陳少軍，錢蘇波，曹奇峰，邵 寧，虞永江，顧正勤，沈海波

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院泌尿外科，上海 200092)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于腎實(shí)質(zhì)小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，簡(jiǎn)稱腎癌，是成人最常見(jiàn)的腎臟惡性腫瘤，約占所有腎臟腫瘤的90%[1]。由于缺乏早期的臨床表現(xiàn)和診斷標(biāo)志物，超過(guò)50%的腎癌患者為偶然發(fā)現(xiàn)，并且約20%～30%的患者在首次診斷為腎癌時(shí)已經(jīng)伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腎癌患者5年生存率超過(guò)70%，而發(fā)生轉(zhuǎn)移的腎癌患者5年生存率不足12%[3]。因此，進(jìn)一步研究腎癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找腎癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，有助于提高腎癌的早期診斷及改善腎癌患者的預(yù)后。

微小RNAs (miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，主要通過(guò)結(jié)合其下游靶基因mRNA的3’UTR(3’ untranslated regions)引起的mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，從而影響靶基因的表達(dá)水平[4]。大量的研究結(jié)果表明，miR-195-5p作為抑癌基因在多種癌癥中低表達(dá)并可影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，如前列腺癌、胰腺癌和宮頸癌等[5-7]。然而，miR-195-5p在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究尚少。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)miR-195-5p在腎癌組織和細(xì)胞中均表現(xiàn)出明顯的低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-195-5p可抑制腎癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡[8]。本研究旨在進(jìn)一步探討miR-195-5p對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)的影響及機(jī)制，從而進(jìn)一步闡明其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑腎癌細(xì)胞株786-O購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞中心。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及青霉素鏈霉素雙抗(100×)購(gòu)自Gibco公司，EDTA-0.25%胰酶購(gòu)自Amersco公司，RNA提取試劑Trizol和細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自invitrogen 公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；miR-195-5p mimics、miR-195-5p inhibitors、ROCK1 si-RNA及其空白對(duì)照(miR-NC，inhibitor-NC，siNC)購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。ROCK1及β-actin的一抗購(gòu)自Abcam公司，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，Western blot二抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人腎癌細(xì)胞株786-O利用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、50 U/mL的青霉素和50 μg/mL的鏈霉素。培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%的CO2和95%的濕度。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，將miR-195-5p mimics、miR-NC、miR-195-5p inhi-bitors、inhibitor-NC、ROCK1 si-RNA或siNC利用Lipofectamine 2000按照說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)RNA或蛋白的表達(dá)水平及進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，利用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照熒光定量RT-PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系，在ABI熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，利用2-ΔΔCt的方法計(jì)算miR-195-5p的相對(duì)表達(dá)量。U6作為miR-195-5p的內(nèi)參對(duì)照。miR-195-5p正向引物序列為5′-GGGGTAGCAGCACAGAAAT-3′，反向引物序列為5′-TCCAGTGCGTGTCGTGGA-3′；U6的正向引物序列為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGCAGC-3′，反向引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，將細(xì)胞以大約20%的濃度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞濃度長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用200 μL的移液器槍頭在6孔板的底面劃出均勻的線條，加入PBS漂洗3次，去除脫落細(xì)胞。每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)基2 mL，在倒置顯微鏡下拍照，記錄0 h的劃痕寬度。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出6孔板，在倒置顯微鏡下拍照并測(cè)量劃痕寬度，從而檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕跨度×100%。

1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，去除培養(yǎng)基、消化、離心、加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。在Transwell小室的上室內(nèi)加入含1.0×105個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基單細(xì)胞懸液200 μL，在下室內(nèi)加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出Transwell小室，用PBS清洗3次，4%的多聚甲醛室溫下固定30 min。用棉簽將上室內(nèi)未穿透的細(xì)胞輕輕擦去，再用1%的結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗3次。將Transwell小室于倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇三個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)通過(guò)TargetScan生物信息學(xué)分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)得知ROCK1為miR-195-5p的靶基因，我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)miR-195-5p與基因相互作用的序列，設(shè)計(jì)野生型3′UTR及無(wú)法與miR-195-5p結(jié)合的突變型3′UTR，并構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmirGLO-ROCK1-Wt 3’UTR (Wt 3′UTR)和pmirGLO-ROCK1-Mut 3′UTR(Mut 3′UTR)。將miR-195-5p mimics或miR-195-5p NC與ROCK1的Wt 3′UTR或Mut 3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后利用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞中的熒光素酶活性，相對(duì)熒光值=螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光值/海腎熒光素酶的熒光值。

1.7 免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)取轉(zhuǎn)染48 h且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用冷PBS清洗后提取細(xì)胞蛋白，100 ℃煮樣后上樣于SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳分離。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜、5%的脫脂牛奶室溫下封閉1 h。PBS-T將膜清洗3次后，按照說(shuō)明書(shū)的濃度加入一抗溶液在4 ℃避光條件下孵育過(guò)夜。次日，用PBS-T洗膜后加入二抗溶液于4 ℃孵育1 h。二抗孵育完成后，用PBS-T洗膜3遍，于Oddesey掃膜儀上進(jìn)行掃膜。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 miR-195-5p對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-195-5p在腎癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，提示其在腎癌中可能是一個(gè)抑癌基因[8]。為了研究miR-195-5p對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響，我們將miR-195-5p mimics轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞786-O過(guò)表達(dá)miR-195-5p，并在轉(zhuǎn)染48 h后利用qRT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證(圖1A)。其次，分別通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測(cè)了過(guò)表達(dá)miR-195-5p的786-O細(xì)胞遷移、侵襲能力及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-195-5p后腎癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力均明顯降低(圖1B、C)，EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin表達(dá)增高而N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低(圖1D)。該研究結(jié)果提示miR-195-5p可抑制腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲及EMT。

A:轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics(miR-195)后miR-195-5p的表達(dá)水平；B：786-O細(xì)胞的遷移圖(×10)及其柱狀圖；C：786-O細(xì)胞侵襲的結(jié)晶紫染色圖(×20)及其柱狀圖；D：EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)相關(guān)蛋白的表達(dá)量的免疫印跡圖；*P<0.05。

2.2 ROCK1是miR-195-5p的靶基因?yàn)榱搜芯縨iR-195-5p影響腎癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的相關(guān)機(jī)制，我們通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetscan預(yù)測(cè)得知ROCK1是miR-195-5p的一個(gè)靶基因，其結(jié)合序列如下(圖2A)。有文獻(xiàn)報(bào)道ROCK1在腎癌中高表達(dá)并且作為促癌基因影響腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[9-10]。另外，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-195-5p mimics可明顯降低ROCK1-Wt 3’UTR的熒光素酶活性、而不能降低ROCK1-Mut 3’UTR的熒光素酶活性(圖2B)。并且，我們還檢測(cè)了腎癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-195-5p對(duì)ROCK1的影響。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-195-5p可使ROCK1的表達(dá)水平明顯降低(圖2C)。該研究結(jié)果提示ROCK1為miR-195-5p的靶基因。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-195-5p inhibitors及si-ROCK1的效果檢測(cè)為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-195-5p對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響及機(jī)制，我們轉(zhuǎn)染了miR-195-5p inhibitors抑制腎癌細(xì)胞中miR-195-5p的表達(dá)，并利用qRT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證(圖3A)。另外，在抑制miR-195-5p表達(dá)的腎癌細(xì)胞中，我們利用si-RNA干擾了ROCK1的表達(dá)，并通過(guò)Western blot進(jìn)行了驗(yàn)證(圖3B)。

2.4 抑制miR-195-5p的表達(dá)和干擾ROCK1的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響分別檢測(cè)了抑制miR-195-5p的表達(dá)和抑制miR-195-5p的表達(dá)后干擾ROCK1的表達(dá)，腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制miR-195-5p可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲及EMT，而干擾ROCK1后可部分抵消miR-195-5p抑制對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響(圖4)。該結(jié)果提示miR-195-5p可能通過(guò)靶向ROCK1抑制腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

A：生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetscan預(yù)測(cè)；B：雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)；C：免疫印跡試驗(yàn)。

A：轉(zhuǎn)染miR-195-5p inhibitors后miR-195-5p的表達(dá)量(*P<0.05)；B：轉(zhuǎn)染si-ROCK1后腎癌細(xì)胞ROCK1的表達(dá)量。

A:腎癌細(xì)胞的遷移圖(×10)及其柱狀圖；B:腎癌細(xì)胞侵襲的結(jié)晶紫染色圖(×20)及其柱狀圖；C:EMT相關(guān)蛋白表達(dá)量的免疫印跡圖；*P<0.05。

3 討 論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明microRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，如影響細(xì)胞增殖、凋亡、周期轉(zhuǎn)化、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及免疫應(yīng)答等過(guò)程[11]。在腎癌中，同樣有大量的microRNA被證實(shí)存在異常表達(dá)并作為癌基因或抑癌基因影響腎癌的發(fā)生和進(jìn)展，從而有可能成為腎癌的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[12]。miR-195被證實(shí)在多種癌癥中低表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)控其下游的靶基因影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。如LUO等[13]報(bào)道m(xù)iR-195可通過(guò)靶向周期蛋白依賴激酶8(cyclin dependent kinase 8，CDK8)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等。LIU等[7]研究結(jié)果提示miR-195可通過(guò)靶向Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein1，YAP1)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。另外，還有研究表明miR-195可通過(guò)調(diào)控叉頭框蛋白K1(Forkhead box K1，F(xiàn)OXK1)抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等[14]。然而，miR-195在腎癌中的表達(dá)及功能目前研究尚少。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)miR-195-5p在腎癌中低表達(dá)并且可影響腎癌細(xì)胞的增殖和凋亡等。這些研究結(jié)果表明miR-195-5p可能作為抑癌基因參與了腎癌的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程。在本研究中，我們進(jìn)一步探討了miR-195-5p對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)等的影響。為了過(guò)表達(dá)或抑制腎癌細(xì)胞中miR-195-5p的表達(dá)水平，我們向腎癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-195-5p mimics或inhibitors。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-195-5p可抑制腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT；而抑制miR-195-5p可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT等。接著，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ROCK1是miR-195-5p的一個(gè)靶基因。因此，我們進(jìn)一步研究了miR-195-5p影響腎癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

ROCK1作為癌基因在多種癌癥中高表達(dá)，主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞遷移、侵襲及血管生成等過(guò)程促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，如黑色素瘤[15]、膠質(zhì)瘤[16]和非小細(xì)胞肺癌[17]等。有研究表明miR-195可通過(guò)靶向ROCK1調(diào)控喉癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為[18]。然而miR-195-5p能否通過(guò)靶向ROCK1調(diào)控腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為尚鮮見(jiàn)研究。我們通過(guò)Targetscan等生物信息學(xué)分析得知ROCK1是miR-195-5p的靶基因，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-195-5p可與ROCK1的3’UTR結(jié)合。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明miR-195-5p可抑制ROCK1在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)。另外，我們?cè)谝种颇I癌細(xì)胞miR-195-5p的表達(dá)后利用siRNA干擾ROCK1的表達(dá)并檢測(cè)了腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT。研究結(jié)果表明干擾ROCK1的表達(dá)可部分抵消抑制miR-195-5p對(duì)腎癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響。這些研究結(jié)果表明miR-195-5p可通過(guò)靶向ROCK1抑制腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-195-5p在腎癌的發(fā)生發(fā)展中是一個(gè)抑癌基因，可通過(guò)靶向ROCK1抑制腎癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)行為。該研究結(jié)果提示miR-195-5p可能成為腎癌的分子標(biāo)志物，為腎癌患者的早期診斷和治療提供新的可能。