鄭玲玲，紀瑞鋒，韓紅亮，羅旖璐，羅嘉儀，管悅琴，姚其盛，鄭衛(wèi)兵，陳美蘭，周修騰

（1中國中醫(yī)科學院中藥資源中心/道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006；3安徽九華華源藥業(yè)有限公司，安徽滁州 239000）

0 引言

百蕊草為檀香科植物百蕊草Thesium chinensisTurcz.的干燥全草，原名百乳草，別名一顆松、細須草、青龍草、地石榴、松毛參等，系草本或灌木[1]。百蕊草始載于《圖經(jīng)本草》，味苦澀，性溫，補氣益腎，清熱解毒，解暑，對多種致病菌有抑制作用，全草入藥能抗菌消炎、清熱解毒、補腎澀精，被譽為“植物抗生素”[2]。臨床上已有百蕊草顆粒、百蕊草片、百蕊草膠囊等制劑，主要用于急性炎癥如乳腺炎、肺炎、肺膿瘍、扁桃體炎、上呼吸道感染等多種疾病，療效顯著，市場潛力較大。但是由于百蕊草資源儲量較少，遠遠不能滿足市場需要，因而急需深入結合植化分析及藥效評價研究開展擴大藥源方面研究，為藥材質量的控制以及優(yōu)良種質的選育提供技術指導，為百蕊草資源可持續(xù)利用提供科學依據(jù)。

百蕊草中含有黃酮、有機酸、生物堿、甾醇、酚類、揮發(fā)油等多種化學成分，黃酮類化合物是百蕊草抗菌消炎作用的主要成分之一，其在百蕊草中含量最高，且抑菌效果最好[3]，因此黃酮類成分含量成為評價其質量的一項重要指標[2]。百蕊草報道的化學成分有23種，且包括黃酮類[4-5]，黃酮醇類[5-7]、二氫黃酮醇類[8]及其他類成分[4,9]，徐國兵等[10]一般以山奈酚或總黃酮含量對百蕊草進行質量評價。目前，百蕊草成分的提取一般使用酸水解的方法，是使結合型黃酮類成分水解成游離型黃酮類成分，以檢測山奈酚及槲皮素等水解產(chǎn)物為評價指標。吳兆喜[3]對水解法后百蕊草山奈酚及槲皮素等黃酮醇苷類成分進行提取，確定百蕊草最佳提取工藝，并發(fā)現(xiàn)用60%甲醇提取的效果最佳。湯超[11]以水解后山奈酚含量為指標對百蕊草藥材建立指紋圖譜。徐國兵[10]采用高效液相色譜法測定水解后百蕊草山奈酚含量，建立百蕊草質量檢測方法。

雖然百蕊草的黃酮類成分眾多，但是研究測定的成分一般是水解后單一的山奈酚或槲皮素類成分，本研究結合文獻調研及前期代謝組學研究的基礎上，建立百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的化學成分檢測方法，以期為百蕊草質量標準的建立提供借鑒，全面評價百蕊草藥材的質量。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(Waters；ACGUITY I-CLASS)，Millipore超純水系統(tǒng)（美國Thermo Scientific公司），SB-800 DTD超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），BT-224S型萬分之一電子分析天平（上海贊維衡器有限公司），XS105DU型1/10萬分析天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司），ZA305AS十萬分之一電子天平（上海贊維衡器有限公司）。

1.2 試劑

百蕊草素Ⅰ（批號：C09M9G55496，純度≥98%）購買于上海源葉生物科技有限公司；山奈酚-3-O-蕓香糖苷（批號：DST200619-075，純度≥98%）、紫云英苷（批號：DSTDZ000101，純度≥98%）、山奈酚-7-O-葡萄糖苷（批號：DST200719-077，純度≥98%）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（批號：DST200923-063，純度≥98%）購買于樂美天醫(yī)藥/德斯特生物；色譜甲醇、色譜乙腈購買于Thermo Fisher Scientific；超純水自制。

1.3 百蕊草藥材

野生兩年生百蕊草由九華華源藥業(yè)提供，采自安徽滁州；人工種植百蕊草由中國中醫(yī)科學院中藥資源中心和九華華源藥業(yè)合作在安徽滁州種植基地種植并采集兩年生百蕊草。試驗于2021年1—4月在中國中醫(yī)科學院中藥資源中心重點開放實驗室進行。

1.4 方法

1.4.1 正交試驗

（1）采用正交試驗法考察料液比、提取時間及溶劑比例對百蕊草成分提取的影響，實驗設計三因素三水平，具體的參數(shù)見表1。

表1 因素水平表

（2）根據(jù)選擇的因素水平，按照L9（34）正交試驗表進行試驗安排，共有9組試驗，按照試驗號對應的提取條件，分別稱取百蕊草粉末0.5 g于25 mL錐形瓶中進行提取試驗，采用超高效液相色譜法測定其化學成分的含量。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITYUPLC BEH-C18柱(2.1×50 mm，1.7 μm)，柱溫：30℃，流速：0.4 mL/min，波長：254 nm，流動相：乙腈-0.5%甲酸水進行梯度洗脫，具體見表2，進樣量：1 μL。

表2 流動相洗脫表

1.4.3 標準溶液配制

（1）取百蕊草素Ⅰ對照品10 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成2 mg/mL的母液，逐級稀釋成1 mg/mL和500、200、100、20、10 μg/mL的標準溶液。

（2）取山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成1 mg/mL的母液，逐級稀釋成20、100、20、10、2、1 μg/mL的標準溶液。

（3）取紫云英苷對照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成1 mg/mL的母液，逐級稀釋成200、100、20、10、2、1 μg/mL的標準溶液

（4）取山奈酚-7-O-葡萄糖苷對照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成1 mg/mL的母液，逐級稀釋成200、100、20、10、2、1 μg/mL的標準溶液

（5）取芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品10 mg，置于5 mL容量瓶中，加入純甲醇至刻度線，制成2 mg/mL的母液，逐級稀釋成 1、500、200、50、20、10μg/mL的標準溶液。

1.4.4 方法學考察

（1）專屬性考察。分別吸取1 mg/mL的百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷100 μL，加入500μL純甲醇配制成混合對照品溶液，按1.4.2項下色譜條件進樣分析。

（2）線性關系考察。精密量取標準溶液，按照1.4.2項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)進行回歸統(tǒng)計。

（3）精密度考察。精密量取供試品溶液，按1.4.2項下色譜條件進行測定，同法平行操作6次，隨行標曲，測定峰面積，計算其含量。

（4）穩(wěn)定性考察。取混合對照品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、15、24 h進樣，按1.4.2項下色譜條件進行測定。

（5）重復性考察。取百蕊草粉末0.5 g，精密稱定，重復6份，按照2.1項下正交實驗最優(yōu)超聲提取方法進行樣品制備，按1.4.2項下色譜條件進行測定。

（6）加樣回收率考察。采用加樣回收法，取已知含量的樣品粉末9份，每份0.5 g，精密稱定；分別加入百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶液高中低各400 μL，按照2.1項下正交實驗最優(yōu)超聲提取方法進行樣品制備，按1.4.2項下色譜條件進行測定，計算測得回收率。

1.4.5 野生與人工種植百蕊草含量的測定 分別稱取安徽馬廠野生與人工種植百蕊草的地上、地下粉末0.5 g，重復6次，按照優(yōu)化的提取和UPLC測定方法對其化學成分進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)整理、AI與PS繪圖軟件和SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得出結論。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

從正交試驗直觀分析結果可以看出（表3），各因素對百蕊草總黃酮總含量提取率的影響程度不同，3個因素對提取率的影響由大到小依次為料液比＞溶劑比例＞提取時間。直觀分析結果篩選出百蕊草黃酮類總含量的最優(yōu)提取方案為A1B2C2，即稱取百蕊草粉末，用10倍量的60%甲醇作提取溶劑，超聲(40 KHz)提取45 min。

表3 正交試驗結果

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性 混合對照品溶液、百蕊草供試品溶液的UPLC色譜圖如圖1，結果顯示百蕊草5種主要成分分析均不存在干擾，表明本實驗UPLC方法專屬性良好。

圖1 色譜條件分析

2.2.2 線性關系 百蕊草5種成分的線性回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)見表4，結果表明百蕊草5種成分所在考察范圍內線性良好。

表4 線性方程、線性范圍及相關系數(shù)

2.2.3 精密度 百蕊草5種化學成分精密度實驗結果見表5，RSD值均小于1.25%，表明儀器精密度良好。

表5 精密度實驗結果

2.2.4 穩(wěn)定性 百蕊草5種成分標準品溶液峰面積見表6，24 h內RSD均小于1.8%，表明方法穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性實驗結果

2.2.5 重復性 百蕊草5種成分的重復性實驗結果見表7，RSD均小于3%，表明方法重復性良好。

表7 重復性實驗結果

2.2.6 加樣回收率 百蕊草5種化學成分的加樣回收率結果見表8，RSD均小于3.24%，說明本法準確度良好。

表8 回收率結果表

2.3 野生與人工種植百蕊草含量的測定

由表9可知，百蕊草不同部位的化學成分含量不同，人工種植百蕊草地上部分的百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷及芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量均顯著(P＜0.05)高于地下部分，分別是地下部分含量的4～20.69倍；野生百蕊草藥材地上部分百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷及芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量均顯著高于(P＜0.05)地下部分，分別是地下部分含量的2.64～6.14倍，紫云英苷含量有高于地下部分的趨勢，但是二者之間并無顯著性差異。

表9 人工種植與野生百蕊草藥材化學成分含量表(±SD,n=6)mg/g

表9 人工種植與野生百蕊草藥材化學成分含量表(±SD,n=6)mg/g

注：a，b表示人工種植地上與地下顯著性差異；c，d表示野生百蕊草地上地下顯著性差異；A，B表示人工與野生百蕊草地上顯著性差異；C，D表示人工與野生地下顯著性差異(P＜0.05)。

處理 百蕊草素Ⅰ 山奈酚-3-O-蕓香糖苷 紫云英苷 山奈酚-7-O-葡萄糖苷 芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷人工野生地上地下地上地下1 2.9 8±0.4 4 a A 1.4 4±0.1 7 b C 8.2 8±0.3 1 c B 2.4 3±0.1 4 d D 0.2 6±0.0 1 a A 0.0 2±0.0 2 b A 0.2±0.0 9 c A 0.0 5±0.0 5 d A 0.2 8±0.0 1 a A 0.0 7±0.0 2 b C 0.2±0.0 4 c B 0.1 5±0.0 5 c D 0.8 4±0.0 2 a A 0.1±0.0 2 b C 0.2 9±0.0 6 c B 0.1 1±0.0 6 d D 1 7.3 8±0.6 5 a A 0.8 4±0.1 b C 3.5±0.0 2 c B 0.5 7±0.0 8 d D

野生百蕊草與人工種植百蕊草地上部分化學成分相比，人工種植百蕊草藥材的百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量均顯著(P＜0.05)高于野生百蕊草藥材，人工種植百蕊草藥材地上部分山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量有高于野生百蕊草藥材地上部分的趨勢，但是沒有顯著性差異。

野生百蕊草藥材與人工種植百蕊草藥材地下部分化學成分相比，野生百蕊草藥材的百蕊草素Ⅰ含量、紫云英苷含量、山奈酚-7-O-葡萄糖苷含量均顯著(P＜0.05)高于人工種植百蕊草藥材，野生百蕊草藥材中山奈酚-3-O-蕓香糖苷有高于人工種植百蕊草藥材的趨勢，但是二者之間并無顯著性差異，人工種植百蕊草藥材的芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量顯著高于野生藥材。

3 結論與討論

百蕊草含有多種化學成分，其中黃酮類成分在百蕊草中含量最高，抑菌藥理活性最好[1]。目前，大多數(shù)對于百蕊草活性成分的報道主要針對黃酮類成分的研究[11]，市場上對百蕊草的質量評價標準均以其黃酮醇苷的含量作為標準[12]。黃酮類化合物提取的方法多為醇提法[13]、水提取法[14]、堿性水提取或其他有機溶劑萃取法[15-16]，前期課題組預實驗考察了水提取法、堿浸提法、有機溶劑提取法，最終確定有機溶劑提取效果最佳；通過考察振搖、回流、超聲提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲與回流中各成分提取效果顯著(P＜0.05)優(yōu)于振搖提取，而超聲與回流提取之間各成分含量并無顯著性差異，因此從總體效益和時間成本綜合考慮，本研究選取超聲提取方法；通過考察乙酸乙酯、甲醇和乙醇等有機溶劑的超聲提取效果，最終發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位未能檢測出化學成分，且甲醇溶劑中各成分提取效果顯著(P＜0.05)優(yōu)于乙醇，故確定甲醇為百蕊草化學成分的超聲提取溶劑。通過正交實驗設計，考察甲醇溶劑比例、超聲時間和料液比，最終確定百蕊草化學成分的提取方法為60%的甲醇溶液超聲提取45 min，料液比為1：10。

此外，本研究對百蕊草化學成分UPLC檢測方法進行了摸索，分別對梯度洗脫方法、流動相配比、色譜柱等進行考察，采用0.5%甲酸水-甲醇溶液、0.1%甲酸水-乙腈溶液、0.5%甲酸水-乙腈溶液作為流動相，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC T3 C18(2.1×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUIT YUPLC BEHC18(2.1×50mm，1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC T3 C18(2.1×50 mm，1.7 μm)作為色譜柱進行考察，結果顯示，0.5%甲酸水-乙腈溶液作為流動相，Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)作為色譜柱，百蕊草各化學成分表現(xiàn)出良好的線性關系(r＞0.9992)，色譜峰得到很好的分離，且無基質干擾。儀器精密度、穩(wěn)定性和重復性試驗RSD均＜3%；百蕊草各化學成分平均回收率為97%，表明建立的UPLC檢測方法具有一定的準確性、穩(wěn)定性和可靠性。

目前，相關文獻報道[17-18]的百蕊草藥材以及上市制劑“百蕊草顆粒、百蕊含片”等的質量標準中，多以山奈酚為測定指標。唐慧文等[19]認為百蕊草中主要活性成分為黃酮醇苷，通過對黃酮類成分的比較，確定以山奈酚為指標成分；曹明成等[20]以高效液相色譜法測定百蕊草中的黃酮醇苷水解后的共同黃酮醇苷元山奈酚的含量，并以百蕊草中黃酮醇苷水解后的共同苷元山奈酚含量作為百蕊草質量的評價指標；羅夫來等[21]以百蕊草藥材中總黃酮、山奈酚、甘露醇、多糖等多種活性成分含量作為百蕊草藥材的內在品質評價指標；徐國兵等[10]建立了百蕊草藥材中總黃酮和山奈酚的含量測定方法，對百蕊草藥材進行質量評價。但是，山奈酚主要是由黃酮苷水解后得到的苷元，因此，大多采用酸水解方法提取百蕊草中山奈酚，目的是使結合型黃酮類成分的酯鍵或糖苷鍵水解釋放多種形態(tài)游離型黃酮類成分[22]，但是酸水解的程度并不明確，其酸濃度、水解時間及加入量均是影響水解程度的關鍵因素，影響含量的準確性[23-24]，此外，經(jīng)酸水解之后制備的供試液中，山奈酚的含量已非藥材天然含有的水平，不能真實反映藥材及制劑中真實的含量[25]。因此，本研究結合前期百蕊草代謝組學研究的基礎上，選定百蕊草素Ⅰ、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、山奈酚-7-O-葡萄糖苷及芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作為百蕊草的化學成分，通過對2批百蕊草藥材的研究發(fā)現(xiàn)，野生百蕊草和人工百蕊草中中百蕊草素Ⅰ與芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量均較高，且人工種植百蕊草中化學成分的含量高于野生種植的百蕊草。后期課題組將結合代謝組學和植物化學的方法分離提純百蕊草黃酮類成分并開展相應藥效活性的研究，以期為百蕊草的質量評價指標成分鑒定提供借鑒。