逗屯ǔＨ芙庠谝后w中的有機和無機復雜的樣品進行分析，并對味道特征值進行判別[11]。電子舌技術(shù)又稱味覺傳感器技術(shù)，作為一種新興的快速檢測液體樣本信息的儀器[12]，可以模擬人的味覺系統(tǒng)，能夠克服主觀因素對味覺信息判斷的影響，具有操作簡單、檢測快速的優(yōu)點。其主要應用于食品領(lǐng)域，如食醋[13]、酒精[14-15]、茶葉[16]等。近年來，在中藥研究領(lǐng)域應用也較廣泛，如中藥產(chǎn)地鑒別[17]、真?zhèn)舞b別[18]、炮制前后差異比較[19]等。

本研究采用電子舌技術(shù)對生、炒酸棗仁各滋味進行測定，結(jié)合多元統(tǒng)計模式識別分析方法，探討酸棗仁炒制前后其本身滋味的改變，并建立生、炒酸棗仁滋味判別模型，以期為生、炒酸棗仁差異研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ASTREE 型電子舌（法國Alpha MOS 公司）；SP-7412型電動研磨干磨杯（廣州市兆利電器實業(yè)有限公司）；AL204 型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；3K15 型臺式高速冷凍離心機（Sigma 公司）；MH-500 調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；水系微孔濾膜（規(guī)格：25 mm×0.45 μm，美國PALL公司）。

1.2 試劑

0.01 mol·L-1氯化鈉、0.01 mol·L-1谷氨酸鈉、0.01 mol·L-1鹽酸（法國Alpha MOS 公司）；屈臣氏蒸餾水。

本實驗樣品采集于河北、山西、陜西、遼寧等地，樣品詳細信息見表1。樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉勇教授鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子。將樣品置烘箱內(nèi)于40 ℃烘干8 h 取出，放涼，置塑封袋中密封備用。炒酸棗仁藥材參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（四部）炮制通則項下的單炒法炮制而成。通過查閱文獻定炒制具體參數(shù)為125～135 ℃炒制7 min[4，20]。生、炒酸棗仁樣品均符合《中國藥典》2020 年版標準，留樣于北京中醫(yī)藥大學中藥學院C103實驗室。

表1 生、炒酸棗仁樣品信息

2 方法

2.1 ASTREE型電子舌介紹

ASTREE 型電子舌，配有特定傳感器陣列#6，包括AHS（酸）、CTS（咸）、NMS（鮮）、ANS（甜）、SCS（苦）、PKS（通用）、CPS（通用）7 根交叉敏感電位液體傳感器陣列，Ag/AgCl 參比電極，48 位自動進樣器及Alpha Soft 數(shù)據(jù)采集軟件。ASTREE 傳感器是離子敏感場效應晶體管（ISFET）傳感器，包括2 個關(guān)鍵部分：傳感器和化學敏感層。傳感器的滋味感知直接取決于一個定義的特定傳感器，依據(jù)調(diào)查滋味靈敏度的方法標準ISO3972定義了滋味溶液，建立這些滋味與一個傳感器之間的聯(lián)系。其檢測結(jié)果只涉及滋味，不能提供不同滋味之間的聯(lián)系，各滋味響應值范圍也是一個相對范圍，僅適用于對不同樣品內(nèi)的特定滋味進行比較。電子舌適用于測量的中藥樣品溶液一般為澄清水提溶液或低濃度有機溶液。為了確保鑒定率和重現(xiàn)性良好（通常標準偏差＜30），通常為每個樣品進行5次重復測定。

2.2 電子舌檢測過程

ASTREE 型電子舌在檢測樣品前要使用蒸餾水和0.01 mol·L-1鹽酸水溶液進行預平衡和校準，若儀器長時間不使用，首先需要使用0.01 mol·L-1氯化鈉、0.01 mol·L-1谷氨酸鈉進行診斷。為確保采集數(shù)據(jù)時穩(wěn)定、可靠，始終保持在20 ℃條件下進行。處理好的樣品盛放于電子舌專用燒杯，樣品體積為25 mL，電子舌對每一個樣品進行9 次重復測定，每次進行采集的時間通常為傳感器引入裝有樣品的燒杯后120 s，攪拌速度為1 r·s-1（默認）。為確保重現(xiàn)性良好，也確保下一個樣品分析時沒有樣品殘留，接下來是清洗循環(huán)，清洗溶液為蒸餾水，清洗重復4次，每次清洗時間為30 s。電子舌每秒采集1份數(shù)據(jù)，為得到重現(xiàn)性良好的數(shù)據(jù)，取后3次重復測定的100～120 s 內(nèi)數(shù)據(jù)的平均值作為各滋味響應值，為后期處理分析用數(shù)據(jù)。

2.3 供試品溶液制備

將酸棗仁藥材粉碎（過四號篩），精密稱取粉末0.050 0 g，加入屈臣氏蒸餾水50 mL，稱質(zhì)量，浸泡30 min，加熱煎煮30 min，放冷至室溫，用適量蒸餾水補足減失質(zhì)量，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，8000 r·min-1離心（離心半徑為3 cm）10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 水系微孔濾膜濾過，得澄清溶液，置于電子舌專用燒杯中待測。每個樣品平行操作3次，共計78份樣品。

2.4 方法學考察

2.4.1樣品生藥量質(zhì)量濃度考察 電子舌適用于檢測濃度較稀的澄清水提液，分別對0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg·mL-1的生藥量質(zhì)量濃度進行考察，實時觀測在線譜圖，在質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1時，各滋味響應值范圍無異常，因此，選取1 mg·mL-1作為本實驗供試品生藥量質(zhì)量濃度。

2.4.2穩(wěn)定性試驗 取編號為S1的樣品，按2.3項下方法制備供品試液，分別于0、1、2、3、4、5 h對樣品進行檢測。各味道RSD 均小于5%，表明供試液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復性試驗 取編號為S1 的樣品5 份，按2.3 項下方法制備供試液，各味道中除CTS 的RSD為1.27%，其余RSD均小于1%，說明重復性良好。

2.4.4精密度試驗 取2.4.3項下5 份S1 樣品中的第五份供試品，連續(xù)進樣6 次，各味道RSD 均小于1%，說明儀器精密度良好。

3 結(jié)果

3.1 配對t檢驗

生、炒酸棗仁經(jīng)電子舌檢測，各味道響應值結(jié)果見表2。利用SPSS 26軟件，對共計39對生品和相應制品各味道響應值數(shù)據(jù)一一配對，進行配對樣本t檢驗，檢驗結(jié)果見表3，其中AHS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS 的雙側(cè)P值均小于0.05，可以認為酸棗仁炒制前后以上6 種味道響應值兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學意義，說明酸棗仁炒制對以上6 種味道影響較大，且炒制對酸棗仁各味道的影響程度不同，對SCS 影響最大，炒制后苦味增加。而PKS 的P＞0.05，可以認為炒制對該味道無影響或影響極小。

表2 生、炒酸棗仁各味道響應值（， n=2）

表2 生、炒酸棗仁各味道響應值（， n=2）

表3 生、炒酸棗仁各味道響應值配對t檢驗結(jié)果

3.2 生、炒酸棗仁鑒別

3.2.1生、炒酸棗仁特征滋味指紋圖譜 根據(jù)生、炒酸棗仁各味道響應值原始數(shù)據(jù)做雷達圖，固定代表各味道的7條坐標軸初始值均為0，根據(jù)各味道響應值自動變化結(jié)束值，得生、炒酸棗仁特征滋味指紋圖譜，見圖1。從圖1中可以直觀看出，酸棗仁炒制后AHS、NMS、CPS、SCS味值與生品差異明顯，且均為上升趨勢，而PKS、CTS、ANS 味值變化不明顯。

圖1 生、炒酸棗仁特征滋味指紋圖譜

3.2.2主成分分析（PCA）PCA 廣泛應用于數(shù)據(jù)降維，從多變量中提取幾個能較大反映樣本信息變量的“變量”。采用SIMCA 14 軟件將生、炒酸棗仁兩組樣品進行PCA，結(jié)果見圖2。2 組樣品位于2 個不同區(qū)域，具有明顯組間差異，第一主成分和第二主成分累積方差貢獻率為71.2%（＞70%），可以認為生、炒酸棗仁能夠通過電子舌區(qū)分開。

圖2 生、炒酸棗仁PCA得分

3.2.3正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）采用SIMCA 14軟件將生、炒酸棗仁兩組樣品各味道響應值進行OPLS-DA 建模，結(jié)果見圖3。由圖3 可以看出，生、炒酸棗仁被判在2 個不同區(qū)域，區(qū)分效果明顯。該模型對X矩陣的解釋率（R2X）=0.9，對Y矩陣的解釋率（R2Y）=0.967，該模型的預測能力（Q2）=0.965，說明該模型擬合度、預測性良好。在生、炒酸棗仁OPLS-DA 模型中，以變量投影重要度（VIP）＞1 為篩選標準，結(jié)合配對t檢驗篩選差異標志物，共篩選出3 個差異標記滋味，分別為SCS、CPS、NMS。表明在本實驗當前條件下，電子舌檢測和OPLS-DA 技術(shù)能夠?qū)λ釛椚噬芳捌渲破愤M行判別區(qū)分。

圖3 生、炒酸棗仁正OPLS-DA得分

4 結(jié)論與討論

本研究旨在從滋味角度探討生、炒酸棗仁差異，采用電子舌技術(shù)對生、炒酸棗仁樣品本身滋味進行定量表征，配對t檢驗結(jié)果顯示，酸棗仁炒制前后均有酸、咸、鮮、甜、苦味，炒后苦、鮮、酸、甜味值上升，咸味值下降。其中，炒制對苦味影響最大，分析苦味上升的原因，可能與加熱炒制后酸棗仁表面略帶的焦斑有關(guān)。而酸、甜、鮮味值上升及咸味值下降的原因可能與各味道相關(guān)的內(nèi)在成分因炒制發(fā)生變化有關(guān)，酸棗仁各味道與內(nèi)在化學成分的相關(guān)性有待進一步研究。通過PCA、OPLS-DA 可以實現(xiàn)生、炒酸棗仁的快速識別，而且2 種識別模型起到了相互驗證的作用。配對t檢驗結(jié)合OPLS-DA 篩選出生、炒酸棗仁差異標記滋味為SCS、CPS、NMS。綜上所述，電子舌技術(shù)可以從數(shù)值上客觀化體現(xiàn)炒制對酸棗仁各味道的影響，可以對生、炒酸棗仁進行鑒別，從滋味角度嘗試解釋“逢子必炒”及“生熟異治”的原因，為生、炒酸棗仁差異研究提供數(shù)據(jù)參考，為今后電子舌在中藥炮制前后評價研究應用方面提供參考。

在中藥研究中，藥材味道是中藥性狀鑒別、品質(zhì)評價的重要依據(jù)。例如，以味酸為佳的山楂、烏梅，以味甜為佳的甘草，以味苦為佳的黃連等?；凇拔丁钡男誀铊b別、評價是我國經(jīng)過數(shù)千年傳統(tǒng)經(jīng)驗總結(jié)形成的具有特色的“辨狀論質(zhì)”理論，凝聚著中藥品質(zhì)評定的精華，是不可或缺的中藥鑒別方法，但其是一種感官評價，存在個體差異大、客觀性差、無法量化的問題。采用電子舌技術(shù)建立基于味道的指紋圖譜，可為中藥“味”的鑒別提供客觀、準確的量化數(shù)據(jù)，有助于提高中藥性狀鑒別的標準。

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，電子舌技術(shù)在中藥研究中應用廣泛，已有文獻報道，電子舌技術(shù)在反映中藥材總體特征上具有優(yōu)勢，可基于味覺信息進一步推測中藥材中特征性成分含量[21]，其既可以判斷藥材的基原、產(chǎn)地、炮制程度、儲藏時間，也可以用于評價中藥的滋味及掩味效果，還可以鑒別中藥粉末[22]。在進行中藥材滋味評價的同時可結(jié)合“氣”進行氣味融合評價，使鑒別、評價效果更佳。同時，中藥的“氣”“味”也是中藥材內(nèi)在化學成分的外在表現(xiàn)，而化學成分的類別、含量又與藥效相關(guān)，藥效又決定著藥材質(zhì)量。因此，采用電子舌、電子鼻等智能感官技術(shù)結(jié)合光譜、色譜技術(shù)綜合評價生、炒酸棗仁，闡明生、炒酸棗仁中氣味與化學成分的相關(guān)性，明確氣味-藥效相關(guān)成分是需要繼續(xù)探究的內(nèi)容。同時，也需要不斷完善方法學，在完善的方法學基礎上，可以將該綜合評價方法應用到中藥質(zhì)量評價中，即基于智能感官評價-色譜/光譜聯(lián)用技術(shù)或可成為一種科學、客觀、合理的中藥質(zhì)量評價新模式。