毛雷剛，張志山，朱樹人*，朱永安，張龍崗，安麗

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.山東省淡水漁業(yè)研究院，山東 濟(jì)南 250013）

染色體作為遺傳物質(zhì)的主要載體，承擔(dān)著遺傳信息的存儲(chǔ)、復(fù)制、傳遞等功能。研究魚類染色體對(duì)探討魚類的遺傳、分類、種群進(jìn)化、性別分化、雜交育種及基因定位等方面均有重要意義。染色體研究是遺傳育種工作的基礎(chǔ)，到目前為止，學(xué)者們已對(duì)約2 000種魚類進(jìn)行了染色體相關(guān)分析。金黃色烏鱧是繁育過程中發(fā)現(xiàn)的白化突變體，因其金黃色體表及粉紅色眼球，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，目前尚未見金黃色烏鱧染色體組型的相關(guān)研究報(bào)道?，F(xiàn)對(duì)金黃色烏鱧進(jìn)行了染色體核型分析，以期了解其細(xì)胞遺傳學(xué)特性，為深入開展金黃色烏鱧良種選育提供理論參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

金黃色烏鱧取自山東省淡水漁業(yè)研究院試驗(yàn)基地（莒縣）。2021年3月，選擇體表無傷、無畸形的健壯個(gè)體6尾，體質(zhì)量為150～200 g。

1.2 染色體標(biāo)本制備

參照林義浩活體注射植物血球凝集素（PHA）的方法，并稍作改進(jìn)，向每尾魚腹腔中注射體質(zhì)量含量為10μg/g的PHA，繼續(xù)飼養(yǎng)22 h后以5μg/g的含量注射秋水仙素。3 h后，斷尾放血，解剖取出頭腎，用生理鹽水洗滌干凈后置于培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪充分剪碎，加入0.075 mol/L的氯化鉀（KCL）低滲溶液吹打均勻，在37℃水浴條件下低滲處理40 min。將低滲溶液1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入適量現(xiàn)配卡諾氏固定液[（甲醇）∶（冰醋酸）=3∶1）]混勻，靜置固定30 min后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)進(jìn)行3次。經(jīng)3次固定后棄上清液，重新加入少量現(xiàn)配固定液，吹打均勻制成懸液。采用冷片法滴片，自然風(fēng)干后，用10%Giemsa染液染色20 min，純水沖洗、晾干后進(jìn)行鏡檢。

1.3 染色體組型分析

將制備好的染色體標(biāo)本在高倍顯微鏡下觀察，選取100個(gè)處于中期分裂相、分散良好的染色體組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定染色體數(shù)目，從中挑選10個(gè)清晰、無重疊且分裂相完整的染色體進(jìn)行拍照。利用Photoshop軟件處理圖片并測(cè)量。參照Levan等的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)染色體進(jìn)行配對(duì)及分類，計(jì)算金黃色烏鱧染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比等基本參數(shù)。其中m和sm型染色體的臂數(shù)=2；st和t型染色體的臂數(shù)=1。相關(guān)計(jì)算公式如下：

（1）臂比=長(zhǎng)臂/短臂；

（2）染色體相對(duì)長(zhǎng)度（%）=（每條染色體長(zhǎng)度×2/全部染色體長(zhǎng)度總和）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)

在顯微鏡下對(duì)金黃色烏鱧100個(gè)細(xì)胞的中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到其染色體數(shù)目（表1)。染色體眾數(shù)為48，占總數(shù)的82%。染色體數(shù)目為47、49的比例分別為3%和2%；染色體數(shù)目≤46及≥50所占的比例分別為8%和5%。因此，確定金黃色烏鱧的染色體數(shù)目2=48。

表1 金黃色烏鱧的染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)

2.2 染色體組型分析

金黃色烏鱧各染色體的相對(duì)長(zhǎng)度及臂比見表2。結(jié)果顯示，金黃色烏鱧具有24對(duì)染色體，其中2對(duì)為亞中部著絲粒染色體（sm）、11對(duì)為亞端部著絲粒染色體（st）、11對(duì)為端部著絲粒染色體（t）。組型公式為：2=4 sm+22 st+22 t。臂數(shù)：=52。金黃色烏鱧的中期染色體分裂相和核型圖譜見圖1。

表2 金黃色烏鱧染色體相對(duì)長(zhǎng)度及臂比①

圖1 金黃色烏鱧中期染色體分裂相及其核型

3 討論

染色體核型分析主要研究物種細(xì)胞核內(nèi)染色體的數(shù)目及各染色體的形態(tài)特征。不同類群生物的染色體結(jié)構(gòu)不同，即使同一生物類群的不同物種，其染色體大小、形態(tài)、數(shù)目也會(huì)有所不同。染色體的結(jié)構(gòu)特征在一定范圍內(nèi)能夠反映生物的演化和類群及物種間的親緣關(guān)系，并且對(duì)種間雜交和多倍體育種結(jié)果的預(yù)測(cè)、鑒定、性別遺傳機(jī)理等均有重要的參考價(jià)值。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，金黃色烏鱧染色體數(shù)目2=48，其中包含2對(duì)亞中部著絲點(diǎn)染色體（sm），11對(duì)亞端部著絲點(diǎn)染色體（st），11對(duì)端部著絲點(diǎn)染色體（t），核型公式為2=4 sm+22 st+22 t。有研究表明，染色體組型的真骨魚類中,只有約100種具有性染色體，這說明大部分魚類還沒有進(jìn)化到具有性染色體機(jī)制的程度。本試驗(yàn)中也沒有觀察到異形性染色體的存在。

在我國(guó)有三種比較常見的鱧科魚類，分別為烏鱧、斑鱧和月鱧，其染色體核型統(tǒng)計(jì)如表3。從表中可以看出，金黃色烏鱧的染色體不同于月鱧和斑鱧，染色體核型特征及臂數(shù)與烏鱧相同。金黃色烏鱧與烏鱧除體色外各方面沒有明顯的區(qū)別，這證實(shí)了金黃色烏鱧不屬于單獨(dú)的亞種而是普通體色烏鱧的變異種。白化現(xiàn)象普遍存在于自然界中，從腔腸動(dòng)物到哺乳動(dòng)物均發(fā)現(xiàn)有白化現(xiàn)象。動(dòng)物的白化現(xiàn)象是動(dòng)物體內(nèi)黑色素缺乏或黑色素生成具有障礙導(dǎo)致的一種體色異常病，推測(cè)金黃色烏鱧可能是烏鱧白化的結(jié)果。許多研究結(jié)果已經(jīng)表明,在哺乳動(dòng)物、兩棲類、鳥類和魚類中，酪氨酸酶基因的突變是導(dǎo)致其白化病的主要原因。無論魚類還是哺乳動(dòng)物，引起白化的基因均不止于酪氨酸酶基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)個(gè)別魚類白化與酪氨酸酶基因無關(guān)。

表3 幾種鱧科魚類染色體核型

現(xiàn)代遺傳學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，影響生物形態(tài)生理與行為特征變化的因素，不僅包括染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變，還包括分子水平上的基因突變。僅依靠細(xì)胞水平的核型來反映不同物種的差異有較大的局限性。本研究發(fā)現(xiàn)，金黃色烏鱧的白化現(xiàn)象在染色體水平上與普通烏鱧差異并不明顯，究竟是什么位置的基因發(fā)生突變導(dǎo)致金黃色烏鱧體色白化，還需要進(jìn)一步的鑒定。