徐國雙，姜童瀟，郭藝迪，段 銘，張茂林，關(guān)振宏

（吉林大學人獸共患病研究所/人獸共患病教育部重點實驗室，吉林 長春 130062）

【研究意義】禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）可引發(fā)家禽及野生禽類出現(xiàn)高度接觸性傳染病，高致病性AIV 亞型病毒的致死率接近100%。AIV 通過在宿主中頻繁變異和基因重組而不斷跨越種屬屏障，在人及其他哺乳動物之間造成感染和傳播，H5N1 和H7N9 亞型是其最典型的毒株［1-2］。自2013 年H7N9 亞型AIV 首次在我國出現(xiàn)后，人感染此亞型AIV 的病例持續(xù)增多，死亡率接近40%，已對人類健康造成嚴重威脅［3-6］。研究H7N9 亞型AIV 的致病機制是其防控的迫切需要，而病毒蛋白質(zhì)與宿主細胞蛋白質(zhì)相互關(guān)系的闡明有利于揭示病毒生命活動的分子機制，對流感治療和抗病毒新藥開發(fā)也具有一定指導意義。

【前人研究進展】PA-X 蛋白是流感病毒PA基因通過核糖體移碼來識別X-ORF 而產(chǎn)生的一種融合蛋白［7］。PA-X 蛋白已被證實在病毒感染過程中具有多種重要功能，包括宿主細胞關(guān)閉［8］、參與病毒復制［9-10］、調(diào)控宿主天然免疫和獲得性免疫反應［11-12］、調(diào)節(jié)病毒毒力和聚合酶活性［13-14］等。Jagger 等［7］證實PA-X 蛋白可以減弱1918年大流行的H1N1 亞型AIV 對小鼠的致病性，并能顯著抑制與炎癥及細胞凋亡相關(guān)的細胞免疫應答。研究發(fā)現(xiàn)，H5N1 亞型AIV 的PA-X 蛋白作為病毒毒力的負調(diào)控因子，可以通過抑制病毒復制和鈍化宿主的整體免疫反應而使病毒的毒力降低［15］。也有研究證實PA-X 蛋白能夠降低2009年大流行的H1N1 亞型AIV 和H5N1 亞型AIV 在小鼠中的毒力和宿主炎癥反應［16］。許多證據(jù)表明PA-X 蛋白的功能具有毒株、亞型或宿主特異性，其潛在的作用機制仍未被闡明。

【本研究切入點】AIV 感染過程中，PA-X蛋白可能通過與宿主細胞多種蛋白發(fā)生互作，進而影響宿主細胞的諸多生理過程。但目前對于PA-X 與宿主蛋白的互作及作用機制研究仍比較匱乏。為了更深入地解析H7N9 亞型AIV 的PA-X 蛋白影響其致病性的分子機制，本研究采用GST 融合蛋白沉降技術(shù)（GST pull-down）在哺乳動物細胞中篩選與之相互作用的宿主細胞蛋白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在原核表達系統(tǒng)中表達純化可溶性GST-PA-X 融合蛋白，通過GST pull-down 技術(shù)將A549 細胞中能與PA-X 蛋白特異相互作用的宿主蛋白捕獲，并進行質(zhì)譜鑒定及生物信息學分析，為進一步研究PA-X 蛋白的作用機制和H7N9 亞型AIV 的分子致病機制及預防控制提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

質(zhì)粒pGEX-4T-1、pcDNA3-HA-Hsp70-2、pCAGGS-FLAG-PA-X 及PA-X T 載體和A549 細胞均由吉林大學人獸共患病研究所病毒病研究室保存。大腸桿菌菌株DH5α 和BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Glutathione Sepharose 4B beads 購自美國General Electric（GE）公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）、蛋白分子量標準、熒光素標記的羊抗鼠IgG 及羊抗兔IgG 購自美國賽默飛世爾科技公司；Anti-HA Antibody 和Anti-FLAG Antibody 購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 PA-X原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank公布的H7N9亞型AIV的PA-X（KF420307.1）序列，設計引物擴增PA-X的X-ORF結(jié)構(gòu)域（C末端191～252 aa），上游引物F：5'-CGGGATCCATGG AAGACTTTGTGCGACA-3'，下游引物R：5'-CG GAATTCTCACTTCTTTTGACATCTGAG-3'，引物由長春庫美生物公司合成。以pMD-18T-PA-X野生型載體為模板進行擴增，將擴增片段連接至BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切后的pGEX-4T-1載體上。連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取平板上單克隆菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。隨后進行PCR鑒定及雙酶切鑒定，對陽性質(zhì)粒進行測序驗證，測序正確的重組表達載體命名為pGEX-4T-PA-X。

1.2.2 融合蛋白的誘導表達及純化 將構(gòu)建的pGEX-4T-PA-X 原核表達載體轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細胞，進行GST-PA-X 融合蛋白的誘導表達。利用0.2 mmol/L IPTG 誘導劑于16 ℃下對融合蛋白進行誘導表達，收集菌體對其進行超聲裂解并收集上清，利用SDS-PAGE 分離蛋白后，通過考馬斯亮藍染色法檢測GST-PA-X 融合蛋白的表達。

1.2.3 GST pull-down 篩選與PA-X 互作的蛋白采用RIPA 裂解液裂解A549 細胞，離心收集上清液。將A549 全蛋白裂解物500 μL 分別加入到GST 蛋白及GST-PA-X 蛋白吸附柱中，4 ℃震蕩孵育3 h。兩組蛋白沉淀物用裂解液洗滌4 次以洗掉非特異性結(jié)合蛋白，加入SDS 上樣緩沖液煮沸后，進行SDS-PAGE 分析及考馬斯亮藍染色。將兩組蛋白泳道中GST 蛋白富集處的條帶切下，其余部分蛋白膠進行后續(xù)的質(zhì)譜分析。

1.2.4 質(zhì)譜鑒定與PA-X 互作的蛋白 將GST pull-down 試驗獲得的蛋白膠送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，以液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）聯(lián)用方法進行質(zhì)譜分析，采用Mascot 軟件［17］鑒定蛋白質(zhì)。

1.2.5 PA-X 互作蛋白的生物信息學分析 整理質(zhì)譜鑒定結(jié)果，去掉GST 空載體組所有的非特異性蛋白，篩選出與H7N9 亞型AIV PA-X 互作的特異性宿主蛋白，利用PANTHER、DAVID 等在線數(shù)據(jù)庫進行GO 功能富集和KEGG 通路分析，包括蛋白質(zhì)分類（Protein Class，PC）、生物學過程（Biological Process，BP）和分子功能（Molecular Function，MF）分析。

1.2.6 免疫熒光技術(shù)驗證Hsp70-2 與PA-X 的相互作用 將A549 細胞接種于鋪有細胞爬片的12 孔培養(yǎng)板，長成單層后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX 共轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-Hsp70-2和pCAGGS-FLAG-PA-X 質(zhì)粒，24 h后細胞用4%多聚甲醛固定20 min，再用2% Triton X-100 透化處理10 min；隨后加入一抗FLAG 和HA，4 ℃下結(jié)合過夜；加入二抗Alexa 488 標記的山羊抗鼠和Alexa 594 標記的山羊抗兔IgG，室溫下結(jié)合1 h；最后用Hochest 染細胞核5 min，置熒光顯微鏡下觀察蛋白共定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PA-X 原核表達載體的構(gòu)建

為了在大腸桿菌中表達純化PA-X 蛋白，將PA-X 特有的X-ORF 結(jié)構(gòu)域基因構(gòu)建到pGEX-4T-1 原核表達載體上，對pGEX-4T-PA-X 重組表達載體進行PCR 鑒定和雙酶切鑒定，對陽性質(zhì)粒進行測序分析。從鑒定結(jié)果（圖1）可見，得到與預期大小一致的目的條帶，表明成功構(gòu)建PA-X 原核表達載體。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-PA-X 的PCR 鑒定（A）及酶切鑒定（B）結(jié)果Fig.1 Results of PCR identification（A）and enzyme digestion of pGEX-4T-PA-X recombinant plasmid（B）

2.2 GST pull-down 篩選與PA-X 互作的蛋白

從A549 細胞中提取總蛋白，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示蛋白大小分布均勻（圖2），可以進行GST pull-down 試驗。對試驗得到的蛋白沉淀復合物進行SDS-PAGE 電泳分析，與GST 陰性對照相比，PA-X 融合蛋白沉淀存在多條差異條帶，該試驗進行了2 次重復，蛋白條帶型基本一致（圖2）。

圖2 GST pull-down 產(chǎn)物的SDS-PAGE 檢測結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE detection results of GST pull-down products

2.3 質(zhì)譜鑒定與PA-X 互作的蛋白

將質(zhì)譜鑒定出的肽段剔除空載體GST 對照中的非特異性蛋白，在UniProt 蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫中進行檢索，從而確定每組條帶內(nèi)含有的蛋白質(zhì)種類?；谄ヅ潆亩螖?shù)≥2 的原則，篩選到39個可信度高的與PA-X 互作的蛋白（表1）。已有研究表明熱休克蛋白Hsp70 可對多種病毒的復制發(fā)揮調(diào)控作用，因此本研究選取可信度最高的Hsp70 蛋白家族的Hsp70-2，對其與PA-X 的相互作用作進一步驗證，以闡明Hsp70 調(diào)控病毒復制的機制。

表1 與PA-X 互作的A549 細胞候選蛋白Table 1 Candidate proteins of A549 cell interacting with PA-X

2.4 PA-X 互作蛋白的生物信息學分析

2.4.1 GO 功能富集分析 采用PANTHER 在線數(shù)據(jù)庫對PA-X 潛在的互作蛋白進行分類分析及功能注釋。分析結(jié)果（圖3）表明，39 種蛋白包括核酸代謝蛋白、翻譯相關(guān)蛋白、代謝轉(zhuǎn)換酶、蛋白修飾酶及骨架蛋白等，其中27.5%的蛋白屬于核酸代謝蛋白類，17.5%的蛋白屬于翻譯過程相關(guān)蛋白類。此外，從分子功能角度來看，篩選到的這些蛋白主要發(fā)揮翻譯調(diào)節(jié)活性、大分子結(jié)合活性、分子功能調(diào)節(jié)活性、催化活性等分子功能（圖3）。

圖3 潛在PA-X 相互作用蛋白的GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of potential PA-Xinteracting proteins

2.4.2 生物過程及信號通路富集分析 利用DAVID 在線分析軟件進一步對鑒定的PA-X 潛在互作蛋白進行生物學過程分析，結(jié)果（圖4）表明，這些蛋白主要參與mRNA、ncRNA 的分解代謝，RNA 加工、翻譯，細胞周期調(diào)控、多肽生物合成和基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物過程。KEGG 通路分析結(jié)果表明，這些PA-X 互作蛋白主要參與剪接體、RNA 運輸、核糖體生物合成、麻疹病毒感染等通路。

圖4 潛在PA-X 相互作用蛋白的生物學過程分析Fig.4 Biological process enrichment analysis of potential PA-X interaction proteins

2.5 免疫熒光技術(shù)驗證Hsp70-2 與PA-X 的相互作用

將質(zhì)粒pcDNA3-HA-Hsp70-2 和pCAGGSFLAG-PA-X 共轉(zhuǎn)染A549 細胞，熒光抗體染色后在熒光顯微鏡下觀察蛋白共定位情況，結(jié)果（圖5）顯示，過表達的HA-Hsp70-2 主要集中在細胞漿，而FLAG-PA-X 在細胞漿和細胞核均有分布，這與已知文獻報道相符［7］。兩個蛋白的熒光圖像重疊后呈現(xiàn)黃色熒光，說明二者可以共定位于細胞漿內(nèi)，進一步證實了Hsp70-2 與PA-X 蛋白在哺乳動物細胞中互作的可能性。

圖5 免疫熒光檢測Hsp70-2 和PA-X 的相互作用Fig.5 Interaction of Hsp70-2 and PA-X by immunofluorescence examination

3 討論

流感病毒PA-X 蛋白是甲型流感病毒基因組片段3 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，被證實可以減弱1918 H1N1、2009 H1N1 和H5N1 等亞型流感病毒對小鼠的致病性，并能顯著抑制宿主的先天性免疫應答。己有研究表明PA-X 在不同亞型流感病毒的致病性中發(fā)揮的作用不同。但目前國內(nèi)外關(guān)于PA-X 蛋白對H7N9 亞型AIV 致病性影響的研究寥寥無幾［18］。從整體上研究病毒蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用及生物學功能，是揭示病毒蛋白功能及病毒致病機制的重要手段。目前對于流感病毒PA-X 與宿主蛋白的互作及作用機制仍不明確。Li 等［19］利用親和純化和質(zhì)譜分析方法，在感染H5N1 亞型AIV 的雞細胞中鑒定出56 種潛在與PA-X 互作的宿主蛋白。因此，篩選和鑒定出與H7N9 亞型AIV PA-X 蛋白互作的宿主因子對AIV 的致病機制研究具有重要價值。

本研究利用GST pull-down 和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的方法，在哺乳動物細胞水平對與H7N9 亞型AIV PA-X 蛋白存在互作的宿主蛋白進行了鑒定及生物信息學分析。將質(zhì)譜鑒定出的肽段在UniProt 蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫中進行檢索，并且按照匹配肽段數(shù)≥2 的原則，共篩選到39 個潛在的PA-X 互作蛋白質(zhì)。對這些候選蛋白進行GO 富集分析，其分子功能主要是翻譯調(diào)節(jié)活性、大分子結(jié)合活性、分子功能調(diào)節(jié)活性和催化活性等。大多數(shù)蛋白（55%）具有大分子結(jié)合活性，如mRNA 和各種蛋白質(zhì)等。15 個蛋白（37.5%）具有催化活性，如聚合酶、核酸酶、連接酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶等。這些蛋白主要參與mRNA 及ncRNA 的代謝，RNA 加工、翻譯，細胞周期調(diào)控，多肽生物合成和基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物過程。KEGG 通路分析結(jié)果表明，這些PA-X 的潛在互作蛋白中有4 個蛋白參與剪接體通路，4 個蛋白參與RNA 運輸通路，2 個蛋白參與核糖體生物合成通路，4 個蛋白參與麻疹病毒感染等通路。這些候選互作蛋白的功能與PA-X的宿主細胞關(guān)閉和核酸內(nèi)切酶活性相一致，提示PA-X 可能通過與多種宿主蛋白特異性互作而在病毒感染周期中執(zhí)行其重要分子功能。

研究證實，一種通過RIG-I 樣受體（RLR）信號途徑而介導炎癥反應的正調(diào)節(jié)宿主蛋白Ankrd17，能夠直接與PA-X 相互作用［20］。而且PA-X 蛋白可以通過與Ankrd17 的互作而調(diào)控病毒感染后的天然免疫反應。本研究鑒定的PA-X候選互作蛋白中也包含Ankrd17（匹配肽段數(shù)=1），說明本研究方法有較好的可信度。

Hsp70蛋白家族是一類重要的分子伴侶蛋白，通過控制蛋白質(zhì)構(gòu)象而參與信號轉(zhuǎn)導，發(fā)揮抗凋亡活性、血管生成、細胞器和分泌蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運等作用。Hsp70 蛋白家族至少包括14 個成員，進化上高度保守［21］。Hsp70 已被證實對多種病毒的復制發(fā)揮重要作用，包括A 型流感病毒、狂犬病毒、寨卡病毒、豬PRRSV 病毒、口蹄疫病毒和登革病毒等［22-27］。Hsp70 已經(jīng)被證實可以通過阻止流感病毒RNP 復合體的核輸出，或者阻斷病毒聚合酶與病毒RNA 的結(jié)合而發(fā)揮抑制流感病毒復制的作用［28］。本研究對評分最高的宿主蛋白Hsp70-2 與PA-X 的相互作用作進一步驗證，免疫熒光試驗結(jié)果表明，Hsp70-2 與PA-X 可以在細胞漿中共定位，提示Hsp70-2 可能通過與病毒PA-X 蛋白相互作用而調(diào)控病毒復制。后續(xù)可對二者互作的生物學意義和分子機制作進一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用GST pull-down 聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)的方法，在哺乳動物細胞A549 中篩選了與AIV PA-X 存在相互作用的宿主蛋白，質(zhì)譜分析鑒定得到39 個高可信度的PA-X 候選互作蛋白。GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與RNA 代謝、加工和轉(zhuǎn)運等生物學過程，這與PA-X 的核酸內(nèi)切酶活性密切相關(guān)，PA-X 蛋白很可能通過與這些宿主蛋白的相互關(guān)聯(lián)而執(zhí)行其宿主細胞關(guān)閉功能和抑制宿主的抗病毒反應功能。