溫冬灼，張 智，魏 罡，張曉彤

（東北林業(yè)大學(xué) a.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

植物細(xì)胞壁的主要組成成分是纖維素，是一種通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接的葡萄糖聚合物，是地球上產(chǎn)量和含量最為豐富的生物資源[1]。纖維素通過(guò)生物轉(zhuǎn)化可以轉(zhuǎn)化為多種產(chǎn)品，并且在許多行業(yè)中都需要，例如動(dòng)物飼料，生物燃料，食品，洗滌劑，肥料，造紙，制藥，紡織和廢物管理。真菌在具有降解纖維素能力的微生物中活性相對(duì)最強(qiáng)。但由于其生長(zhǎng)緩慢、相關(guān)酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜、熱穩(wěn)定性差、不耐堿性等缺點(diǎn)限制了其工業(yè)發(fā)展，而細(xì)菌具有來(lái)源廣、種類多、生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn)，能在各種極端環(huán)境中生存，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)并顯示出潛在的應(yīng)用前景[2]，同時(shí)細(xì)菌降解纖維素的研究在國(guó)內(nèi)外尚處于起步階段[3]。

纖維素酶是一種糖基水解酶，包含內(nèi)切β-葡聚糖酶，外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[4]。不同纖維素水解酶對(duì)纖維素的降解表現(xiàn)出了不同的活性，且纖維素的完全水解需要這幾種酶共同協(xié)作。纖維素酶催化纖維素水解生成可生物利用的還原糖。在纖維素糖化中，通過(guò)內(nèi)切葡聚糖酶的作用，對(duì)內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵進(jìn)行切割，得以釋放包含自由還原端和非還原端的小纖維顆粒。隨后鏈的自由端被外切葡聚糖酶作用得以釋放纖維二糖，最終葡萄糖苷酶作用纖維二糖釋放出葡萄糖作為最終產(chǎn)物[5]。纖維素分解酶大多數(shù)來(lái)源于微生物，其酶活性和穩(wěn)定性具有一定差異。微生物種類多樣，有厭氧的、好氧的、嗜熱的或嗜溫的，其中許多細(xì)菌都可產(chǎn)生纖維素酶[6]。微生物發(fā)酵法降解纖維素相較于物理化學(xué)法，具有無(wú)污染且經(jīng)濟(jì)高效的優(yōu)點(diǎn)。因此，新纖維素酶生產(chǎn)，可在微生物發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行分離和鑒定。

關(guān)于產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選，國(guó)內(nèi)外已有從動(dòng)物消化系統(tǒng)、糞便及秸稈中篩選獲得芽孢桿菌菌株的研究。錢娟娟等[7]通過(guò)紫外誘變技術(shù)的方法，通過(guò)篩選后得到較未誘變菌株酶活提高2.37倍的芽孢桿菌菌株。通過(guò)對(duì)扎龍濕地土壤的研究中，鄭國(guó)香等[8]以富集限制性培養(yǎng)技術(shù)，篩選出降解纖維素的耐低溫菌株，該菌株特點(diǎn)能夠在低溫環(huán)境中產(chǎn)生較高纖維素酶。劉心吾等[9]通過(guò)在溫泉地區(qū)土壤樣品中篩選出了耐高溫且具有較高木質(zhì)纖維素酶活性的菌株。因此，本試驗(yàn)擬從沼氣發(fā)酵池中篩選高產(chǎn)纖維素降解菌，并對(duì)該纖維素降解菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，為開發(fā)工業(yè)化生產(chǎn)高產(chǎn)纖維素酶菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源和采集

本試驗(yàn)采用沼氣發(fā)酵罐中的沼氣發(fā)酵液樣品。采集時(shí)在無(wú)菌操作環(huán)境下采用取樣器取樣，余樣在4℃下保存。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：CMC—Na 1 g，酵母粉1 g，磷酸二氫鉀0.1 g，硫酸鎂0.03 g，氯化鈉1 g，蒸餾水100 mL。121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，牛肉膏1 g，酵母粉0.5 g，葡萄糖0.5 g，氯化鈉0.5 g，蒸餾水100 mL，pH 值7.0，121℃滅菌20 min。

純化培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，硝酸銨1 g，蛋白胨1 g，氯化鈉0.1 g，CMC—Na 15 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

剛果紅鑒別培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1.0 g，氯化鈉0.5 g，硫酸銨2.0 g，硫酸鎂0.5 g，CMC—Na 20 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨3 g，酵母浸粉0.5 g，硫酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀4 g，氯化鈉0.3 g，硫酸鎂0.3 g，CMC—Na 20 g，蒸餾水1 000 mL。121℃滅菌20 min[10]。

1.3 纖維素降解菌的篩選

1.3.1 富集培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上，在裝有玻璃珠的100 mL 無(wú)菌水中加入5 mL 沼氣發(fā)酵罐樣品，振蕩30 min混勻，得到菌懸液[11]。取1 mL 菌懸液接入20 mL富集培養(yǎng)基中，在36℃、160 r/min 恒溫振蕩器中富集培養(yǎng)36 h。

1.3.2 初篩

參考采用張智等[12]的初篩方法，結(jié)合實(shí)際情況對(duì)方法進(jìn)行略微調(diào)整，將富集培養(yǎng)后的沼氣發(fā)酵混合菌液以10 倍濃度進(jìn)行稀釋，各吸取5 個(gè)不同梯度的菌懸液100 μL，分別涂布至剛果紅鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，并設(shè)置3 組對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行比較，倒置放入36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生透明圈。選取菌樣時(shí)需挑取有明顯透明圈的菌株。計(jì)算測(cè)量培養(yǎng)基中菌落透明圈直徑（D，cm）與菌落直徑（d，cm）比值（D/d），選取比值較大的菌株，劃線并純化4～5 代后測(cè)定纖維素酶活力并保存[13]。

1.3.3 復(fù)篩

將通過(guò)初步篩選獲得的菌株接種到20 mL 種子培養(yǎng)基中，并在36℃，160 r/min 下培養(yǎng)18 h 以制備種子液。通過(guò)在200 mL 的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基內(nèi)加入3%接種量的種子液在36℃，160 r/min 培養(yǎng)24 h，于4℃，5 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液測(cè)定酶活[14]。

濾紙酶活測(cè)定方法[15]：在每個(gè)離心管中加入5 mL 從樣品中提取的發(fā)酵液。放入離心機(jī)內(nèi)以5 000 r/min 運(yùn)行10 min，得到上清液即為試驗(yàn)所需粗酶液。在粗酶液中，提取0.5 mL 來(lái)測(cè)定纖維素酶活力，并以新華濾紙50 mg 作為底物，并置于4 支20 mL 具塞試管中，同時(shí)在4 支試管內(nèi)分別加入酶液0.5 mL 和檸檬酸緩沖液1.5 mL。在其中一個(gè)試管內(nèi)加入1.5 mL DNS 試劑作為對(duì)照組。把4 支試管在50℃進(jìn)行水浴預(yù)熱，10 min 后加入50 mg 濾紙，并于該溫度下反應(yīng)60 min，取出樣品后在每個(gè)樣品內(nèi)立即加入2.0 mL DNS 試劑，再次置于100℃水浴進(jìn)行5 min 的反應(yīng)，取出后待冷卻，定容至15 mL，并通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)出每個(gè)樣品的吸光度。測(cè)得的OD 值，通過(guò)繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，并將OD 值換算成葡萄糖濃度。每小時(shí)底物產(chǎn)生1 μmoL 葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位（U）FPA 公式如下：

式中：G為葡萄糖含量；V：定容體積；t：反應(yīng)時(shí)間；A：加酶量；B：底物質(zhì)量；5.56 為1 mg 葡萄糖底物質(zhì)的量（μmol）[15]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定[16]：分別吸取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 和1.5 mL 置于比色管中，用蒸餾水補(bǔ)充至1.5 mL，再加2 mL DNS 試劑，充分混合后在沸水中煮沸5 min。冷卻定容至15 mL。用分光光度儀于540 nm處測(cè)OD 值。以葡萄糖的含量（mg）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合回歸方程。

1.4 細(xì)菌種類鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生化表征

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株的生理生化特性進(jìn)行描述，對(duì)分離菌株中具有最佳產(chǎn)酶潛力的菌株進(jìn)行酶生產(chǎn)，并觀察復(fù)篩出的產(chǎn)纖維素酶菌株單菌落顏色、質(zhì)地、形態(tài)、隆起形狀和透明度等。

1.4.2 16S rDNA 序列分析

利用微生物16S rDNA 通用引物對(duì)提取菌株基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司對(duì)PCR 產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上做BLAST 序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹利用MEGA 7.0 軟件，從而確定菌株間的親緣關(guān)系。

1.5 優(yōu)化菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基

1.5.1 單因素優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高菌株的酶活性，根據(jù)單因素分析改變碳源（羧甲基纖維素鈉0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%），氮源（蛋白胨0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%），磷酸二氫鉀（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、硫酸鎂（0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%）4 個(gè)單因素對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響。

1.5.2 正交試驗(yàn)

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別選取羧甲基纖維素鈉含量（H）、蛋白胨含量（I），磷酸二氫鉀含量（J）及硫酸鎂含量（K）為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采取L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化菌株發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[17]。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing fermentation medium for enzyme production %

1.6 優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件

1.6.1 單因素優(yōu)化

分析菌株在液體發(fā)酵條件下產(chǎn)纖維素酶的影響因素，在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，比較發(fā)酵時(shí)間（18、24、30、36、42 h）、初始pH 值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、接種量（2%、3%、4%、5%、6%）、培養(yǎng)溫度（28、32、36、40、44℃）4 個(gè)單因素對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響。

1.6.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別選取接種量（A）、初始pH（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）、培養(yǎng)溫度（D）作為考察因素，應(yīng)用4 因素3 水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以濾紙酶活力為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化[18]。將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件統(tǒng)計(jì)，采用Origin 8.5 軟件作圖，顯著性分析采用SPSS 19.0 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 菌株初篩

樣品通過(guò)富集培養(yǎng)后，再經(jīng)過(guò)剛果紅平板染色法進(jìn)行初篩。在剛果紅纖維素篩選平板中觀察到菌株有明顯的透明圈，將上述菌株進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，分別將透明圈直徑與菌落直徑相比數(shù)值較大的菌株命名為W1、W2、W3（圖1）。從圖1 可以看出：3 株菌落周圍都可以觀察到有較為清晰的透明圈，進(jìn)一步說(shuō)明這3 株菌在一定程度上都具有分解羧甲基纖維素的能力；菌株W2 菌落直徑大于其他2 株，說(shuō)明該菌株在剛果紅纖維素篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好。纖維素酶活的高低可以通過(guò)D/d比值直接反映，D/d比值越大說(shuō)明纖維素降解能力越強(qiáng)，3 株菌的D/d值如表2所示。菌株W2 的D/d為明顯高于其他兩株菌，通過(guò)纖維素酶活的測(cè)定可進(jìn)一步驗(yàn)證W2 纖維素降解能力。

圖1 菌株W1～W3 在剛果紅平板上透明圈Fig.1 Transparent circles of strain W1-W3 on Congo red plate

表2 D/d 和纖維素酶測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of D/d and cellulase determination

2.1.2 菌株復(fù)篩

將菌種接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，收集上清粗酶液，檢測(cè)濾紙酶活大小從而進(jìn)一步篩選。以葡萄糖的含量（mg）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合回歸方程（圖2）。其中擬合系數(shù)R2=0.9973 ＞0.95，證明OD540nm與葡萄糖濃度的線性關(guān)系可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Glucose standard curve

2.2 菌株生理生化特征及16S rDNA 測(cè)序分析

如圖3所示，W2 菌株在種子培養(yǎng)基上呈乳白色，其特征為表面光滑無(wú)褶皺，邊緣整齊圓潤(rùn)，并伴隨著微小凸起；進(jìn)一步對(duì)W2 菌株進(jìn)行生理生化特征測(cè)定，結(jié)果得出，W2 菌株進(jìn)行芽孢染色后，對(duì)氧化酶和V-P 試驗(yàn)的反應(yīng)均呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)甲基紅、吲哚和硫化氫的反應(yīng)為陰性；通過(guò)對(duì)果糖、羧甲基纖維素鈉和可利用淀粉進(jìn)行初步判斷后，對(duì)W2 菌株進(jìn)行初步判定得出該菌株為芽孢桿菌或芽孢桿菌的變種（表3）。16S DNA 測(cè)試分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of W-2 strain based on the 16S rDNA sequences

表3 菌株W2 生理生化特征?Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain W2

圖3 菌株菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of the strain

2.3 優(yōu)化菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基

2.3.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，硫酸鎂含量、蛋白胨含量、磷酸二氫鉀含量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶影響較大，羧甲基纖維素鈉含量對(duì)其影響相對(duì)較小。由圖5 可知，隨著氮源（蛋白胨）含量的增加濾紙酶活不斷提高，適量濃度的氮源添加可以促進(jìn)厭氧發(fā)酵體系中纖維素等物料的水解。蛋白胨含量為0.60%時(shí)，菌株濾紙酶活達(dá)到80.85 U/mL。繼續(xù)添加氮源會(huì)抑制纖維素水解和甲烷生成。因此選擇氮源（蛋白胨）含量0.60%作為最適氮源。在硫酸鎂含量為0.05%時(shí)，菌株濾紙酶活達(dá)到84.96 U/mL，因此，選擇硫酸鎂含量0.05%作為最適含量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。在磷酸二氫鉀含量為0.2%時(shí)，菌株濾紙酶活達(dá)到70.14 U/mL。因此，選擇磷酸二氫鉀含量0.2%作為最適含量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。當(dāng)碳源（CMC—Na）含量為0.75%時(shí)菌株的濾紙酶活性達(dá)到68.15 U/mL。因此，選擇碳源（CMC—Na）含量0.75%作為最適碳源含量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The results of single-factor experiment

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)單因素進(jìn)行優(yōu)化后得出，以W2 菌株為目的菌株，濾紙酶活作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)羧甲基纖維素鈉含量（H）、蛋白胨（I），磷酸二氫鉀（J）及硫酸鎂（K）4 個(gè)因素為考察，正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4 可知，4 個(gè)因素對(duì)濾紙酶活的影響依次為硫酸鎂含量＞蛋白胨含量＞磷酸二氫鉀含量＞羧甲基纖維素含量。

F檢驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，4 個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響都不顯著，究其原因，可能是本試驗(yàn)誤差大且誤差自由度?。▋H為2），使檢驗(yàn)的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。由于各因素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響都不顯著，不必再進(jìn)行各因素水平間的多重比較，此時(shí)可從表4 中選擇平均數(shù)大的水平H2I2J2K2組合成最優(yōu)產(chǎn)酶組合。

表4 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for optimizing fermentation medium for enzyme production

表5 正交試驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of the orthogonal experiment

2.3.3 最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基及驗(yàn)證

進(jìn)行極差分析后，最優(yōu)組合條件H2I2J2K2并沒有出現(xiàn)在正交表中，因此，通過(guò)對(duì)正交表中的最高組合H1I2J2K2進(jìn)行比較后得出，當(dāng)羧甲基纖維素含量0.75%，蛋白胨含量0.6%，磷酸二氫鉀含量0.2%，硫酸鎂含量0.05%時(shí)，即為最優(yōu)組合條件。通過(guò)極差分析后，組合H2I2J2K2活性相對(duì)正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組H1I2J2K2略高，濾紙酶活達(dá)到85.54 U/mL，但是其差異并不顯著。通過(guò)上述分析可知，該菌株的最優(yōu)發(fā)酵酶培養(yǎng)基為羧甲基纖維素含量0.75%，蛋白胨含量0.6%，磷酸二氫鉀含量0.2%，硫酸鎂含量0.05%。

2.4 優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件

2.4.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶影響較大的因素為初始pH 值、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度，接種量對(duì)其影響相對(duì)較小，發(fā)酵時(shí)間不斷地延長(zhǎng)，相對(duì)應(yīng)的纖維素酶活也隨之逐漸升高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到24 h 時(shí)，濾紙酶活達(dá)到最高79.01 U/mL；24 h 之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，濾紙酶活基本穩(wěn)定不再升高。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，濾紙酶活隨溫度的升高而升高，濾紙酶活在36℃時(shí)達(dá)到最大值，36℃以上濾紙酶活隨溫度的升高而顯著降低。溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累有影響，如果培養(yǎng)溫度在一定范圍內(nèi)，微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成在一定程度上取決于微生物的生長(zhǎng)，但是如果溫度過(guò)高，會(huì)影響酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，從而抑制代謝物的合成[15]。接種量為4%時(shí)菌種可很好地保持高度活性，濾紙酶活達(dá)到89.5 U/mL。pH 值對(duì)菌體產(chǎn)纖維素酶的影響如圖所示?？梢钥闯觯寒?dāng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基在pH 值為5.5～7.0時(shí)，濾紙酶活性上升；而當(dāng)pH 值達(dá)到7.0 后，濾紙酶活性達(dá)到峰值，其值為98.02 U/mL；而當(dāng)pH值呈現(xiàn)弱堿性，其范圍為7.0～7.5 之間時(shí)，濾紙酶活性明顯下降。

圖6 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The results of single-factor experiment

2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到時(shí)間和溫度位于試驗(yàn)設(shè)計(jì)中心水平對(duì)濾紙酶活（Y）對(duì)接種量（A）、初始pH 值（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）、溫度（D）的二次回歸方程：

Y=98.26+3.96A-6.82B-3.15C-1.47D+5.08AB+1.33AC-0.82AD-0.46BC-5.86BD+3.3CD-5.63A2-14.41B2-14.35C2-14.88D2,P＜0.01，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平；

該模型的擬合系數(shù)的R2值為0.935 1，擬合程度較好，能夠準(zhǔn)確響應(yīng)93.51%的響應(yīng)值的變化，并基于此預(yù)測(cè)對(duì)濾紙酶活的影響，基于該模型建立的優(yōu)化過(guò)程和結(jié)果如表6所示。

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 6 Central combination experiment matrix and results

通過(guò)響應(yīng)面建立的回歸模型效果如表7所示。分析可知，該模型的回歸效果顯著，線性關(guān)系也較為準(zhǔn)確（P＜0.000 1），能夠充分對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合（R2=0.935 1），并準(zhǔn)確對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝進(jìn)行最優(yōu)評(píng)估。由表中F值可判斷各因素對(duì)響應(yīng)值得影響，結(jié)果顯示：初始pH 值（B）＞接種量（A）＞培養(yǎng)時(shí)間（C）＞培養(yǎng)溫度（D）。C、AB、BD的P值均＜0.05，其中B、D、AD、BD對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶活含量的影響顯著（P＜0.05），B、A2、B2、C2、D2對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶活的影響高度顯著（P＜0.01）。

表7 回歸模型的方差分析?Table 7 Variance analysis of regression model

續(xù)圖7Continuation of Fig.7

表6 顯示BC＞AD＞AC＞CD＞AB＞BD，比較P值可知初始pH 值與培養(yǎng)溫度的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶活含量干擾最小，而初始pH 值與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶活干擾最大?；诮臃N量、初始pH 值、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度4 個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的交互作用，得出三維響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果如圖7所示。響應(yīng)面斜率越陡，輪廓線越接近橢圓，說(shuō)明雙因素相互作用越顯著，BC 曲面拱形明顯更陡峭且等高線為橢圓形，其次是AD、BD和CD，這說(shuō)明初始pH值與培養(yǎng)時(shí)間交互作用最為顯著（P＜0.01），而且，初始pH 值和培養(yǎng)溫度之間的關(guān)系顯著，同時(shí)培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度之間的關(guān)系顯著（P＜0.05）。通過(guò)圖7 可知，AB和AC曲面形狀變化不是十分明顯，等高線部分變化趨勢(shì)較為平滑。這說(shuō)明了接種量和初始pH 值之間的交互作用不顯著，同時(shí)也說(shuō)明了接種量和培養(yǎng)時(shí)間之間的交互作用不顯著（P＞0.05），同時(shí)驗(yàn)證了方差分析結(jié)果。

圖7 不同產(chǎn)酶條件對(duì)菌株濾紙酶活的影響等高線圖（左）和響應(yīng)面圖（右）Fig.7 Contour map(left)and response surface graph(right)of the effect of different enzyme production conditions on the filter paper enzyme activity

2.4.3 最佳工藝參數(shù)及驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件分析確定菌種發(fā)酵產(chǎn)酶最佳工藝條件為：接種量4.29%，初始pH 值為6.91，培養(yǎng)時(shí)間23.39 h，培養(yǎng)溫度35.87℃，在此優(yōu)化條件下菌株濾紙酶活含量可達(dá)99.57 U/mL。結(jié)合實(shí)際將該工藝優(yōu)化為接種量4%，初始pH 值為7.0，培養(yǎng)時(shí)間24 h，培養(yǎng)溫度36℃。并基于此工藝優(yōu)化條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證對(duì)照試驗(yàn)，菌株濾紙酶活可達(dá)到99.08 U/mL，與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的模型參數(shù)具有可靠性。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，微生物法降解纖維素相較于傳統(tǒng)的物理化學(xué)法降解纖維素，已經(jīng)成為經(jīng)濟(jì)高效的替代品，其中細(xì)菌菌株對(duì)惡劣的工業(yè)條件更具耐受性，顯示出潛在的應(yīng)用前景。自然環(huán)境中纖維素降解微生物群體較為復(fù)雜，眾多研究者從中分離出許多好氧的，厭氧的，嗜溫的或嗜熱的菌株[6]，并研究了纖維素酶的生產(chǎn)。孫思琦等[20]對(duì)森林地表可燃物中的能夠降解木質(zhì)素的菌株進(jìn)行篩選，結(jié)果表明混合菌液較單一菌液降解木質(zhì)素效果更好。江高飛等[21]在高溫（55～75℃）堆肥中篩選出高效降解纖維素的短小芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌。宋麗麗等[22]從白酒酒糟中篩選獲得產(chǎn)纖維素酶的巨大芽孢桿菌，其酶活力36.73 U/mL。

國(guó)內(nèi)外細(xì)菌降解纖維素的研究尚處于起步階段，已證實(shí)一些細(xì)菌菌株具有高效降解纖維素的能力，并對(duì)相應(yīng)的降解機(jī)理及纖維素酶特性進(jìn)行了研究。潘知樂等[23]通過(guò)秸稈焚燒帶來(lái)的環(huán)境問題對(duì)纖維素降解菌的篩選進(jìn)行了綜述，分析了纖維素酶降解機(jī)理的4 種協(xié)同作用，并分析了在基因水平上其可能的機(jī)理。本研究從沼氣發(fā)酵液中分離出生產(chǎn)纖維素酶的有效菌株，多數(shù)菌株初始產(chǎn)纖維素酶活力40～65 U/mL 之間，菌株W2 的濾紙酶活達(dá)到61.5 U/mL，明顯高于李正鳳等[24]篩選出的放線菌的濾紙酶活能力（濾紙酶活達(dá)16.9 U/mL，外切酶酶活達(dá)39.62 U/mL）。在本研究中，通過(guò)單因素分析方法對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中硫酸鎂含量、蛋白胨含量、磷酸二氫鉀含量、羧甲基纖維素鈉含量進(jìn)行優(yōu)化。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫酸鎂含量、蛋白胨含量、磷酸二氫鉀含量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶影響較大，羧甲基纖維素鈉含量對(duì)其影響相對(duì)較小。潘知樂等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CMC 可改善菌株生長(zhǎng)和纖維素酶的產(chǎn)生，因此，可以認(rèn)為CMC 是纖維素酶生產(chǎn)的積極誘導(dǎo)劑，強(qiáng)調(diào)了CMC 通常會(huì)誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生并充當(dāng)內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)的首選底物。在本研究中，蛋白胨存在下，CMC ＞0.3%的濃度對(duì)酶活性有負(fù)面影響，而濃度為0.3%的硫酸鎂則增強(qiáng)了纖維素酶的活性。這證明了養(yǎng)分在培養(yǎng)基中的重要性，這些結(jié)果與Sonia 等[27]關(guān)于不同細(xì)菌菌株研究結(jié)果相反，可能與不同菌株對(duì)底物的不同吸附性有關(guān)。進(jìn)行正交試驗(yàn)，選擇蛋白胨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂和CMC 作為獨(dú)立變量以提高纖維素酶的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化條件下的最大產(chǎn)量是優(yōu)化之前的約1.38 倍，濾紙酶活達(dá)到85.54 U/mL，明顯高于邵帥等[28]篩選出的土曲霉優(yōu)化后的濾紙酶活能力（濾紙酶活27.80 IU，較未優(yōu)化前提高了1.09 倍）。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用BBD 優(yōu)化纖維素降解菌產(chǎn)酶工藝的最佳工藝參數(shù)，進(jìn)行了由RSM 評(píng)估后提供的4 個(gè)獨(dú)立產(chǎn)酶條件變量的最佳條件的試驗(yàn)[29]，并比較了結(jié)果。該模型的擬合系數(shù)的R2值為0.935 1，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的和實(shí)際的酶活性非常接近，因此證明了該模型的有效性。以獲得最大的纖維素酶產(chǎn)量，比未優(yōu)化前提高約1.6 倍，高于毛婷等[13]篩選的枯草芽孢桿菌的濾紙酶活能力（濾紙酶活98 U/mL，較未優(yōu)化前提高了1.1 倍）。該研究未來(lái)的研究方向包括對(duì)游離和固定化酶的分子表征，純化和動(dòng)力學(xué)研究。菌株穩(wěn)定性強(qiáng)，適應(yīng)性好，具有開發(fā)成為工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶的微生物潛力，建議進(jìn)一步研究纖維素酶的生產(chǎn)，有利于其在工業(yè)水平應(yīng)用。

本試驗(yàn)分離出產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌具有良好的產(chǎn)纖維素酶能力，通過(guò)16S rDNA 基因序列同源性驗(yàn)證后，該菌株為解淀粉芽孢桿菌。通過(guò)模型驗(yàn)證等方法得出，該菌株的最優(yōu)產(chǎn)酶條件是：接種量4%，初始pH 值為7.0，培養(yǎng)時(shí)間24 h，培養(yǎng)溫度36℃。通過(guò)對(duì)菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化后其濾紙酶活達(dá)到98.49 U/mL，與優(yōu)化前相比提高了約1.6 倍。