胡迎峰，夏齊平

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖 241000)

0 引言

黃山玉蘭(Yulania cylindrica)系木蘭科木蘭屬落葉喬木，廣泛分布于華東、華中等地[1]?；ㄆ跒?—5月，且?guī)в械姆枷?，因此廣受歡迎，是優(yōu)良的園林觀賞樹種，其花蕾可作藥用，木材珍貴，已被列為三級瀕危植物，花粉是該物種的重要種質(zhì)形式之一[2]。目前，有關(guān)黃山玉蘭的研究主要側(cè)重于群落結(jié)構(gòu)、種群特征[3]及形態(tài)結(jié)構(gòu)[4]等，對繁殖系統(tǒng)相關(guān)研究僅見俞芹等[5]對花粉萌發(fā)特性的初步報道，且未對培養(yǎng)條件進行探索。

花粉活力是指花粉存活、生長、萌發(fā)、或者發(fā)育的能力，其活力直接影響到育種的成敗，也是花粉質(zhì)量的重要指標之一，準確的判定花粉活力是雜交育種工作順利開展的基本條件之一[5-6]。常見花粉活力測定方法包括TTC染色法、MTT染色法、I2-KI染色法、FDA熒光染色法、醋酸洋紅染色法、離體培養(yǎng)法等[7-9]。其中TTC和MTT染色法借助線粒體呼吸作用產(chǎn)物檢測活性[10-11]；I2-KI染色法受淀粉含量影響較大，缺乏對細胞活性的檢測能力[12]；FDA熒光染色法常用于跟蹤測定花粉活力[13]；醋酸洋紅染色法借助染色體染色，對死亡細胞不敏感[14]。各類染色法操作簡便，但離體培養(yǎng)法在復(fù)雜操作的基礎(chǔ)上，可以更真實的反應(yīng)花粉活力[15-16]。因此，不同物種需要通過各類條件的摸索選擇最合適的方法。陳景震等[17]用美國梾木(Cornus spp.)不同開花時期花粉活力探究活力下降原因。聶超仁[18]和陳瑋婷等[19]對鐘花櫻桃(Cerasus campanulate)和6個非洲菊品種分別進行離體萌發(fā)實驗，發(fā)現(xiàn)不同物種花粉所需的離體培養(yǎng)條件存在較大差異。為此，本研究選用MTT法[20]（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）、TTC法[21]（氯化三苯基四氮唑）、醋酸洋紅染色法[22]分別測定黃山玉蘭自然盛開、室內(nèi)水培盛開、室內(nèi)培養(yǎng)萎蔫時的花粉活力，并以適當(dāng)濃度的蔗糖和硼酸對花粉進行離體培養(yǎng)[23-25]。期望為科學(xué)解決不同花粉活力測定方法應(yīng)用效果的區(qū)別提供借鑒，并進一步減少花粉離體培養(yǎng)過程的盲目性。

1 材料與方法

1.1 花粉采集

實驗采摘安徽師范大學(xué)赭山校區(qū)校園內(nèi)正在盛開的黃山玉蘭，要求采摘花藥開裂的個體，且自然散粉。將花整體采摘后，做上標記小心放置，避免花粉損失過多。同時采摘部分盛開的，但花藥并未開裂、未散粉的黃山玉蘭，置于盛有蒸餾水的燒杯中水培，待花藥開裂時，及時收集花粉。最后，待花萎蔫時再收集一次花粉。避免雨天采摘花朵，防止雨水對花粉活力造成影響，試驗于2020年6月—2021年5月在安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進行。

1.2 試劑配制

稱取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養(yǎng)基中，配制0.5%的MTT溶液。用0.22 μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存。用pH 7.0的磷酸緩沖溶液和2,3,5-氯化三苯基四氮唑粉劑配制成0.5%的TTC溶液[25]。取45 mL冰醋酸，加蒸餾水55 mL，煮沸后徐徐加入洋紅10 g，攪拌均勻后加入1顆鐵銹釘，煮沸10 min，冷卻后過濾，配制10%的醋酸洋紅溶液，貯存在棕色瓶內(nèi)備用。

1.3 不同方法花粉活力測定

1.3.1 MTT染色法 取20 μL的MTT溶液滴于載玻片上，用鑷子或解剖針從花藥上挑取適量的花粉放于載玻片上的MTT試劑中，混勻，并靜置10 min，制成裝片于光學(xué)顯微鏡下觀察。隨機選取3個視野進行計數(shù)，被染成紫色的即是有活性的，紫色越深，活性越大；反之，則無活性。

1.3.2 TTC染色法 取100 μL的TTC溶液滴加至2 mL的標號的PE管中，用鑷子或者解剖針從花藥上挑取適量的花粉放入PE管中的TTC試劑中，混勻，然后將PE管放置于37℃水浴鍋中靜置30 min。然后吸20 μL制作成裝片于光學(xué)顯微鏡下觀察。隨機選取3個視野進行計數(shù)，其中被染成紅色的即是有活性的，反之，沒有活性[26-27]。

1.3.3 醋酸洋紅染色法 取20 μL的醋酸洋紅試劑于載玻片上，用鑷子或者解剖針從花藥上挑取適量的花粉于載玻片上的醋酸洋紅試劑中，混勻，靜置5 min，蓋上蓋玻片制成臨時裝片，并用吸水紙或者紙巾從一端吸取多余的醋酸洋紅。若肉眼觀察下載玻片顏色較深，可以在蓋玻片邊沿滴加適當(dāng)?shù)恼麴s水，并于另外一側(cè)吸干。在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機選取3個視野進行計數(shù)，被染成紅色的即是有活性的，反之，沒著色的或者淡紅色的，即無活性。

1.4 花粉離體培養(yǎng)

分別配制40%的蔗糖溶液，0.2%的硼酸溶液，并設(shè)置9個溶液體系[28（]如表1所示）。用鑷子或解剖針從樹上盛開且自然散粉的花藥上面挑取適量的花粉放入溶液體系中，輕輕混勻，置于黑暗處靜置36 h后，吸取50 μL制成裝片并用1%的番紅染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

表1 9個不同濃度體系設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 活力測定結(jié)果

TTC染色法相比MTT染色法、醋酸洋紅染色法更為復(fù)雜，需要水浴加熱，且TTC染色法受限于花粉壁的薄厚情況[13]，以及花粉內(nèi)的各種酶活性和花粉外壁的組成物質(zhì)。所測得樹上盛開自然散粉的花粉活力為54.82%，室內(nèi)培養(yǎng)使散粉的花粉活力是51.11%，室內(nèi)培養(yǎng)萎蔫的花花粉活力是12.63%（如圖1），所測得的結(jié)果普遍偏低（如圖1），且花粉著色穩(wěn)定性差（如圖2A）。

圖1 3種方法測定3種狀態(tài)黃山玉蘭的花粉活力

醋酸洋紅染色法幾乎使得所有時期的花粉粒都著色（如圖2C），測得在樹上盛開自然散粉的花粉活力為98.23%，室內(nèi)培養(yǎng)散粉的花粉活力是98.85%，室內(nèi)培養(yǎng)萎蔫的花粉活力是93.75%，所測得的結(jié)果明顯偏高。由于醋酸洋紅的染色原理是醋酸洋紅和花粉中的脫氫輔酶反應(yīng)使得細胞著色，但是花粉失活時，部分酶的活性依然存在，因此導(dǎo)致結(jié)果偏高。

MTT染色法所測得在樹上盛開自然散粉的花粉活力為94.47%，室內(nèi)培養(yǎng)使散粉的花粉活力是84.68%，室內(nèi)培養(yǎng)萎蔫的花粉活力是77.27%。花粉著色穩(wěn)定性好，染色效果理想，并且有無活力的染色界限分明（如圖2B）。

圖2 花粉活力圖示（A：TTC染色法；B：MTT染色法；C：醋酸洋紅染色法）

2.2 花粉離體培養(yǎng)結(jié)果

第1、4、7號培養(yǎng)體系中的花粉萌發(fā)效果較好（如圖3所示），花粉管較長。其中，1號培養(yǎng)體系中的花粉萌發(fā)效果最明顯，花粉管最長，4、7號培養(yǎng)體系效果相似。其他培養(yǎng)體系下的花粉萌發(fā)效果不明顯，僅可以看到花粉粒一端有短短的萌發(fā)管或完全看不見。

圖3 不同體系下花粉萌發(fā)情況

對數(shù)據(jù)進行極差分析[29]（見表1），比較2個不同的因素對黃山玉蘭花粉離體培養(yǎng)結(jié)果的影響，2種因素的極差值分別為16.05%、258.23%。由此可見，在花粉離體培養(yǎng)過程中，影響最大的是硼酸濃度。對由2種因素中的3個水平所對應(yīng)的L1、L2、L3中3個不同的組合進行進一步分析，選擇每個因素對應(yīng)的花粉萌發(fā)率最大值的水平來表示適合花粉離體培養(yǎng)的最佳條件。其中，蔗糖濃度和硼酸濃度對應(yīng)的活力最大值均為L1，即最佳的溶液濃度是5%的蔗糖溶液和0.01%的硼酸溶液，即1號培養(yǎng)體系，符合初步觀察預(yù)期。

3 結(jié)論

依據(jù)上述實驗，3種染色活力鑒定方法中，TTC染色法和醋酸洋紅染色法都不適合黃山玉蘭的花粉活性測定。3種狀態(tài)的花粉活力測定結(jié)果為：樹上自然散粉≥室內(nèi)培養(yǎng)散粉≥萎蔫時，MTT染色法測得的結(jié)果呈線性降低（如圖1），符合實際情況。綜合分析，MTT染色法是最適合黃山玉蘭活力測定的方法。且花粉離體培養(yǎng)最佳的溶液濃度是5%的蔗糖溶液和0.01%的硼酸溶液。

4 討論

4.1 不同花粉活力測定方法的比較

在對通關(guān)藤和滇龍膽等花粉活力測定中，均選取活力最高對應(yīng)的測定方法作為最適方法[20,23]。而本實驗分別采用3種染色方法測定了3種不同情況下散粉的花粉活力。醋酸洋紅所測得的室內(nèi)培養(yǎng)的黃山玉蘭散粉的花粉活力略高于樹上自然散粉的花粉活力，但是同樣的花粉在TTC染色法和MTT染色法測定下，都得出樹上自然散粉的花粉活力高于室內(nèi)培養(yǎng)散粉的花粉活力。這表明，醋酸洋紅所測得的數(shù)值比真實情況高，且存在顯著性差異。且實驗采摘的黃山玉蘭都是盛開時期，所以樹上自然散粉的花粉活力應(yīng)該是最強的時期，且離體培養(yǎng)結(jié)果為92.35%，但用TTC染色法測定的活力只有54.82%，因此TTC染色法測得的花粉活力偏低，同時TTC染色結(jié)果顏色穩(wěn)定性差，低活性的和無活性的染色界限不明顯，不適用于黃山玉蘭花粉活力的檢測。未來可根據(jù)不同檢測方法對不同物質(zhì)的靈敏度來設(shè)計進一步實驗，以證明不同檢測方法對不同物種的差異性根本原因。

4.2 花粉離體培養(yǎng)條件的探討

花粉的萌發(fā)是準確確定花粉活力的標尺，花粉離體萌發(fā)的最適合濃度為利用花粉萌發(fā)來測定花粉活力提供了有效的基礎(chǔ)理論依據(jù)[18]。蔗糖在花粉的萌發(fā)和花粉管的生成中提供了能量和碳源，同時還有利于花粉內(nèi)外的滲透壓保持平衡[30-31]，所以適度的蔗糖能促進花粉管的萌發(fā)。硼酸則促進花粉對糖類的代謝、吸收等，促進花粉管內(nèi)果膠物的合成[31]。自然情況下，花柱內(nèi)以及柱頭可以提供花粉萌發(fā)所需要的硼酸。從本研究結(jié)果看，在所設(shè)計的3個濃度梯度的體系中，硼酸的濃度變化對花粉管的萌發(fā)起了很大的影響。過高的硼酸和蔗糖濃度明顯的抑制了花粉管的萌發(fā)和伸長。因此，需要為不同物種探討出所對應(yīng)的最佳離體培養(yǎng)條件，為后續(xù)育種相關(guān)工作奠定基礎(chǔ)。