錢希逸，李慧，徐亞飛，楊彩梅，2*

（1.浙江萬(wàn)方生物科技有限公司，浙江 安吉 313307；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

南美白對(duì)蝦于20世紀(jì)80年代末引進(jìn)我國(guó)，90年代初期進(jìn)入養(yǎng)殖高峰。基于人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)的突破，對(duì)蝦養(yǎng)殖向規(guī)模化、集約化方向發(fā)展，但也造成養(yǎng)殖環(huán)境惡化與病害頻發(fā)，對(duì)蝦成活率過(guò)低。養(yǎng)殖者將抗生素當(dāng)作對(duì)蝦病害防治的“超級(jí)守門員”，然而抗生素的大量使用帶來(lái)了細(xì)菌耐藥性、藥物殘留、水環(huán)境污染等問(wèn)題，最終造成惡性循環(huán)。因此尋找環(huán)境友好、綠色安全的替抗添加劑成為當(dāng)前水產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。

目前，有機(jī)酸及有機(jī)酸鹽因易吸收、無(wú)毒害和無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)受到關(guān)注。丁酸可為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供能量，利于促進(jìn)細(xì)胞分化與維持結(jié)腸上皮完整性，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。丁酸鈉是丁酸的主要提供方式。田莉?qū)Σ蒴~(yú)投喂含丁酸鈉的飼糧，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能夠促進(jìn)腸道發(fā)育，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)草魚(yú)對(duì)腸炎、赤皮病和爛鰓病的抵抗能力，提高草魚(yú)生產(chǎn)性能。劉文舒等發(fā)現(xiàn)包膜丁酸鈉能促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，增加微絨毛高度和密度等，促進(jìn)建鯉生長(zhǎng)。

植物精油由于其資源豐富、安全、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，成為替代抗生素的熱門選擇，可作為免疫和生理反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，具有抗應(yīng)激、抗氧化、促進(jìn)胃腸道健康的優(yōu)點(diǎn)。在探究百里香酚對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，百里香酚可導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，使胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，進(jìn)而殺滅病原菌，有效抑制病原菌生長(zhǎng)。王猛強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加植物精油能有效改善南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，促進(jìn)腸道健康。Zhou等報(bào)道，乙酸和檸檬酸等有機(jī)酸、香芹酚和百里香酚對(duì)傷寒沙門氏菌具有協(xié)同抑菌作用，韓乾杰等研究表明，丁酸鈉與植物精油存在協(xié)同作用，并且能夠減少75%復(fù)合植物精油的使用。

當(dāng)前，對(duì)丁酸鈉和植物精油的研究大多是對(duì)單一特性進(jìn)行分析，對(duì)丁酸鈉與植物精油協(xié)同作用方面的研究相對(duì)較少，并且多集中于畜禽養(yǎng)殖，關(guān)于甲殼類動(dòng)物的應(yīng)用研究較少。本試驗(yàn)以南美白對(duì)蝦為試驗(yàn)對(duì)象，研究丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對(duì)甲殼類動(dòng)物生長(zhǎng)性能、腸道微生物及非特異性免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用健康南美白對(duì)蝦蝦苗500尾。丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑組成為40%丁酸鈉+7.5%肉桂醛+2.5%百里香酚，采用獨(dú)特的固體分散、緩釋微囊工藝。該制劑由浙江萬(wàn)方生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)飼料配制

試驗(yàn)分為2組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧并添加2.5 kg/t丁酸鈉復(fù)合植物精油制劑。南美白對(duì)蝦基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1和2。

表1 南美白對(duì)蝦基礎(chǔ)日糧配方含量 %

表2 南美白對(duì)蝦基礎(chǔ)日糧營(yíng)養(yǎng)成分 %

1.2.2 試驗(yàn)分組

正式試驗(yàn)前先將蝦苗暫養(yǎng)于室外水泥池中，待蝦苗長(zhǎng)至試驗(yàn)規(guī)格后，將其轉(zhuǎn)入室內(nèi)養(yǎng)殖水桶（4 m），馴化2周以適應(yīng)試驗(yàn)條件。暫養(yǎng)期間根據(jù)蝦苗規(guī)格投喂飼料，試驗(yàn)分組前24 h停止喂食。選取體質(zhì)健壯、規(guī)格基本一致、平均體長(zhǎng)為（4.13±0.05）cm、平均體質(zhì)量為（1.08±0.05）g的南美白對(duì)蝦300尾，隨機(jī)分為2組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾。

1.2.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間每天正常投喂4次（07：00，11：00，17：00和21：00），投餌量為蝦體質(zhì)量的3%～5%，投喂1 h后觀察對(duì)蝦攝食情況調(diào)整投喂量。嚴(yán)格控制養(yǎng)殖用水質(zhì)量，連續(xù)充氧，每日記錄水溫，檢測(cè)氨氮、亞硝酸鹽氮、溶解氧及pH值等水質(zhì)指標(biāo)，定期清理桶底殘餌糞便。試驗(yàn)期間保持水溫在（27.5±1.0）℃，ρ（氨氮）≤0.02 mg/L，ρ（亞硝酸鹽氮）≤0.05 mg/L，ρ（溶解氧）≥5.5 mg/L，pH值為（7.6±0.3），鹽度為（20±1.5）。試驗(yàn)周期為42 d，養(yǎng)殖期間出現(xiàn)的死蝦需及時(shí)清理并記錄。

1.2.4 生產(chǎn)性能測(cè)定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)其饑餓處理24 h，將所有蝦進(jìn)行稱量，計(jì)算終末平均體質(zhì)量與平均體長(zhǎng)（體長(zhǎng)：從眼柄基部到尾節(jié)末端的長(zhǎng)度）。計(jì)算成活率、質(zhì)量增加率、增長(zhǎng)率、特定生長(zhǎng)率和餌料系數(shù)。計(jì)算公式如下：

成活率（%）=（末蝦尾數(shù)/始蝦尾數(shù)）×100；

質(zhì)量增加率（%）=（末均質(zhì)量-初均質(zhì)量）/初均質(zhì)量×100；

增長(zhǎng)率（%）=（末均長(zhǎng)-初均長(zhǎng)）/初均長(zhǎng)×100；

特定生長(zhǎng)率（%）=（ln末均質(zhì)量-ln初均質(zhì)量）/飼養(yǎng)天數(shù)×100；

餌料系數(shù)=飼料攝入量（g，干質(zhì)量）/蝦體質(zhì)量增加量（g，濕質(zhì)量）

1.2.5 腸道微生物計(jì)數(shù)

試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定對(duì)蝦腸道弧菌數(shù)及細(xì)菌總數(shù)。每組隨機(jī)選取15尾蝦，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行解剖，去除腸道內(nèi)糞便，用無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干多余水分，置于滅菌玻璃勻漿器中，加入1 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行勻漿，對(duì)勻漿液進(jìn)行梯度稀釋，取0.1 mL分別涂布于Marine培養(yǎng)基和TCBS弧菌篩選培養(yǎng)基，每組涂布3個(gè)平板，28℃倒置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

每尾蝦腸道細(xì)菌總數(shù)（TBC）按下述公式計(jì)算：

TBC（CFU）=細(xì)菌克隆數(shù)目×10×勻漿液稀釋倍數(shù)/對(duì)蝦尾數(shù)。

每尾蝦腸道弧菌數(shù)（TCBS）按下述公式計(jì)算：TCBS（CFU）=弧菌克隆數(shù)目×10×勻漿液稀釋倍數(shù)/對(duì)蝦尾數(shù)。

1.2.6 非特異性免疫功能檢測(cè)

非特異性免疫功能檢測(cè)指標(biāo)包括血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力。每組隨機(jī)選取15尾（5尾×3重復(fù)）對(duì)蝦，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3次。

（1）血細(xì)胞總數(shù)。用一次性注射器抽取100μL含10%甲醛的0.45 mol/L NaCl溶液，按1∶1比例抽取對(duì)蝦血淋巴，置于1.5 mL干凈離心管中，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用的是25×16型（湯麥?zhǔn)剑┭蛴?jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)時(shí)數(shù)4個(gè)中方格和中央1個(gè)中方格的細(xì)胞數(shù)（即80個(gè)小格），計(jì)算公式為：每mL細(xì)胞數(shù)（個(gè)）=80個(gè)小格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×5×10×稀釋倍數(shù)。

（2）酚氧化酶活力。用ACD-BSolution抗凝劑按1∶1比例抽取對(duì)蝦血淋巴，水平離心機(jī)800 g，4℃離心10 min，取10μL上清液，與10μL 0.3%的L-DOPA混合，在水浴鍋中40℃條件下反應(yīng)30 min，加入80μL 0.9%的NaCl溶液，充分混勻，酶標(biāo)儀固定檢測(cè)OD490的光吸收值，空白對(duì)照組用0.9%的NaCl溶液代替血清。每2 min測(cè)量1次，共測(cè)量10次，以O(shè)D490對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，OD值每分鐘增加0.001定義1個(gè)酶活力單位。

（3）超氧化物歧化酶活力。用ACD-B Solution抗凝劑按1∶1比例抽取對(duì)蝦血淋巴2 mL，水平離心機(jī)800 g，4℃離心10 min，取上清液。根據(jù)Sigma-Aldrich超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行處理，再用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

丁酸鈉復(fù)合植物精油對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響見(jiàn)表3，由表3可知，試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦增長(zhǎng)率、質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率和成活率均顯著高于對(duì)照組，與對(duì)照組比，試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦增長(zhǎng)率升高11.73%（＜0.01），質(zhì)量增加率升高13.58%（＜0.05），特定生長(zhǎng)率顯著升高6.92%（＜0.01），成活率顯著升高5.83%（＜0.01），餌料系數(shù)顯著降低18.24%（＜0.01）。

表3 丁酸鈉復(fù)合植物精油對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響①

2.2 丁酸鈉復(fù)合植物精油對(duì)南美白對(duì)蝦致病性弧菌的影響

丁酸鈉復(fù)合植物精油對(duì)南美白對(duì)蝦腸道總菌數(shù)與致病性弧菌的影響見(jiàn)表4，從表4可知，相比對(duì)照組，試驗(yàn)組的南美白對(duì)蝦的腸道總菌數(shù)無(wú)顯著變化，致病性弧菌則顯著減少（＜0.01），減少幅度達(dá)68.3%。

表4 丁酸鈉復(fù)合植物精油對(duì)南美白對(duì)蝦腸道總菌數(shù)與致病性弧菌的影響① CFU/g

2.3 丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對(duì)南美白對(duì)蝦非特異性免疫的影響

丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對(duì)南美白對(duì)蝦非特異性免疫的影響見(jiàn)表5，由表5可見(jiàn)，相較于對(duì)照組，試驗(yàn)組的南美白對(duì)蝦血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均顯著提高，分別提高11.45%（＜0.05），21.39%（＜0.01）和7.67%（＜0.01）。

表5 丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對(duì)南美白對(duì)蝦非特異性免疫的影響①

3 討論

3.1 丁酸鈉復(fù)合植物精油促進(jìn)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)

丁酸鈉可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高生長(zhǎng)性能。在斑節(jié)對(duì)蝦飼料中添加包膜丁酸鈉，能顯著提高對(duì)蝦質(zhì)量增加率和飼料轉(zhuǎn)化率。丁酸鈉對(duì)美洲鰻鱺、羅非魚(yú)、鯉和鯽均有顯著促生長(zhǎng)作用。丁酸鈉的特殊氣味也對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有良好的誘食作用。而植物精油能誘導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物主動(dòng)進(jìn)食，促進(jìn)胃腸道興奮，提高生產(chǎn)性能與飼料利用率。在南美白對(duì)蝦飼料中添加0.02%的植物精油，能促進(jìn)對(duì)蝦采食，并且有效改善對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，維持腸道健康。Wigraiboon等發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥草油能夠促進(jìn)紅羅非魚(yú)生長(zhǎng)，同時(shí)有效提高魚(yú)肉的蛋白質(zhì)含量，降低脂質(zhì)含量，改善魚(yú)肉品質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在南美白對(duì)蝦飼料中添加丁酸鈉復(fù)合植物精油，能顯著提高對(duì)蝦增長(zhǎng)率、質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率，有效降低餌料系數(shù)，表明適量的丁酸鈉復(fù)合植物精油能夠促進(jìn)南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)。

3.2 丁酸鈉復(fù)合植物精油提高南美白對(duì)蝦存活率

丁酸鈉能促進(jìn)腸道黏膜上皮細(xì)胞增殖，修復(fù)受損黏膜，促進(jìn)腸絨毛增殖，增加隱窩深度，減少絨毛寬度，增強(qiáng)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。植物精油同樣可以改善腸道形態(tài)，選擇性抑制某些有害菌群，促進(jìn)有益菌群生長(zhǎng)，維持腸道系統(tǒng)穩(wěn)定。鄭瑞耕在鯉飼料中添加丁酸鈉，顯著改善了鯉腸黏膜上皮完整度，腸絨毛粗壯。孫浪在鯽基礎(chǔ)飼料中添加丁酸鈉，顯著提高了鯽前腸絨毛高度/隱窩深度的數(shù)值，有效促進(jìn)了腸道細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦存活率顯著高于對(duì)照組，表明丁酸鈉復(fù)合植物精油增強(qiáng)了南美白對(duì)蝦抵抗力。

3.3 丁酸鈉復(fù)合植物精油有效抑制南美白對(duì)蝦腸道內(nèi)有害菌

弧菌屬（）是一類菌體短小，略彎曲呈弧形，具有鞭毛的革蘭氏陰性菌，該菌能生存于海洋和河口環(huán)境中，廣泛存在于魚(yú)類、珊瑚、對(duì)蝦、浮游生物和哺乳動(dòng)物中。目前已知幾種弧菌對(duì)人類、魚(yú)類和海洋無(wú)脊椎動(dòng)物具有致病性，其中鰻弧菌（）是條件致病菌，可感染鮭魚(yú)、大菱鲆、鱸、虹鱒、香魚(yú)等并致其死亡，Lu等從患病青蟹中分離得到多種弧菌。有研究表明，在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加丁酸鈉能有效降低其腸道內(nèi)弧菌數(shù)。崔惠敬等發(fā)現(xiàn)富含芳香醛、芳香酚和檸檬醛的植物精油對(duì)大菱鲆弧菌具有良好抗菌作用。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的南美白對(duì)蝦的腸道總菌數(shù)無(wú)顯著變化，致病性弧菌則顯著減少，表明丁酸鈉復(fù)合植物精油能有效抑制腸道內(nèi)有害菌。

3.4 丁酸鈉復(fù)合植物精油能提升南美白對(duì)蝦非特異性免疫力

多項(xiàng)研究證明，丁酸鈉能促進(jìn)動(dòng)物免疫器官發(fā)育。在飼糧中添加植物精油可有效提高虹鱒血清中總補(bǔ)體含量和溶菌酶活性，植物精油還能通過(guò)增強(qiáng)抗氧功能提高動(dòng)物免疫力。區(qū)別于哺乳動(dòng)物，南美白對(duì)蝦這類甲殼動(dòng)物不具備特異性免疫，僅依賴于非特異性免疫來(lái)抵御病原體。南美白對(duì)蝦血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均是衡量對(duì)蝦非特異性免疫力的重要指標(biāo)。本研究中，試驗(yàn)組南美白對(duì)蝦的血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均顯著上調(diào)，表明丁酸鈉復(fù)合植物精油能顯著提高南美白對(duì)蝦的非特異性免疫力。

3.4.1 血淋巴細(xì)胞

作為甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)中最重要的部分，血淋巴細(xì)胞是發(fā)揮細(xì)胞免疫功能的主要物質(zhì)。血細(xì)胞的吞噬作用主要是吞噬外界病原及異物顆粒，血細(xì)胞通過(guò)表面受體識(shí)別異物，觸發(fā)由血淋巴細(xì)胞分泌的附著因子（如76 ku蛋白）介導(dǎo)的粘連，相互聚集成細(xì)胞團(tuán)，以清除異物。日本對(duì)蝦Rab基因已被證實(shí)可以作為一種胞內(nèi)病毒識(shí)別蛋白，增強(qiáng)宿主細(xì)胞吞噬功能。

3.4.2 酚氧化酶

酚氧化酶是體液免疫中主要的殺菌物質(zhì)之一，主要存在于顆?；虬腩w粒細(xì)胞中，有助于黑色素的形成。已知黑色素能抑制病原體蛋白與酶活性的發(fā)揮，參與黑化反應(yīng)，產(chǎn)生毒性醌殺滅病原，愈合傷口，也作為一種識(shí)別信號(hào)，誘導(dǎo)宿主防御系統(tǒng)中其他成分的產(chǎn)生，亦可作為調(diào)理素，影響細(xì)胞吞噬功能。

3.4.3 超氧化物歧化酶活性

甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞在發(fā)揮免疫機(jī)制的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，活性氧濃度過(guò)高則會(huì)損害機(jī)體健康。血細(xì)胞中的超氧化物歧化酶具有清除活性氧的作用，降低機(jī)體受損傷的可能性。其變化可作為動(dòng)物免疫狀態(tài)檢測(cè)指標(biāo)。

4 結(jié)論

綜上所述，在南美白對(duì)蝦飼料中添加適量丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑能夠有效促進(jìn)南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)，提高存活率，抑制致病菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)對(duì)蝦非特異性免疫力，從而提高南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。