黃家樂，莫惠鳳，羅沛豪，馬惠儀

香港特別行政區(qū)政府衛(wèi)生署 中醫(yī)藥規(guī)管辦公室 政府中藥檢測(cè)中心，香港特別行政區(qū)

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版，鹿茸是鹿科梅花鹿和馬鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，其混淆品部分來(lái)自馴鹿、水鹿、麋鹿等[2-3]。性狀鑒別和顯微鑒別可快速鑒別鹿茸原藥材[4-5]，但對(duì)部分缺失性狀特征的鹿茸制品存在局限性。DNA 鑒別技術(shù)分辨能力強(qiáng)，尤其適用于動(dòng)物類藥材或近緣物種的鑒別。目前的DNA 技術(shù)中，特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）所涉及的分析儀器少，操作容易且有明確的判定準(zhǔn)則，利于檢測(cè)業(yè)界采用和中藥業(yè)界納入其質(zhì)量控制流程，以確保藥材貨源的正確性和生產(chǎn)中投料的規(guī)范性。本研究旨在開發(fā)及驗(yàn)證一種基于特異性PCR 技術(shù)區(qū)分鹿茸正品梅花鹿和馬鹿的篩選方法，能有效補(bǔ)充現(xiàn)行鹿茸鑒別法，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程的建立及質(zhì)量控制系統(tǒng)的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Heraeus Megafuge 8R 型離心儀、NanoDrop One型微量核酸濃度測(cè)定儀、ProFlex 型PCR 儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；MM400 型球磨儀（德國(guó)Retsch 公司）；Thermomixer C 型恒溫混合器（德國(guó)Eppendorf 公司）；QIAsymphony SP 型全自動(dòng)樣品純化儀、QIAxcel 型全自動(dòng)核酸蛋白分析儀（德國(guó)Qiagen 公司）；Matrix A 型組織研磨管（美國(guó)MPBio公司）。

1.2 試藥

蛋白酶K、QIAsymphony DNA Investigator Kit、QIAxcel DNA High Resolution Kits、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、QX DNA Size Marker（德國(guó)Qiagen公司）；Platinum?TaqDNA 聚合酶（美國(guó)Thermo Sicentific 公司）；自定義引物（比利時(shí)Eurogentec 公司和美國(guó)Thermo Sicentific 公司）；二硫蘇糖醇（DTT，美國(guó)Sigma 公司）；GelRed 核酸染劑（美國(guó)Biotium公司）。

馬鹿茸、梅花鹿茸及鹿茸混淆品共43 份樣品，收集自北京、吉林、遼寧、新疆、江蘇、海南、山西和香港等地，樣品由首都醫(yī)科大學(xué)趙奎君研究員及香港科技大學(xué)畢丹和徐紅研究員鑒定。香港市面流通的鹿類幼角切片、鹿筋、鹿鞭、鹿肉及食用家畜樣品共25 份。其他動(dòng)物、植物和真菌類樣品共5 份，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。4份魚肉樣品來(lái)自英國(guó)FAPAS?實(shí)驗(yàn)室能力測(cè)試計(jì)劃。所有樣品都經(jīng)DNA 測(cè)序，利用BLAST 程序與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）所收載的cytochrome c oxidase subunit 1（CO Ⅰ）、cytochrome b 和16S ribosomal RNA 序列進(jìn)行比對(duì)，確定其來(lái)源。樣品保存于香港特別行政區(qū)政府衛(wèi)生署政府中藥檢測(cè)中心，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

從NCBI 的Nucleotide Database 下載梅花鹿Cervus nipponTemminck、馬鹿C.elaphusLinnaeus、水鹿Sambar unicolorKerr、麋鹿Elaphus davidianusMilne-Edwards 和馴鹿Rangifer tarandusLinnaeus 共87 份線粒體基因組DNA 序列（表2），使用MUSCLE[6]進(jìn)行多重序列比對(duì)，分別以梅花鹿或馬鹿作為比較對(duì)象，在BioEdit[7]上尋找特異性單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物后導(dǎo)入Primer 3[8]分析其物理特性，修正二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最后合成引物。

表2 鹿類樣品線粒體基因組DNA序列

經(jīng)多重序列比對(duì)后，找出梅花鹿和馬鹿的特異性位點(diǎn)。梅花鹿線粒體基因組序列DQ985076.1 和馬鹿線粒體基因組序列KT290948.1分別定為梅花鹿和馬鹿特異性引物設(shè)計(jì)參照，共設(shè)計(jì)了8 個(gè)梅花鹿（S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29）和1個(gè)馬鹿（S33）的特異性引物組合，其序列和物理特性見表3。

2.2 樣品研磨

按樣品采取下述2 種方法研磨：1）稱取樣品約1 g，剪切成約3 mm×6 mm×6 mm方塊后置于不銹鋼球磨罐，加入直徑15 mm 不銹鋼研磨球，用球磨儀在28 Hz 頻率下研磨5 min，稱取約50 mg 粉磨樣品于2 mL 平底離心管。2）若樣品體積小，稱取樣品約50 mg，經(jīng)剪切后移入Matrix A研磨管中，放入球磨儀，在28 Hz頻率下研磨30 min。

2.3 DNA提取

利用QIAsymphony DNA Investigator Kit，在樣品、陽(yáng)性對(duì)照和提取陰性對(duì)照的管中加入ATL緩沖液960 μL、20 mg·mL-1蛋白酶K 40 μL 和1 mol·L-1DTT 40 μL。漩渦混勻后，放入恒溫混合器，56 ℃、2000 r·min-1振蕩3 h 或過夜。16 000×g離心15 min，取上清液600 μL加入2 mL平底離心管中，上樣到全自動(dòng)樣品純化儀，按照儀器說(shuō)明書操作。利用NanoDrop One 型微量核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定樣品總基因組DNA 質(zhì)量濃度，以水調(diào)整其終質(zhì)量濃度至約10 ng·μL-1。

2.4 引物篩選

按以下條件對(duì)表3 中的引物進(jìn)行篩選。反應(yīng)在200 μL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)體系包括10×PlatinumTaqPCR緩沖液（不含Mg2+）2.5 μL、50.0 mmol·L-1Mg2+1.0μL、5.0 mmol·L-1dNTPs 1.0 μL、5.0 μmol·L-1正向引物2.0 μL、5.0 μmol·L-1反向引物2.0 μL、PlatinumTaqDNA聚合酶0.25 μL、DNA模板約20 ng，加無(wú)菌超純水至25 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)30次（94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。結(jié)果顯示，S22～S24和S29引物對(duì)梅花鹿和馬鹿樣品都產(chǎn)生強(qiáng)度相近的PCR 產(chǎn)物，表明這4 個(gè)引物組合不能分辨梅花鹿和馬鹿，因此被剔除。S25～S28、S33 的結(jié)果中，非目標(biāo)品種出現(xiàn)比目標(biāo)品種較弱的DNA條帶。

表3 梅花鹿和馬鹿PCR引物設(shè)計(jì)及其物理特性

考察不同的PCR條件對(duì)S25～S28、S33的擴(kuò)增目標(biāo)條帶的改進(jìn)，包括PCR 緩沖液（Platinum?TaqPCR 緩沖液、Platinum ?TaqDNA Polymerase High Fidelity緩沖液）、Mg2+濃度（1.0～2.0 mmol·L-1）、Taq酶（Platinum?TaqDNA 聚合酶、Platinum?TaqHigh Fidelity 酶）、退火溫度（55～68 ℃）和循環(huán)次數(shù)（25～30 個(gè)循環(huán)）對(duì)擴(kuò)增目標(biāo)條帶的影響，選擇Platinum?TaqPCR 緩沖液、Platinum?TaqDNA 聚合酶、Mg2+最終濃度1.2 mmol·L-1、退火溫度63 ℃和循環(huán)次數(shù)30 為最適宜條件。S27 引物對(duì)梅花鹿樣品產(chǎn)生單一約223 bp 的條帶，而S33 對(duì)馬鹿樣品產(chǎn)生單一約248 bp 的條帶，而非目標(biāo)品種均不會(huì)產(chǎn)生任何目標(biāo)條帶，表明S27和S33能分別作為梅花鹿和馬鹿的特異性測(cè)試引物。因此，最終選擇S27和S33引物用于樣品DNA擴(kuò)增。

2.5 PCR擴(kuò)增

為更能反映引物組合所針對(duì)的目標(biāo)品種，將S27 定名為CNIP-f/CNIP-r，而S33 定名為CELA-f/CELA-r，首4 字母是科學(xué)名縮寫，f 和r 代表引物方向。CNIP-f/CNIP-r 的目標(biāo)區(qū)域位于DQ985076.1 的第110～332 位堿基，而CELA-f/CELA-r 位 于KT290948.1的第119～366位堿基，均屬于12S核糖體RNA。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 的PCR擴(kuò)增條件見表4。

表4 鹿茸樣品的PCR擴(kuò)增條件

2.6 電泳分析

按需求選擇下述電泳方法觀察PCR 擴(kuò)增情況：1）瓊脂糖凝膠電泳，體系為1.5%凝膠濃度、0.5%TBE 緩沖液、GelRed 核酸染色、紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果。2）自動(dòng)化電泳系統(tǒng)，利用QIAxcel DNA High Resolution Kit在QIAxcel Advanced System分析電泳結(jié)果。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1考察樣品DNA 樣品DNA 模板需進(jìn)行UnivP/UnivQ 的PCR 擴(kuò)增和電泳分析，獲得1 條約104 bp的條帶才會(huì)被采用。

2.7.2重復(fù)性 以對(duì)應(yīng)品種的3 份樣品A、B 和C進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，其中A 抽取9份重復(fù)樣品，B和C各抽取3 份，即合共15 份，按2.5項(xiàng)下條件擴(kuò)增分析，比較15份重復(fù)樣品的PCR 擴(kuò)增情況。所有重復(fù)樣品都應(yīng)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)品種的特異性條帶。結(jié)果表明，15 個(gè)梅花鹿茸重復(fù)樣品在CNIP-f/CNIP-r 的PCR 反應(yīng)中，均產(chǎn)出梅花鹿特異性條帶。15 個(gè)馬鹿茸重復(fù)樣品，在CELA-f/CELA-r 的PCR 反應(yīng)亦擴(kuò)增了馬鹿特異性條帶，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.7.3重現(xiàn)性 共進(jìn)行3 次測(cè)試，每次測(cè)試的操作人員、儀器及測(cè)試日期的組合不相同。3 次測(cè)試都采用同一份的對(duì)應(yīng)品種的樣品，每次抽取3 份重復(fù)樣本，按2.5項(xiàng)下條件擴(kuò)增分析，比較3次測(cè)試中共9 份重復(fù)樣品的PCR 擴(kuò)增情況。所有重復(fù)樣品都應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果表明，在不同的操作人員、時(shí)間、儀器的組合下，對(duì)CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 各進(jìn)行3 次測(cè)試，9 個(gè)梅花鹿茸重復(fù)樣品均得到梅花鹿特異性條帶，9 個(gè)馬鹿茸重復(fù)樣品獲得馬鹿特異性條帶。

2.7.4檢測(cè)限 以對(duì)應(yīng)品種的1 份樣品抽取8 份重復(fù)樣品，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行DNA 提取，用水將DNA 模板質(zhì)量濃度調(diào)至10 ng·μL-1。再以水進(jìn)行10倍序列稀釋，得到10.0、1.0、0.1 ng·μL-1和10、1 pg·μL-1共5 個(gè)質(zhì)量濃度，按2.5項(xiàng)下條件擴(kuò)增分析，找出最低可被擴(kuò)增的DNA 模板質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 檢測(cè)限均為10 ng·μL-1，而其余質(zhì)量濃度均不能檢出。

2.7.5專屬性 利用鹿科動(dòng)物樣品作測(cè)試，包括目標(biāo)品種和非目標(biāo)品種，所采用的鹿類樣品包括19 份梅花鹿茸、20份馬鹿茸、2份水鹿的幼角和2份麋鹿角，每份樣本抽取2份重復(fù)樣品進(jìn)行測(cè)試，按2.5項(xiàng)下條件擴(kuò)增分析，CNIP-f/CNIP-r 的測(cè)試結(jié)果表明，19 份梅花鹿茸樣品都檢出梅花鹿特異性條帶，而其他樣品沒有可觀察的DNA 條帶。CELA-f/CELA-r 測(cè)試中的20 份馬鹿茸樣品都獲得馬鹿特異性條帶，其余樣品皆為陰性。

2.7.6假陽(yáng)性 利用非鹿科動(dòng)物、食用家畜、植物和真菌樣品作測(cè)試，包括水牛、黃牛、綿羊、豬、雞、大頭鱈、無(wú)須鱈、綠青鱈、大西洋鱈、刺五加、馬鞭草、葛和靈芝。每份樣品抽取2 份重復(fù)樣品進(jìn)行測(cè)試。CNIP-f/CNIP-r 的測(cè)試結(jié)果表明，梅花鹿茸樣品檢出梅花鹿特異性條帶，而其他樣品沒有可察的DNA 條帶。CELA-f/CELA-r 測(cè)試中的馬鹿茸樣品都獲得馬鹿特異性條帶，其余樣品皆為陰性。

2.7.7可行性 在香港市場(chǎng)收集鹿茸及其他鹿類產(chǎn)品21 份，包括9 份馬鹿茸切片、5 份馴鹿幼角切片、1份白唇鹿角切片、4份馬鹿筋、1份馬鹿鞭和1份梅花鹿肉干，每份樣本抽取2 份重復(fù)樣品進(jìn)行測(cè)試，按照按2.5項(xiàng)下條件擴(kuò)增分析，考察方法的適用性。結(jié)果表明，CNIP-f/CNIP-r 測(cè)試中梅花鹿肉干樣品出現(xiàn)梅花鹿特異性條帶，而CELA-f/CELA-r 能篩選出馬鹿茸切片、馬鹿筋和馬鹿鞭，與DNA 測(cè)序的結(jié)論一致。

2.7.8實(shí)驗(yàn)室間比對(duì) 委托獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)工作，共同驗(yàn)證測(cè)試方法，確保實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性和結(jié)果的一致性。各實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣本的共同驗(yàn)證特異性PCR 結(jié)果應(yīng)一致。實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果表明，參與比對(duì)的實(shí)驗(yàn)室所得的結(jié)果相同，CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 能區(qū)分梅花鹿和馬鹿。CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 引物對(duì)梅花鹿、馬鹿和其他混淆品的電泳結(jié)果見圖1～6。

圖1 梅花鹿的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖2 馬鹿的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖3 其他鹿科動(dòng)物的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖4 梅花鹿的CELA-f/CELA-r電泳圖

圖5 馬鹿的CELA-f/CELA-r電泳圖

圖6 其他鹿科動(dòng)物的CELA-f/CELA-r電泳圖

2.8 混合樣品研究

對(duì)混合來(lái)源的鹿樣品進(jìn)行研究。配制3 組等質(zhì)量混合樣品，包括梅花鹿和馬鹿混合樣品、梅花鹿和馴鹿混合樣品、馬鹿和馴鹿混合樣品。提取模板DNA后，利用CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r均能檢出目標(biāo)品種，且不受其他鹿品種影響（圖7～8）。

圖7 混合樣品的CNIP-f/CNIP-r電泳圖

圖8 混合樣品的CELA-f/CELA-r電泳圖

3 討論

目前已發(fā)表的鹿茸DNA 鑒別方法有特異性PCR[9-12]、PCR 限制性內(nèi)切酶片段[13]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[14]、多重PCR[15]、熔解曲線分析[16]、隨機(jī)擴(kuò)增DNA[17]、DNA 條形碼[18-20]等，都證明DNA 技術(shù)能有效鑒別鹿茸。相對(duì)上述研究，本實(shí)驗(yàn)所建立的篩選方法有4 個(gè)特點(diǎn)：1）能篩選源自梅花鹿和馬鹿的鹿茸飲片和鹿制品。基于梅花鹿和馬鹿同為鹿茸的來(lái)源品種[1]，有2 種可行的設(shè)計(jì)方案。第一種方案是同時(shí)檢驗(yàn)出梅花鹿和馬鹿，優(yōu)點(diǎn)是操作較簡(jiǎn)單。第二種方案是分別針對(duì)梅花鹿和馬鹿進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)點(diǎn)是可明確區(qū)分梅花鹿和馬鹿?？紤]到梅花鹿茸的市價(jià)明顯高于馬鹿茸，所以本篩選方法取第二種方案。2）已通過了一系列的方法學(xué)驗(yàn)證測(cè)試，實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果亦表明方法可靠。3）設(shè)有動(dòng)物類DNA 模板的質(zhì)量控制。UnivP/UnivQ 的目標(biāo)區(qū)域是線粒體16S rRNA 上的保守位置，對(duì)動(dòng)物類基因組具有廣譜性，加上PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度只有104 bp，符合作為質(zhì)量控制的先決條件，確定可從樣本中提取出的動(dòng)物源DNA，其PCR 擴(kuò)增情況能作為篩選結(jié)果的佐證。4）CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r采用相同的PCR 試劑配方和反應(yīng)條件，可減省工序。本篩選方法已上載到香港特別行政區(qū)政府衛(wèi)生署的網(wǎng)站供參考（https://www.cmro.gov.hk/html/gb/GCMTI/gcmti_dnamethod.html）。

建立方法時(shí)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循3 條準(zhǔn)則：1）限制PCR 擴(kuò)增物于200～350 bp，有助于提升PCR 成功率。因中藥材的基因組DNA 大多已被降解，理論上越短的PCR產(chǎn)物越容易被擴(kuò)增。2）將特異性SNP位點(diǎn)置于引物3′的最末端。在PCR 的延伸過程中，未能互補(bǔ)的3′端會(huì)影響5′至3′聚合酶活性，令引物具有區(qū)分目標(biāo)物種和非目標(biāo)物種的能力。3）若目標(biāo)品種在引物3′端的第三和第四個(gè)堿基位置出現(xiàn)種內(nèi)變異，將該位置轉(zhuǎn)為簡(jiǎn)并堿基，避免因堿基不互補(bǔ)而降低PCR 產(chǎn)物，減損檢測(cè)靈敏度。根據(jù)下載的梅花鹿和馬鹿的線粒體基因組序列排序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者的種內(nèi)的變異大，穩(wěn)定的特異性SNP 位點(diǎn)不多，局限了引物設(shè)計(jì)，按上述3 條準(zhǔn)則，最終只能設(shè)計(jì)出1 個(gè)馬鹿引物組合，并需為3′末端的第三和第四個(gè)堿基轉(zhuǎn)為簡(jiǎn)并堿基。檢測(cè)限測(cè)試中，DNA 質(zhì)量濃度梯度設(shè)定為0.001～10 ng·μL-1，測(cè)試結(jié)果顯示最低質(zhì)量濃度為10 ng·μL-1，即檢測(cè)上限，較合適的設(shè)定應(yīng)為50.0、20.0、10.0、1.0、0.1 ng·μL-1。

為獲得可靠的結(jié)果，使用本篩選方法時(shí)應(yīng)注意：1）加入陽(yáng)性對(duì)照和提取陰性對(duì)照；2）在PCR 反應(yīng)中加入PCR陰性對(duì)照；3）以UnivP/UnivQ的PCR擴(kuò)增作為質(zhì)量控制；4）確保DNA 模板量達(dá)到方法要求。關(guān)于第四點(diǎn)，在方法學(xué)驗(yàn)證的可行性測(cè)試中，已表明本方法不僅能篩選鹿茸，亦適用于鹿筋、鹿肉干和鹿鞭，本方法的檢測(cè)限為10 ng·μL-1，操作人員應(yīng)評(píng)估某些部位，如毛發(fā)的DNA 模板量能否滿足相關(guān)要求。若樣品不符合最低要求，或需要進(jìn)一步確定本方法的篩選結(jié)果，可按檢測(cè)目的采用其他鑒別方法作為互補(bǔ)，如鑒別動(dòng)物類藥材的DNA 條形碼檢測(cè)法。

已有文獻(xiàn)證實(shí)，DNA 技術(shù)能應(yīng)用于混合來(lái)源藥材。賈靜等[21]對(duì)市售鹿茸粉進(jìn)行DNA 條形碼檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)中3 份樣本的COⅠ測(cè)序峰圖雜合度較高，重新測(cè)序前利用分子克隆方法得到單一來(lái)源序列，以解決因存在多于1 種COⅠ序列而令測(cè)序峰圖雜亂，導(dǎo)致無(wú)法作出判斷的問題，結(jié)果表明，該3 份樣本均含多于1 種的鹿品種或類群。本課題組嘗試?yán)帽痉椒▽?duì)混合來(lái)源的鹿樣品進(jìn)行篩選，初步發(fā)現(xiàn)CNIP-f/CNIP-r 和CELA-f/CELA-r 均能檢出目標(biāo)品種，且不受其他鹿品種影響。但本方法的適用范圍是篩選單一來(lái)源的鹿類樣品，是否同樣適用于混合來(lái)源樣品需進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證測(cè)試。