賀晉芳，張迪，鄭佳昆，張沂，金譯涵，晏軍

北京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100700

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是以異常的損傷修復(fù)伴成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，復(fù)雜的肺泡網(wǎng)絡(luò)逐漸被纖維化瘢痕所取代為特征的進(jìn)行性致命性疾病[1]?；颊叱１憩F(xiàn)為呼吸功能受損，病情進(jìn)行性發(fā)展，終至呼吸功能衰竭而危及生命[2-3]。迄今為止PF 的治療仍是一大難題，主流方法為抗炎、抗纖維化等，雖能延緩肺功能衰退速度，但效果并不理想，不能減少并發(fā)癥且具有明顯的不良反應(yīng)。近年來中藥治療PF 的效果在基礎(chǔ)和臨床研究中均得到肯定。中醫(yī)認(rèn)為PF 屬于“肺痹”“肺痿”范疇，醫(yī)家普遍認(rèn)為肺絡(luò)是患病之所[4]，氣虛是基本病機(jī)，而血瘀是核心病理環(huán)節(jié)[5-6]，正如“肺氣衰便成氣嗽”[7]、“人身氣道，不可有壅滯。內(nèi)有瘀血?jiǎng)t阻礙氣道，不得升降，是以壅而為咳”[8]之言。氣虛與血瘀相互影響，血不得氣則行之無力而瘀滯，氣不得血?jiǎng)t無所依附而虛耗，此兩者是PF 病情進(jìn)展的關(guān)鍵，虛瘀膠結(jié)難解，纏綿難愈，久可釀生痰濁、熱毒，諸邪痹阻肺絡(luò)，敗壞肺臟，終致肺絡(luò)脈蔓行不整，肺體失用。因此，采用益氣化瘀法對(duì)本病進(jìn)行干預(yù)，是阻斷疾病惡化的有效措施。

黃芪，味甘，性微溫，“內(nèi)補(bǔ)，虛喘”，被譽(yù)為補(bǔ)氣之圣藥，又可“逐五臟間惡血”，補(bǔ)而不滯[9]。張秉成[10]謂之“（黃芪）之補(bǔ)……以營衛(wèi)氣血太和，自無瘀滯耳”；水蛭，其味咸、苦，性平，具有破血消瘀、通絡(luò)消癥之效，是化瘀而無耗氣之良藥，張錫純有謂：“凡破血藥多傷正氣，惟水蛭味咸，專入血分，于氣分絲毫無損，而瘀血默消于無形”[11]。兩藥合用，補(bǔ)虛而無留邪之痹，袪瘀而無耗氣之虞，在PF 的治療中發(fā)揮著重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可降低PF 患者血清纖維化相關(guān)因子水平，發(fā)揮一定治療作用[12]。水蛭通絡(luò)膠囊可提高PF 患者的肺功能，改善其運(yùn)動(dòng)耐力和生活質(zhì)量[13-14]。而以水蛭和黃芪為主藥的中藥復(fù)方可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、層黏連蛋白（LN）水平，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，抑制PF 的惡化[15]?，F(xiàn)代藥理研究進(jìn)一步表明，黃芪具有抗炎、抗氧化、擴(kuò)張血管等作用[16]，有效成分如黃芪多糖、黃芪甲苷、黃芪總黃酮等可調(diào)控TGF-β1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）/VEGF受體2（VEGFR2）等多種信號(hào)通路，參與自噬和焦亡過程，從而抑制肺纖維化[17-21]。水蛭具有抗炎、抗纖維化、抗血栓等作用[22]，水蛭及其有效成分水蛭素可降低肺組織纖溶酶原抑制劑-1（PAI-1）、TGF-β1的表達(dá)和纖維蛋白的沉積，抑制PF 病情進(jìn)展，該作用可能與調(diào)控炎癥及凝血功能相關(guān)[23-25]?？梢?，以黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 具有重要意義，但目前尚缺乏黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF的相關(guān)機(jī)制研究，一定程度上限制了這2 味藥在PF治療中的應(yīng)用與推廣。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合了系統(tǒng)生物學(xué)、傳統(tǒng)藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等多學(xué)科而形成的新學(xué)科，其整體性、系統(tǒng)性的藥理研究特點(diǎn)符合中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的整體作用理念[26]，這為闡明黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的具體機(jī)制提供了新的思路與方法。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建黃芪-水蛭藥對(duì)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，基于SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，通過與GeneCards、TTD 等數(shù)據(jù)庫中與抗PF 相關(guān)的靶點(diǎn)對(duì)比，篩選黃芪、水蛭抗PF的有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）挖掘、基因本體（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析等生物信息學(xué)分析及網(wǎng)絡(luò)分析，全面、深入、系統(tǒng)地分析黃芪-水蛭藥對(duì)抗纖維化的有效成分及作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 主要化學(xué)成分的收集與篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）[27-28]，根據(jù)化合物藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)[29]收集黃芪的主要化學(xué)成分，將其結(jié)構(gòu)保存為.sdf 格式文件；通過文獻(xiàn)檢索收集水蛭的化學(xué)成分，借助PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.Ncbi.Nlm.Nih.gov/）獲取相關(guān)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，針對(duì)PubChem 平臺(tái)未收錄的成分，采用ChemDraw 軟件繪制，所有化學(xué)結(jié)構(gòu)文件均保存為.sdf格式，將水蛭化學(xué)成分的.sdf格式結(jié)構(gòu)文件上傳至SwissADME 數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch/）進(jìn)行成分篩選，條件如下：GI absorption 為High，Druglikeness（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）5 種規(guī)則中符合2 項(xiàng)，表明此化學(xué)成分具有較高的口服利用度和類藥性。

1.2 藥物作用靶點(diǎn)的篩選

通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.Swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)候選化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)，將黃芪、水蛭化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的.sdf 格式文件上傳至該平臺(tái)進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，物種選擇“Homo Sapiens”。

1.3 黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF的靶點(diǎn)搜集

通過檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org./）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）和DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）獲取PF 相關(guān)靶基因，檢索詞為“Pulmonary fibrosis”。將4 個(gè)數(shù)據(jù)庫的基因整合，去除重復(fù)項(xiàng)得到PF 相關(guān)靶基因。利用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），將PF 靶基因與藥物作用靶基因映射篩選，最終獲得的交集基因即為黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF的潛在靶基因，繪制韋恩圖。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

1.4.1成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用可視化Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，化合物和靶點(diǎn)由節(jié)點(diǎn)（node）表示，化合物-靶點(diǎn)的相互作用由邊（edge）表示。采用“Network analyzer”功能分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?，依?jù)度（degree）值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小，度值越大節(jié)點(diǎn)越大。同時(shí)利用度值、介度（betweenness centrality）及緊密度（closeness centrality）3 個(gè)重要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?，分析黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的主要活性成分。

1.4.2PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫[30]（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)為“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度“Medium confidence”0.4，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，去除單個(gè)游離靶蛋白，將剩余結(jié)果保存成.TSV格式。將.TSV 格式的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯罁?jù)其節(jié)點(diǎn)度值大小調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并以度值≥2 倍中位數(shù)為條件篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶蛋白。

1.5 基因功能和通路富集分析

將黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），選 擇Functional Annotation 功 能，設(shè) 置Select Identifier 為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，List Type 和Background 為“Gene List”，進(jìn)行GO 分析和KEGG通路分析，以P＜0.01為條件，富集基因數(shù)由大到小進(jìn)行排序，篩選出排名前20 的生物過程和通路。使用微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com/）繪制GO 信息柱狀圖，OmicShare 網(wǎng)站（http://www.omicshare.com/）繪制通路信息的氣泡圖。

1.6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過查閱文獻(xiàn)，從KEGG 富集分析基因富集數(shù)前20 的通路中，篩選出與治療PF 相關(guān)的靶向通路，找出富集在這些通路上的潛在靶點(diǎn)，并找出與靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的藥物活性成分。以活性成分、靶標(biāo)、通路為節(jié)點(diǎn)，導(dǎo)入輸入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF相關(guān)的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-水蛭藥對(duì)主要活性成分的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到黃芪化學(xué)成分87 個(gè)，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[31-34]，補(bǔ)充OB、DL值雖低，但研究證實(shí)含量較高、有藥理活性的成分黃芪皂苷，最終得到候選活性成分24 個(gè)；根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道共收集了水蛭化學(xué)成分61個(gè)[35-41]，經(jīng)SwissADME數(shù)據(jù)庫篩選得到36個(gè)具有良好ADME性質(zhì)的潛在活性化學(xué)成分。黃芪-水蛭藥對(duì)主要活性成分的基本信息見表1。

表1 黃芪-水蛭藥對(duì)活性成分基本信息

2.2 黃芪-水蛭藥對(duì)潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將SwissTargetPrediction 平臺(tái)獲得的1310 個(gè)黃芪作用基因靶點(diǎn)、977 個(gè)水蛭作用基因靶點(diǎn)刪除重復(fù)項(xiàng)，得到黃芪457 個(gè)潛在靶點(diǎn)、水蛭439 個(gè)潛在靶點(diǎn)。通過檢索GeneCard、OMIM、DrugBank 和TTD 數(shù)據(jù)庫，整合并剔除重復(fù)項(xiàng)得到PF 相關(guān)基因靶點(diǎn)共846 個(gè)，與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終得到化合物與疾病交集靶點(diǎn)95 個(gè)（圖1），預(yù)測(cè)為黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的靶基因，其中74 個(gè)歸屬于黃芪，67 個(gè)歸屬于水蛭，兩者共有靶基因46 個(gè)，提示黃芪、水蛭配伍治療PF，既能獨(dú)自發(fā)揮作用，又可協(xié)同作用。

圖1 黃芪、水蛭、PF疾病靶標(biāo)映射

2.3 網(wǎng)絡(luò)圖分析

2.3.1成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 如圖2 所示，以95 個(gè)靶點(diǎn)作為黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的靶點(diǎn)，建立成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含了139 個(gè)節(jié)點(diǎn)、379 條邊，共有黃芪活性成分23個(gè)、水蛭21個(gè)，同一活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，不同成分也可作用于同一靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)圖充分體現(xiàn)了黃芪-水蛭配伍以多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)調(diào)整合的方式發(fā)揮治療PF的作用。經(jīng)計(jì)算，該網(wǎng)絡(luò)平均度值為8.61，平均介度為0.03，平均緊密度為0.32。熊竹素、槲皮素、山柰酚、水蛭素啶A、熊果酸等16 個(gè)成分度值、介度、緊密度均≥其平均值，提示這些成分可能是黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的主要活性成分。主要活性成分的拓?fù)鋮?shù)見表2。

表2 黃芪-水蛭治療PF主要活性成分拓?fù)鋮?shù)

圖2 黃芪-水蛭治療PF成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3.2靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò) 將95 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫獲取相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，去掉1個(gè)游離靶點(diǎn)，將剩余結(jié)果保存為TSV 文本后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件。如圖3A 所示，PPI 網(wǎng)絡(luò)共有94 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1240 條相互作用連線。經(jīng)計(jì)算，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值中位數(shù)為23，以度值≥2 倍中位數(shù)值（度值≥46）的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，共篩選得到黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF的關(guān)鍵靶點(diǎn)18個(gè)（圖3B）。

圖3 黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)

如表3 所示，在Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/）中獲得18 個(gè)靶基因?qū)?yīng)的蛋白功能。表明轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路和酶等相關(guān)蛋白物質(zhì)參與了黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF的途徑。

表3 黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白功能

2.4 GO注釋分析和KEGG富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)黃芪-水蛭治療PF 的95 個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 注釋分析和KEGG 通路分析，并通過微生信和OmicShare網(wǎng)站將結(jié)果可視化。

GO 注釋分析由分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（celluar component，CC）3 部分組成。由圖4 可知，BP 分析中排名靠前的有激酶活性的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對(duì)脂多糖的調(diào)節(jié)等；CC分析主要是膜筏、基底外側(cè)質(zhì)膜、溶酶體、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)等，主要體現(xiàn)在細(xì)胞膜和蛋白復(fù)合物上；MF 分析靠前的是細(xì)胞因子活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激酶活性、肝素結(jié)合等，主要集中在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、蛋白激酶活性。

圖4 黃芪-水蛭活性成分治療PF潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

KEGG 通路分析（圖5）顯示，黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 富集基因數(shù)靠前的通路主要有癌癥通路、磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路、RAS 信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、微小RNA（microRNA）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路等。

圖5 黃芪-水蛭活性成分治療PF潛在靶點(diǎn)的KEGG富集分析

2.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

綜合GO 和KEGG 通路富集分析結(jié)果，篩選出黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的潛在通路，并與活性成分和靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)。將相關(guān)數(shù)據(jù)錄入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖6）。網(wǎng)絡(luò)圖包含86 個(gè)節(jié)點(diǎn)、321 條邊線，黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 與槲皮素、熊竹素、山柰酚、黃芪紫檀烷苷、hirudinoidine A、熊果酸等35個(gè)活性成分有關(guān)，與VEGFA、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、MAPK1 等43 個(gè)靶標(biāo)有關(guān)，與PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、microRNA 通路、VEGF 信號(hào)通路、RAS信號(hào)通路HIF-1信號(hào)通路等8條通路有關(guān)。

圖6 黃芪-水蛭治療PF成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

3.1 黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)探討

PF 作為一大類肺系疾病終末期表現(xiàn)，在國內(nèi)外的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，惡性程度甚至高于某些惡性腫瘤[42]，已成為全世界廣泛關(guān)注的健康問題。其致病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，是一個(gè)世界性的醫(yī)學(xué)難題。近年來，以黃芪和水蛭為主要藥物的中藥復(fù)方在治療PF 方面療效顯著[43-44]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析了黃芪-水蛭藥對(duì)抗PF 的作用機(jī)制，篩選主要作用成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)，分析生物過程及信號(hào)通路，構(gòu)建了成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，闡釋了其抗PF的成分基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示槲皮素、山柰酚、二氫異黃酮、黃芪紫檀烷苷、異鼠李素、熊果酸、水蛭素啶A等18 種成分可干預(yù)多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，可能是黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF 的重要成分，可進(jìn)行深入研究。彭海兵等[45]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制p38 MAPK 通路，抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、TGF-β1的表達(dá)，對(duì)硅誘導(dǎo)的PF 起抑制作用。槲皮素能發(fā)揮抗炎作用，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)，減輕肺膠原蛋白的沉積[46]。Liu 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚可通過抑制細(xì)胞自噬，抑制炎癥因子的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，對(duì)PF 大鼠起治療作用。Zheng 等[48]發(fā)現(xiàn)，對(duì)經(jīng)博來霉素處理的小鼠和TGF-β處理的肺泡上皮細(xì)胞給予異鼠李素處理，可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）的激活，逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）進(jìn)程、減少膠原蛋白沉積。研究顯示，水蛭素可降低纖溶酶原激活物抑制劑-1（PIA-1）的基因和蛋白表達(dá)水平，從而增加膠原降解、抑制纖維蛋白沉積，發(fā)揮治療PF 的作用[49]。熊果酸能抑制Toll 樣受體4（TLR4）/NF-κB信號(hào)通路的激活，減少肺組織IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)，延緩大鼠PF病情進(jìn)展[50]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF可能涉及VEGFA、MAPK1、Akt1、IL-6、TNF、IL-1β、MMP-9、MMP-2等18個(gè)核心靶蛋白。EGFR磷酸化可促進(jìn)EMT、ERS 和氧化應(yīng)激[51-52]，在PF 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。VEGF 能刺激血管的生成，對(duì)肺血管床發(fā)育至關(guān)重要，IL-5、IL-1、TNF是促炎因子，而炎癥反應(yīng)和血管重構(gòu)是PF 發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[53]。MAPK1是MAPK 家族的重要組成部分，在肺成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡過程中具有重要作用，且參與肺血管新生[54]。MMPs 既參與纖維化過程的早期炎癥損傷，又在晚期異常修復(fù)發(fā)揮重要作用，從而誘導(dǎo)PF的發(fā)生。

3.2 黃芪-水蛭藥對(duì)治療PF的信號(hào)通路探討

GO 注釋分析和KEGG 通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪、水蛭藥對(duì)中有效成分可通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、microRNA 通路、VEGF 信號(hào)通路、RAS 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等，參與炎性免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和血管新生等生物過程，進(jìn)而對(duì)PF發(fā)揮治療作用。PI3K-Akt信號(hào)通路可調(diào)控下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、HIF-1α及活性氧（ROS）系統(tǒng)[55-56]，其中mTOR 介導(dǎo)的自噬活性降低與成纖維細(xì)胞高增殖、抗凋亡特性相關(guān)[57]，HIF-1α可促進(jìn)纖維母細(xì)胞增殖及EMT 過程[58-59]，從而參與PF 過程。在PI3K-Akt信號(hào)通路的過程中還可以使MEK1/2 上的絲氨酸磷酸化，激活MAPK通路，兩者協(xié)同參與PF的發(fā)生、發(fā)展[49]。研究表明，含有黃芪、水蛭藥對(duì)的復(fù)方可調(diào)控PI3K，減輕PF 程度[60-61]，本研究也得出了相似結(jié)果，為這一理論提供了依據(jù)。MAPK 是生物體內(nèi)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵途徑之一，該通路可促進(jìn)炎癥介質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞凋亡和血管新生，是PF 發(fā)生、發(fā)展的病理機(jī)制[62]。參與細(xì)胞生理、病理進(jìn)程的microRNA可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、EMT、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等途徑，調(diào)控肺纖維的發(fā)生[63]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155通過增強(qiáng)TNF-α的產(chǎn)生而在炎癥發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[64]，反過來炎性小體亦可促進(jìn)miR-155的表達(dá)，且miR-155是促使纖維化發(fā)生的關(guān)鍵miRNA[65]。本研究結(jié)果顯示，黃芪-水蛭藥對(duì)能夠通過microRNA 通路調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，抑制肺泡上皮細(xì)胞的損傷，從而發(fā)揮抗PF 作用。RAS 系統(tǒng)是體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，主要包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）-血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）-Ang-（1-7）雙軸，前者可與TGF-β1協(xié)同作用參與PF 的發(fā)生，可上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，并通過AngⅡ受體促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌ECM[66]；后者發(fā)揮相反的作用，還能抑制MAPK 途徑，延緩PF 的形成與發(fā)展[67]。HIF-1 是一種氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，活性亞基HIF-1α是應(yīng)答缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵因子，參與調(diào)控VEGF、TGF-β1、MMP-9、MMP-2等靶基因的表達(dá)，促進(jìn)PF 模型動(dòng)物新生血管生成、炎癥免疫反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖等病理過程[68]，提示黃芪-水蛭藥對(duì)可作用于HIF-1信號(hào)通路，發(fā)揮抗PF作用。

VEGF 既參與維持肺組織的結(jié)構(gòu)和功能，又可加速PF的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在PF患者的血清和肺泡灌洗液中強(qiáng)表達(dá)，組織病理的特點(diǎn)是肺新生血管形成及血管重構(gòu)[69]，而VEGF 的特異性阻滯劑CBO-P11 可減弱博來霉素誘導(dǎo)的大鼠PF[70]。另一方面，過表達(dá)的VEGF 可以保護(hù)肺泡結(jié)構(gòu)、促進(jìn)修復(fù)，是PF 過程中的“保衛(wèi)者”[71]。這表明VEGF 過多或過少表達(dá)都可能參與PF 發(fā)生。已有文獻(xiàn)報(bào)道了黃芪甲苷可通過抑制VEGF 表達(dá)對(duì)PF 大鼠發(fā)揮保護(hù)作用[72]。不同濃度的水蛭可對(duì)血管新生發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，保護(hù)機(jī)體免受病理損傷[73]。推測(cè)水蛭可以調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)肺臟功能的作用，該類研究未有報(bào)道，尚不清楚其抗PF 的作用與促進(jìn)或抑制VEGF 的表達(dá)相關(guān)，今后的研究可圍繞這一內(nèi)容進(jìn)行深入分析。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)黃芪-水蛭藥對(duì)通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮協(xié)同抗PF的作用，為后期的驗(yàn)證性研究提供了理論依據(jù)。兩者主要通過調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、microRNAs、RAS、HIF-1、VEGF 等信號(hào)通路發(fā)揮減輕PF 的作用，但具體的分子作用機(jī)制仍需要實(shí)驗(yàn)深入研究，為PF的治療提供更多支持。