周棋贏，張佳佳，趙 艷，胡雨桐，張瑞姣， 方志貞，李婭菲，馮迎春

(信陽師范學(xué)院 a. 生命科學(xué)學(xué)院/茶學(xué)與食品科技學(xué)院；b. 河南省茶樹生物學(xué)重點實室； c. 河南省茶葉精深加工工程技術(shù)研究中心；d. 大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用研究院; e. 國際教育學(xué)院，河南 信陽 464000)

0 引言

棉子糖合成酶(Raffinose synthase, RS)是催化肌醇半乳糖苷和蔗糖反應(yīng)合成棉子糖的蛋白，其編碼基因常以多基因家族的形式存在，在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用[1-2]。研究還發(fā)現(xiàn)RS基因的序列與其他棉子糖系列寡糖合成酶(Raffinose family of oligosaccharides，RFOs)基因以及堿性α-半乳糖苷酶(Alkalineα-Galactosidase，AGA)基因的序列都存在很高的相似性，因此常導(dǎo)致現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中對RS基因的注釋不準確。另外，棉子糖是植物特有的一種功能性低聚糖，是人體腸道中有益菌極好的營養(yǎng)源和有效的增殖因子，具有改善人體消化功能，整腸通便，促進人體對鈣的吸收，增強人體免疫力，對預(yù)防疾病和抗衰老都有明顯效果[3-5]。因此，開展棉子糖合成酶RS基因的鑒定和功能研究，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。對于植物的抗性育種、品質(zhì)改良、創(chuàng)建具有保健功能的植物種質(zhì)資源都具有重要意義。本文從棉子糖及其系列寡糖的合成，棉子糖合成酶的生化和序列特征，棉子糖合成酶在種子發(fā)育與萌發(fā)中的作用，棉子糖合成酶在逆境防御中的作用，棉子糖合成酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控五個方面進行了綜述，以期為植物棉子糖合成酶的鑒定及其調(diào)控機理的深入研究、利用生物工程技術(shù)進行棉子糖規(guī)?；a(chǎn)及進行植物的抗逆分子育種提供參考。

1 棉子糖及系列寡糖的合成

棉子糖合成酶(Raffinose synthase, RS)是棉子糖系列寡糖(Raffinose family of oligosaccharides，RFOs)合成途徑的重要組成部分，催化肌醇半乳糖苷和蔗糖合成棉子糖的生化反應(yīng)。由肌醇半乳糖苷提供半乳糖基供體合成棉子糖主要分為兩個步驟：第一步是肌醇半乳糖苷的生成，由肌醇半乳糖苷合成酶催化UDP-半乳糖和肌醇反應(yīng)生成肌醇半乳糖苷；第二步是由RS催化肌醇半乳糖苷提供的半乳糖基與蔗糖通過α-1, 6-糖苷鍵進行連接，生成棉子糖[2, 6-7]。RS參與植物RFOs的合成還包括下面兩個反應(yīng)：在水蘇糖合成酶的催化下，棉子糖接受肌醇半乳糖苷提供的半乳糖基轉(zhuǎn)變?yōu)樗K糖；在毛蕊花糖合成酶的催化下，水蘇糖接受肌醇半乳糖苷提供的半乳糖基轉(zhuǎn)變?yōu)槊锘ㄌ恰?/p>

2 棉子糖合成酶的生化和序列特征

20世紀70年代，RS首先在蠶豆的種子中得到分離，隨后在匍匐筋骨草，豌豆中都分離了RS[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們陸續(xù)在豌豆、黃瓜、水稻和擬南芥等植物中克隆得到了RS基因[6, 8]。研究表明，RS 為單體蛋白，純化的RS蛋白不穩(wěn)定，1 g/L的BSA和5 mmol/L DTT可以增加其穩(wěn)定性；其相對分子量在 80～100 kD之間，RS的最適pH值為6.0～8.0，最適溫度范圍為35～45 ℃[6, 9]。在黃瓜中，RS在pH7.0、38 ℃時酶活性最高，肌醇、N-乙基馬來酰、碘乙酰胺以及MnCl2、ZnCl2和NiCl2等對黃瓜RS的活性具有抑制作用[6]。豌豆RS的最適pH值為7.0，體外酶反應(yīng)底物測試分析顯示，豌豆RS還可以催化半乳糖基轉(zhuǎn)移到D-芒柄醇(D-ononitol)和D-松醇(D-pinitol)[6]。水稻中，RS在pH7.0、45 ℃時酶活性最高，Ag2+、 Hg2+、Zn2+等會抑制其活性，但Ca2+、Cu2+、Fe2+、 Mg2+、Mn2+、Ni2+、EDTA對其活性沒有影響；5 mmol/L DTT會顯著提高水稻RS的活性；水稻RS不僅能利用蔗糖還能利用lactose、4-β-galactobiose、N-acetyl-D-lactosamine、trehalose 和lacto- N- biose 作為半乳糖基的受體[9]。最近的研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，RS還具有水解肌醇半乳糖苷、棉子糖和p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside的酶學(xué)特征。

蛋白序列分析表明，RS都具有KXD、DDXW和RXXXD保守催化域，其中KXD中的天冬氨酸基團(D)可以作為親核基團與糖基形成一個共價鍵的糖基-酶中間體, 從而完成糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng), 而RXXXD結(jié)構(gòu)域中的天冬氨酸基團可以作為一個雙功能的酸堿催化基團發(fā)揮作用[7, 12]。最近在玉米中的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MXLGTEAXXLG 和 SGDPXGTXWLQGOHMVHC保守基序存在于所有RS中，對維持RS特異催化棉子糖的合成具有重要作用；而且玉米RS蛋白264位天冬氨酸(Asp)突變?yōu)楸彼?Ala)后，喪失了合成棉子糖的作用，但對肌醇半乳糖苷的水解活性增加近2倍[11]。大豆RS2位點中331位酪氨酸(Tyr)的插入突變或107位的錯義突變(Thr突變成為IIe)，會造成大豆中蔗糖的積累，而棉子糖和水蘇糖的含量減少[13]，表明這些位點對于維持RS催化棉子糖合成的活性具有重要作用。

研究[7, 14-15]發(fā)現(xiàn)RS基因的序列與其他RFOs合成酶基因的序列，特別是堿性α-半乳糖苷酶(Alkalineα- Galactosidase，AGA)基因的序列存在很高的序列相似性，常導(dǎo)致現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中RS基因注釋的不準確。在擬南芥基因組中注釋有6個AtRS基因，但酶活鑒定和表達分析表明，AtRS2基因?qū)嶋H上編碼一個堿性α-半乳糖苷酶，具有與RS完全不同的底物催化特異性[15-16]。AtRS5基因因為序列與堿性α-半乳糖苷酶編碼基因的序列很相似，被注釋為堿性α-半乳糖苷酶編碼基因，但實驗結(jié)果證明擬南芥AtRS5基因是一棉子糖合成酶基因，在體內(nèi)催化肌醇半乳糖苷和蔗糖合成棉子糖[14]。隨后研究[17]還發(fā)現(xiàn)，AtRS4基因編碼產(chǎn)物則呈現(xiàn)出多功能的酶學(xué)活性，不僅具有催化合成棉子糖的功能，同時還具有催化合成水蘇糖以及水解水蘇糖和肌醇半乳糖苷的半乳糖苷水解酶功能。生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，玉米基因組中有10個RS基因，進一步分析表明ZmRS4、5、6、7和8編碼蛋白與水蘇糖合成酶具有更近的親緣關(guān)系，為水蘇糖合成酶基因；ZmRS1、2、3、9 和10為棉子糖合成酶基因[18]。但ZHAO等[19]的實驗證明，ZmRS10實際上為堿性α-半乳糖苷酶編碼基因。最近，該課題組在玉米中的研究發(fā)現(xiàn)[11]，玉米RS基因在葉片和種子中具有不同的生化特性。在種子中玉米RS催化棉子糖的合成，而在葉片中玉米RS則催化肌醇半乳糖苷的水解。異源表達豌豆中的一個RS基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其編碼一個結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)上與半乳糖苷酶相似的轉(zhuǎn)糖苷酶[8]。

3 棉子糖合成酶在種子發(fā)育與萌發(fā)中的作用

RFOs是植物種子中主要的可溶性糖，在高等植物的種子中其含量能達到種子干質(zhì)量的16%，在種子的成熟和萌發(fā)過程中有重要作用[18, 20]。研究表明，由RS參與合成的RFOs在種子的所有部位都有合成，它們在胚胎發(fā)育晚期就有積累，之后從種子發(fā)芽開始并在種子成熟干燥期繼續(xù)積累，具有保護胚胎、延長種子壽命及提高后期種子萌發(fā)率的作用[2, 21]。在種子成熟和脫水干燥過程中，RS基因會被誘導(dǎo)大量表達，進而促進棉子糖快速積累；在種子萌發(fā)過程中，合成的棉子糖被α-半乳糖苷酶快速分解，進而為種子萌發(fā)提供能量和碳源[11, 20, 22]。大豆中GmRS2_A和GmRS2_B基因在種子成熟中期特異表達，對應(yīng)棉子糖主要在種子發(fā)育末期積累。沉默大豆GmRS2_A基因?qū)е路N子中棉子糖和水蘇糖含量的顯著降低[23]。小扁豆種子發(fā)育過程中RS和水蘇糖合成酶基因的表達量增加，促進了棉子糖等RFOs含量的增加[24]。擬南芥atrs4突變體中缺乏水蘇糖合成，但棉子糖含量顯著積累，能為種子萌發(fā)提供更多能量并增強其對環(huán)境的適應(yīng)性，atrs4突變體比野生型擬南芥萌發(fā)早；擬南芥AtRS4和AtRS5雙突變體的種子中完全喪失RFOs的積累，導(dǎo)致其萌發(fā)時間比比野生型擬南芥晚[20]。但對大豆的研究表明，由RS參與合成的RFOs在其種子萌發(fā)過程中不發(fā)揮重要作用[23]。LI等[7]的研究發(fā)現(xiàn)單、雙子葉植物中RS在調(diào)節(jié)種子活力方面具有不同的作用機制。與擬南芥等其他植物不同，玉米中只存在一個真正催化棉子糖合成的RS基因(ZmRS)，棉子糖是玉米種子存在的唯一RFOs；zmrs玉米突變體中沒有棉子糖的積累，種子活力明顯降低。在擬南芥中過表達玉米肌醇半乳糖合成酶基因和ZmRS基因顯著提高擬南芥種子中RFOs含量及其種子活力；過表達ZmRS基因顯著增加了擬南芥種子中棉子糖的含量，但肌醇半乳糖、水蘇糖和毛蕊花糖的含量降低，種子活力下降。他們的研究表明，擬南芥種子活力與RFOs總量、RFOs與蔗糖的比值有關(guān)。

4 棉子糖合成酶在逆境防御中的作用

RS在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用。RS參與催化合成的棉子糖系列寡糖(RFOs)參與了包括碳的存儲與轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜分選、RNA外運、維持膜的穩(wěn)定性、抗凍、抗旱以及響應(yīng)病原菌侵染和機械損傷等過程[2, 25]。擬南芥中超表達棉子糖系列寡糖合成酶會促進棉子糖的積累，從而會增加轉(zhuǎn)基因植株對蚜蟲的抗性[26]。GIL等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病毒侵染和高溫脅迫都會誘導(dǎo)黃瓜中RS基因的上調(diào)表達。

擬南芥基因組中有6個RS基因, 其中AtRS2、4、6受非生物脅迫和氧化脅迫誘導(dǎo)表達[16, 28]。研究發(fā)現(xiàn)[29]，非生物脅迫(低溫、干旱、高鹽、氧化脅迫和熱處理)都會誘導(dǎo)AtRS5基因的表達，AtRS5的T-DNA插入突變體中沒有棉子糖的積累，抗逆性消失。超量表達AtRS5基因除了能增加擬南芥種子的萌發(fā)率，還提高了其抗旱能力[30]。在干旱脅迫條件下，AtRS4和AtRS5基因雙重敲除的擬南芥植株會誘導(dǎo)AtRS6基因合成新的轉(zhuǎn)錄物，促進棉子糖的積累，增加植株的抗旱性[31]。RS通過提高種子對高溫、干旱的耐受性，增強了種子的活力和貯藏能力[8, 32]。轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫能誘導(dǎo)木本植物小桐子(JatrophacurcasL.) 中RS基因顯著上調(diào)表達[33]。王智等[12]克隆了復(fù)蘇植物旋蒴苣苔的RS基因(BhRFS)，進一步分析發(fā)現(xiàn)BhRFS的表達被干旱、低溫、高鹽和ABA誘導(dǎo)，表明BhRFS可能參與了多種非生物脅迫的抗性反應(yīng), 并受到ABA依賴的信號通路調(diào)控。喬夢等[22]在小麥中克隆了一個TaRS基因，研究表明，該基因的表達受到脫水、高溫、高鹽和低溫脅迫處理誘導(dǎo)。玉米ZmRS基因在葉和胚中特異性表達，在玉米幼苗中能夠被干旱、高溫、高鹽和冷脅迫誘導(dǎo)[11]。HAN等[32]在玉米中的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子DREB通過調(diào)節(jié)RS的表達，增加玉米中棉子糖的積累，從而增強了玉米的抗寒性。黃瓜RS基因的表達受低溫和ABA誘導(dǎo)，低溫環(huán)境下黃瓜中RS的活性和棉子糖含量都大大增加，并引起棉子糖在細胞質(zhì)，液泡和葉綠體中的積累[1, 34]。KITO等[17]在甜菜中克隆了兩個棉子糖合成酶基因BvRS1和BvRS2，研究表明BvRS1受低溫誘導(dǎo)，BvRS2受低溫和鹽脅迫誘導(dǎo)。葡萄中肌醇半乳糖苷合成酶基因和RS基因的上調(diào)表達促進了RFOs的積累，增強了其對低溫的耐受性[35]。代謝組的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，棉子糖合成途徑基因的表達和棉子糖等寡糖的積累，在冷馴化處理后增加葡萄的低溫抗性方面具有重要作用[36]。在冷馴化過程中，茶樹(Camelliasinensis)RS基因的表達會升高，說明棉子糖合成酶參與了茶樹抵御寒冷脅迫的過程[37]。CUI等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，棉花的共生菌黃萎病菌通過操控RS基因促進了棉子糖的積累，增強了棉花的抗鹽能力。百草枯(甲基紫精)處理擬南芥會增加RS基因的表達和棉子糖的合成，增加了擬南芥對氧化損傷的抵抗能力[28-29]。SINGH等[38]研究發(fā)現(xiàn)，RS是一種保護性分子，可以通過調(diào)控基因表達減少活性氧對人和小鼠神經(jīng)細胞中壓力脅迫。

5 棉子糖合成酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控下游基因表達過程中，引發(fā)生物體發(fā)生一系列生理和生化反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)生物發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性[39]。研究發(fā)現(xiàn)，黑暗環(huán)境下bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因AtPIF6在擬南芥AtRS4、 5基因雙突變體中顯著誘導(dǎo)表達，造成AtRS4、 5基因雙突變體種子的萌發(fā)延遲[20]。擬南芥中，過表達熱休克轉(zhuǎn)錄因子HsfA2會誘導(dǎo)AtRS2基因以及肌醇半乳糖合成酶基因AtGolS1、2 和4的大量表達，增加肌醇半乳糖苷和RS的積累，進而增加了轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力[28]。LANG等[40]的研究也發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達油菜熱休克轉(zhuǎn)錄因子BnHSFA4a促進了AtRS2基因的上調(diào)表達。實驗證實，一種WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在RS基因的啟動子區(qū)，誘導(dǎo)其表達進而促進棉子糖的合成[41]。在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，OsWRKY11基因的超表達提高了水稻RS基因和肌醇半乳糖苷合成酶基因的表達量，從而提高了水稻體內(nèi)棉子糖的含量，增強了水稻對于干旱脅迫的耐受能力[8, 42]。GU等[43]研究結(jié)果顯示，玉米原生質(zhì)體細胞受到熱激后熱激轉(zhuǎn)錄因子ZmHSFA2會激活RS基因和肌醇半乳糖苷酶基因的表達，增強玉米對熱脅迫的耐受性，而熱休克結(jié)合蛋白ZmHSBP2對ZmHSFA2具有拮抗作用，會抑制RS基因的表達，組織細胞對熱激的過度響應(yīng)。玉米RS表達還受到生物鐘、干旱和ABA調(diào)控，生物鐘核心元件ZmPRR抑制RS基因表達，干旱脅迫和ABA處理下，轉(zhuǎn)錄因子ZmHB會識別和結(jié)合玉米RS基因的啟動子區(qū)，解除ZmPRR對RS基因的抑制作用，促進玉米RS基因的表達[44]。玉米ZmDREB轉(zhuǎn)錄因子可以直接與玉米RS基因啟動子區(qū)的DRE元件結(jié)合，調(diào)控RS的表達，促進棉子糖在玉米種子中的積累。ZmDREB2A與RS因啟動子區(qū)的互作能延長種子保存時間、保持種子活力[45]; CBF(又名DREB1)是植物抗寒反應(yīng)途徑的重要調(diào)控因子[32，46]。HAN等[32]研究發(fā)現(xiàn)，ZmDREB1A轉(zhuǎn)錄因子通過與RS基因啟動子區(qū)相互作用，增強了玉米對冷脅迫的耐受性。在葡萄中，GARP/MYB類型的轉(zhuǎn)錄因子VaAQUILO通過上調(diào)肌醇半乳糖苷合成酶基因和RS基因的表達促進了RFOs的積累，進而增強了葡萄的低溫耐受性[35]。柑橘轉(zhuǎn)錄因子ERF108可以直接作用于RS基因啟動子，促進RS基因表達和棉子糖的合成，增強了柑橘對低溫的耐受性[47]。

6 展望

RS基因與其他棉子糖類寡糖合成酶基因(如水蘇糖合成酶基因)以及堿性α-半乳糖苷酶基因的序列很相似，常造成數(shù)據(jù)庫中RS基因注釋不準確。RS不僅具有合成棉子糖的生化功能，還具有水解棉子糖、肌醇半乳糖苷和對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的水解酶活性。目前植物中對RS進行酶活鑒定的研究還很少，還需要進一步研究。

RS合成的棉子糖在維持植物種子活力和萌發(fā)方面具有重要作用，在玉米和擬南芥中相關(guān)研究顯示，單、雙子葉植物在維持種子活力方面具有不同的調(diào)控機制。這一機制是否具有普遍性，還需要在更多植物中開展相關(guān)研究。不同物種的RS在生化和/或功能的特異性方面可能存在差別。

甜菜中BvRS1和BvRS2基因表達受不同逆境因子誘導(dǎo)并具有不同的逆境響應(yīng)模式，這些差異性是如何形成的，還未見報道。玉米中ZmRS在葉片和種子中通過催化不同的生化反應(yīng)參與植物的抗旱性，這一過程在轉(zhuǎn)錄水平上是如何協(xié)調(diào)和調(diào)控的，還需要進一步研究。不同物種中調(diào)控RS基因表達的上游調(diào)控因子不同，這些差異性是如何形成的，其上游信號是如何感知和傳遞的，不同轉(zhuǎn)錄因子之間是如何互作調(diào)控基因表達的，還知之甚少。開展RS的鑒定和功能機理研究，對于延長種子資源保藏時間和植物抗逆育種，增強植物的環(huán)境適應(yīng)能力都具有重要意義。