李 麒 閆思宇 陳 肅

（林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

低溫和鹽堿是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要非生物脅迫，這些非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致植物減產(chǎn)而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，甘蔗（）在遭受寒凍害后發(fā)生線粒體解體且保護(hù)酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均發(fā)生變化；鹽脅迫使楊樹(shù)（）的膜脂過(guò)氧化程度和電解質(zhì)外滲率顯著增加；在玉米（）研究中發(fā)現(xiàn)低溫脅迫使玉米超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等活性改變，糖、抗壞血酸、谷胱甘肽含量也發(fā)生變化。同時(shí)也有研究表明，植物可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身的生理和形態(tài)的變化來(lái)提高對(duì)非生物脅迫下的適應(yīng)性。例如，SOD、POD在非生物脅迫下被激活以抵御超氧自由基的毒害。因此，通過(guò)測(cè)量脅迫后SOD、POD活性、MDA含量以及相對(duì)電導(dǎo)率等生理指標(biāo)可有效研究植物抗逆性，為提高林木抗性、增加苗木成活率、擴(kuò)大林木栽培面積提供重要依據(jù)。

當(dāng)植物遭受非生物脅迫時(shí)，體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)積極調(diào)控，其中不乏一些重要的調(diào)控基因，如植物中特有的AP2∕ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族。根據(jù)編碼AP2 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及序列的相似性，AP2∕ERF 基因家族又被具體細(xì)分為3 個(gè)家族：AP2 亞家族（編碼2 個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域）、ERF 亞家族（編碼1 個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域）和RAV 亞家族（編碼一個(gè)B3 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域）。AP2亞家族轉(zhuǎn)錄因子主要負(fù)責(zé)調(diào)控種子萌發(fā)、花器官的形成等過(guò)程；ERF 亞家族分為ERF 亞族（結(jié)合GCC-box 等順式作用元件來(lái)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)）和DREB 亞族（結(jié)合在啟動(dòng)子DRE 元件上，啟動(dòng)下游基因表達(dá)）；RAV 亞家族分為RAV1 亞族和RAV2 亞族，可通過(guò)負(fù)調(diào)控FT 和赤霉素途徑，防止植株提早開(kāi)花。

ERF 亞家族在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，幾種水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯誘導(dǎo)的ERF整合了不同的信號(hào)通路，以介導(dǎo)植物對(duì)不同病原體和疾病條件的防御反應(yīng)。辣椒（）基因受水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯脅迫誘導(dǎo)，特別在青枯病感染時(shí)表達(dá)量增高，在植物抵抗感染的過(guò)程中發(fā)揮正調(diào)控作用。大豆（）基因在干旱、鹽、脫落酸、乙烯，以及大豆花葉病毒的誘導(dǎo)下均應(yīng)答，并且能夠增強(qiáng)植物抗花葉病毒和鏈格孢菌的能力。用乙烯處理香蕉（）果實(shí)，發(fā)現(xiàn)與表達(dá)量變化顯著，經(jīng)少量外源乙烯誘導(dǎo)可以促進(jìn)兩者及香蕉中乙烯合成關(guān)鍵基因和的表達(dá)，并促進(jìn)香蕉果實(shí)合成并釋放乙烯，證明ERF 類轉(zhuǎn)錄因子參與乙烯的生物合成及信號(hào)傳導(dǎo)。而在小麥（）、白樺（）、柑橘（）和番茄（）中的研究則表明，基因亦響應(yīng)干旱、低溫、鹽和各種植物激素等脅迫，具有重要的抗逆調(diào)控作用。雖然目前對(duì)于ERF 家族的研究較多，但是其在木本植物中的作用仍需要進(jìn)一步探究。

白樺屬于落葉喬木，樹(shù)形優(yōu)美，可作行道樹(shù)和觀賞樹(shù)，且材質(zhì)堅(jiān)硬適合制作家具、筷子和紙漿。白樺樹(shù)皮具有抗腫瘤、抗病毒等藥用價(jià)值。因其在木本植物中較為經(jīng)典，生長(zhǎng)周期短且抗寒性強(qiáng)，故用于本實(shí)驗(yàn)。并且本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)白樺基因（與擬南芥基因序列較為相似故命名）在處于非生物脅迫時(shí)的表達(dá)量顯著上調(diào)，因此推測(cè)該基因有助于白樺植株對(duì)非生物脅迫的抵御，故克隆全長(zhǎng)cDNA 序列，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，成功獲得過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，為研究白樺非生物脅迫形成的分子基礎(chǔ)研究及抗性分子育種提供理論數(shù)據(jù)和研究材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因植物受體材料為野生型白樺組培苗。組織培養(yǎng)室溫度為24 ℃，光周期為16 h光照和8 h黑暗。選擇發(fā)育狀態(tài)良好的較大葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。

大腸桿菌（）感受態(tài)細(xì)胞TOP10購(gòu)買于昂羽生物有限公司。農(nóng)桿菌GV3101，植物表達(dá)載體pROKⅡ菌株為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。酶和T鏈接酶購(gòu)買自大連寶生物有限公司。

1.2 ERF98基因的多序列比對(duì)分析

白樺的基因序列：

ATGGAAAAAGAGGGGAAGGGTCAGGGCAA AGAAGATGGGGAAAAAGATGTGCGTTACAGGG GAGTGAGACGGCGGCCGTGGGGGAAATACGCG GCGGAGATTCGTGACTCCACTAGGCATGGTGCC CGGCTGTGGCTGGGGACTTTTGACAGGGCAGAA GATGCGGCTCGGGCTTATGATCGAGCCGCCTTTG CAATGAGGGGAAACATGGCCATTCTTAACTTCC CCGATGAACACCGGTCACCACCCAATGTGGATT TTCCACCTCCTTCCTCTTCCTTGGCATCATCGTCA TCATCGTCGTCCTCATCCTCTTCATCGCAGGTTG ATAGAAATAGTAGTAGGTCTGAGCTTGGGAAAG AGGTTTTTGAGTTTGAGTATTTGGACGACAAGTT GTTGGAGGAACTTCTTGATTTTGATTACAAAACAAAGAAGAACTGA

利用NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行同源基因的查找。在BioEdit 軟件中進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)，比較同源基因的差異性。利用MEGA 5.1 軟件制作進(jìn)化樹(shù)，比較同源基因的親緣性。

1.3 白樺BpERF98基因的克隆及其植物載體構(gòu)建

利用RNA 試劑盒（無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司）提取白樺總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡）合成cDNA作為基因克隆模板。根據(jù)植物過(guò)表達(dá)載體pROKⅡ的多克隆位點(diǎn)和基因特征，在設(shè)計(jì)引物時(shí)在基因兩端分別添加和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（見(jiàn)表1）。將以白樺cDNA 為模板克隆獲得的基因插入到兩個(gè)酶切位點(diǎn)中間。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行目的基因擴(kuò)增（反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；68 ℃延伸1 min；30 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min）。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，使用膠回收試劑盒（Omega）回收，回收產(chǎn)物使用T4 鏈接酶連接到pROKⅡ載體上并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)篩選后送至擎科測(cè)序公司進(jìn)行DNA 測(cè)序。通過(guò)凍融轉(zhuǎn)化法，將帶有的目的基因的載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 BpERF98的引物序列（黑色為酶切位點(diǎn)）Table 1 Primer sequences used for BpERF98 clone（The balck is the restriction enzyme cutting site）

1.4 白樺BpERF98基因遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)

采用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)良好的野生型白樺葉片，獲得轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系分株，提取DNA（天根生化科技有限公司），并進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，篩選轉(zhuǎn)基因株系并進(jìn)行無(wú)性系繁殖。

1.5 轉(zhuǎn)基因植物的非生物脅迫分析

對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系和野生型白樺進(jìn)行大量的擴(kuò)繁，待其生根后移栽至土壤中，繼續(xù)培養(yǎng)1 個(gè)月后進(jìn)行非生物脅迫處理，測(cè)量相對(duì)電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶（SOD）的活性（分光法，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）、過(guò)氧化物酶（POD）的活性（分光法，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）和丙二醛（MDA）的含量（分光法，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）等生理指標(biāo)。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，使用prisn 6.0進(jìn)行多重分析。白樺植株在組織培養(yǎng)室和溫室中培養(yǎng)，溫度均為24 ℃，光周期均為16 h 光照和8 h 黑暗。根據(jù)生長(zhǎng)狀態(tài)選取了轉(zhuǎn)基因株系L1、L4、L12、L14 和L15 進(jìn)行非生物脅迫實(shí)驗(yàn)。

1.5.1 鹽脅迫

選用生長(zhǎng)狀態(tài)相同的白樺土培苗（1 月齡植株，株高20 cm 左右），使用NaCl的等滲溶液即150 mmol·LNaCl進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)。保持土壤的鹽分水平相同，在脅迫0、1、3 和5 d 后進(jìn)行取樣（選取第3片到第5片功能葉片，用錫紙包裹放入液氮速凍），保存樣品至-80 ℃冰箱內(nèi)，并測(cè)量其生理指標(biāo)。

1.5.2 低溫脅迫

選用生長(zhǎng)狀態(tài)相同的白樺土培苗（1 月齡植株，株高20 cm 左右），利用低溫光照培養(yǎng)箱（5 ℃，光周期為16 h光照∕8 h黑暗）模擬低溫脅迫。在脅迫0、3和5 d后進(jìn)行取樣（選取第3片到第5片功能葉片，用錫紙包裹放入液氮速凍），保存樣品至-80 ℃冰箱內(nèi)，并測(cè)量其生理指標(biāo)。

1.5.3 凍害脅迫

選用生長(zhǎng)狀態(tài)相同的白樺土培苗（1 月齡植株，株高20 cm 左右），利用零下培養(yǎng)箱（-5 ℃）處理5 min 后取出恢復(fù)正常培養(yǎng)，1 d 后進(jìn)行取樣（選取第3 片到第5 片功能葉片，用錫紙包裹放入液氮速凍），保存樣品至-80 ℃冰箱內(nèi)，并測(cè)量其生理指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERF98基因的多序列比對(duì)分析

根據(jù)蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果可以看出，相似性在80%左右，不同之處可能是由于基因表達(dá)的差異。根據(jù)蛋白質(zhì)多序列比對(duì)結(jié)果可以看出，白樺與擬南芥、樟子松、茶樹(shù)芙蓉雷公藤棗番木瓜和草莓等的結(jié)構(gòu)域相同，同屬于ERF 亞家族，故而推測(cè)它們?cè)诠δ苌峡赡芟嗨啤?/p>

2.2 BpERF98基因的克隆及其植物載體構(gòu)建

以野生型白樺cDNA為模板，使用特異性載體基因引物pROKⅡ-ERF98-F 和pROKⅡ-ERF98-R，利用RT-PCR進(jìn)行目的基因克隆擴(kuò)增（見(jiàn)圖2）。利用和酶對(duì)pROKⅡ載體和PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再使用T連接酶將目的基因與載體相連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，選取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌液PCR，測(cè)序并比對(duì)原始序列，結(jié)果符合一致即成功獲得帶有基因的表達(dá)載體。

圖1 多序列比對(duì)A.蛋白質(zhì)序列比對(duì)；B.蛋白質(zhì)進(jìn)化樹(shù)（AtERF98：NM_113224.3；PsERF98：XM_023017227.1；CsERF98：XM_010513891.2；HmERF98：XM_039165326.1；TwERF98：XM_038864613.1；CpERF98：XM_022042754.1；FaERF98：XM_011459695.1；ZjERF98：XM_016035968.2）Fig.1 Multiple gene sequence alignmentA. Gene sequence alignment；B. ERF98 gene evolutionary tree（AtERF98：NM_113224.3；PsERF98：XM_023017227.1；CsERF98：XM_010513891.2；HmERF98：XM_039165326.1；TwERF98：XM_038864613.1；CpERF98：XM_022042754.1；FaERF98：XM_011459695.1；ZjERF98：XM_016035968.2）

圖2 BpERF98基因的克隆M.DNA Marker DL2000；1.水；2.目的基因BpERF98Fig.2 Cloning of the BpERF98 geneM.DNA Marker DL2000；1.Water；2.Vector containing BpERF98

2.3 白樺BpERF98基因遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)

2.3.1 轉(zhuǎn)基因株系的獲得

用含有pROKⅡ-ERF98 載體的農(nóng)桿菌侵染野生型白樺葉片，共培養(yǎng)2 d 后進(jìn)行脫菌，并放置在含有30 mg·L卡那霉素、200 mg·L頭孢霉素和200 mg·L特美汀的分化培養(yǎng)基上（WPM+0.8 mg·L，6-BA+0.02 mg·L，NAA+0.05 mg·L，GA+2%（w∕v）蔗糖，調(diào)節(jié)pH 至5.8～6.0）。培養(yǎng)25 d 左右可見(jiàn)傷口處長(zhǎng)出愈傷組織，待長(zhǎng)出不定芽后移栽至生根培養(yǎng)基中（1∕2 MS+0.02 mg·LNAA+2%（w∕v）蔗糖，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0），獲得轉(zhuǎn)基因株系。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因株系的鑒定

提取轉(zhuǎn)基因株系和野生型白樺苗的基因組DNA（天根生化科技有限公司），利用載體上游引物和下游目的基因引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)。使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（選取轉(zhuǎn)基因株系L1、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L14和L15進(jìn)行DNA檢測(cè)），結(jié)果顯示目的條帶與陽(yáng)性對(duì)照位置一致（見(jiàn)圖3），證明基因成功轉(zhuǎn)入白樺基因組中。

圖3 轉(zhuǎn)基因株系鑒定M.DNA Marker DL2000；1～13.BpERF98轉(zhuǎn)基因株系；14.陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒）；15.野生型株系（WT）；16.陰性對(duì)照（水）Fig.3 Identification of transgenic strainsM.DNA Marker DL15000；1-13.BpERF98 transgenic strain；14.Positive control（plasmid）；15.Wild-type strain（WT）；16.Negative control（water）

2.4 轉(zhuǎn)基因植物的非生物脅迫分析

2.4.1 鹽脅迫生理指標(biāo)的變化

在圖4 中，通過(guò)頂芽表型看出在第3 天野生型白樺邊緣出現(xiàn)損傷，在第5天時(shí)損傷擴(kuò)大。轉(zhuǎn)基因株系并沒(méi)有出現(xiàn)葉片損傷。結(jié)果表明，隨著鹽脅迫時(shí)間的增加，野生型白樺受到的損害越來(lái)越大，轉(zhuǎn)基因株系隨著時(shí)間的推移抗逆物質(zhì)逐漸增多，提高了白樺對(duì)鹽脅迫的耐受能力。

圖4 鹽脅迫頂芽表型Fig.4 Terminal bud phenotype under salt stress

如圖5 所示，隨著鹽脅迫時(shí)間的加長(zhǎng)，野生型白樺的相對(duì)電導(dǎo)率及MDA 含量明顯升高，在第五天時(shí)達(dá)到峰值。而與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系受到傷害程度較小，受傷害程度沒(méi)有明顯的起伏。轉(zhuǎn)基因株系在SOD與POD活性的增長(zhǎng)趨勢(shì)較野生型白樺有大幅度提高，尤其轉(zhuǎn)基因4號(hào)株系在遭受鹽脅迫時(shí)酶的活性較高，在第5天時(shí)酶的活性達(dá)到最大值。

圖5 鹽脅迫生理指標(biāo)A.相對(duì)電導(dǎo)率受損指標(biāo)；B.丙二醛含量的積累；C.過(guò)氧化物酶活的含量；D.超氧化物歧化酶活性的含量Fig.5 Physiological indexes of salt stressA.Damage index of relative electrical conductivity；B.Accumulation of malondialdehyde content；C.Content of peroxidase activity；D.Content of superoxide dismutase activity

2.4.2 低溫脅迫生理指標(biāo)的變化

低溫脅迫處理5 d 后，轉(zhuǎn)基因1 號(hào)株系由于產(chǎn)生了花青素而導(dǎo)致葉脈變紅，其他各株系頂芽表型沒(méi)有明顯變化（見(jiàn)圖6）。在第10 天野生型白樺和轉(zhuǎn)基因株系1號(hào)發(fā)生變黃和變紅，其它轉(zhuǎn)基因株系發(fā)生了主葉脈變紅。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)生了更多的抗逆物質(zhì)，從而抵御了低溫脅迫使植株保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖6 低溫脅迫頂芽表型Fig.6 Terminal bud phenotype under low temperature stress

在零上5 ℃的低溫脅迫下白樺苗均呈現(xiàn)不同程度的傷害。通過(guò)圖7 可以看出野生型株系的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量較轉(zhuǎn)基因株系高，并在第5天就有了明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，第10天尤其明顯，說(shuō)明受損情況嚴(yán)重。轉(zhuǎn)基因株系在SOD和POD的活性增長(zhǎng)情況比野生型白樺較快。第10天酶活性增長(zhǎng)情況比第5 天酶活性增長(zhǎng)程度大。轉(zhuǎn)基因株系4號(hào)和12號(hào)在酶的活性增長(zhǎng)程度上較快。

圖7 低溫脅迫生理指標(biāo)數(shù)據(jù)A.相對(duì)電導(dǎo)率受損指標(biāo)；B.丙二醛含量的積累；C.過(guò)氧化物酶的活性含量；D.超氧化物歧化酶的活性含量Fig.7 Physiological index data of low temperature stressA.Damage index of relative electrical conductivity；B.Accumulation of malondialdehyde content；C.Content of peroxidase activity；D.Content of superoxide dismutase activity

2.4.3 凍害脅迫生理指標(biāo)的變化

在恢復(fù)培養(yǎng)后1 d 觀察到野生型白樺苗頂芽邊緣受損，第一片小頂芽均發(fā)黑枯萎（見(jiàn)圖8），轉(zhuǎn)基因株系1號(hào)部分受損，其他轉(zhuǎn)基因株系葉片完好并沒(méi)有受到損傷。

圖8 凍害脅迫頂芽表型Fig.8 Terminal bud phenotype under freezing stress

通過(guò)模擬北方特有的倒春寒氣候發(fā)現(xiàn)，野生型白樺苗在-5 ℃時(shí)受到的損害較轉(zhuǎn)基因株系大。如圖9 所示，轉(zhuǎn)基因15 號(hào)株系的MDA 的含量與野生型和其他轉(zhuǎn)基因株系相比積累的較少，且轉(zhuǎn)基因株系的SOD與POD活性的增長(zhǎng)情況均超過(guò)野生型白樺。其中，轉(zhuǎn)基因株系1 號(hào)POD 活性增加是其他類型的2倍左右，轉(zhuǎn)基因株系4號(hào)SOD 的活性增長(zhǎng)較野生型白樺的增長(zhǎng)情況更為顯著。

圖9 凍害脅迫生理指標(biāo)數(shù)據(jù)A.相對(duì)電導(dǎo)率受損指標(biāo)；B.丙二醛含量的積累；C.過(guò)氧化物酶的活性含量；D.超氧化物歧化酶的活性含量Fig.9 Physiological index data of freezing injury stressA.Damage index of relative electrical conductivity；B.Accumulation of malondialdehyde content；C.Content of peroxidase activity；D.Content of superoxide dismutase activity

3 討論

植物在受到脅迫刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)迅速積累相應(yīng)的溶質(zhì)和保護(hù)劑，像滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（包括糖、氨基酸、脂肪酸等）及抗氧化酶（包括SOD、POD 和CAT 等）。一些分子通過(guò)增加細(xì)胞的水勢(shì)來(lái)幫助細(xì)胞重新建立滲透平衡，保護(hù)細(xì)胞在穩(wěn)定細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和膜方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。ERF 亞家族作為乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，可以特異性結(jié)合基因組上游的AGCCGCC 元件（GCC-box）從而參與乙烯應(yīng)答、抗病及非生物脅迫。據(jù)已報(bào)道的ERF 家族基因多數(shù)能夠響應(yīng)低溫、干旱、鹽堿、病害和機(jī)械損傷并且能夠被脫落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）等內(nèi)源激素誘導(dǎo)而參與不同的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑。植物激素信號(hào)在非生物脅迫響應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，協(xié)調(diào)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)中，內(nèi)源性ABA水平迅速升高，進(jìn)而激活特定的信號(hào)通路并改變基因表達(dá)。乙烯對(duì)植物在非生物脅迫條件下的適應(yīng)和生存也起著至關(guān)重要的作用。乙烯響應(yīng)因子通過(guò)擬南芥中抗壞血酸合成的轉(zhuǎn)錄激活增強(qiáng)對(duì)鹽的耐受性?？梢哉{(diào)控ERF 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而在活性氧清除中發(fā)揮作用。EFE 是乙烯生成過(guò)程中非常重要的酶，已有大量的研究表明ERF 類轉(zhuǎn)錄因子在低溫等非生物脅迫下發(fā)揮重要的作用?；煵荩ǎ┗虻谋磉_(dá)，受低鉀、ABA 的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，同時(shí)，也在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)PEG、高鹽、低溫及HO的脅迫有較為明顯的響應(yīng)。煙草（）轉(zhuǎn)錄因子ERF 基因的過(guò)表達(dá)植株抗旱、耐高鹽與低溫能力較好，辣椒基因可能參與低溫脅迫應(yīng)答。小黑楊（×）轉(zhuǎn)錄因子基因的過(guò)表達(dá)植株通過(guò)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力提高耐鹽能力，葡萄（）轉(zhuǎn)錄因子和基因通過(guò)降低MDA 的含量降低膜脂過(guò)氧化的程度，増加SOD、POD 和CAT 的活性提高去除ROS的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)提高過(guò)表達(dá)植株的耐低溫能力，柑橘屬佛手（L.var.）基因可通過(guò)阻止活性氧的過(guò)氧化，降低丙二醛等有毒物質(zhì)的積累發(fā)揮作用，使質(zhì)膜受到保護(hù)等。因此，本實(shí)驗(yàn)中獲取了過(guò)表達(dá)ERF 類轉(zhuǎn)錄因子的白樺苗，通過(guò)觀察其頂芽形態(tài)及測(cè)量生理指標(biāo)（相對(duì)電導(dǎo)率、MDA 含量、POD 和SOD 的活性），分析對(duì)比野生型白樺與轉(zhuǎn)基因型白樺在非生物脅迫處理下的差異。

植物在逆境脅迫或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞，導(dǎo)致活性氧的積累?；钚匝醯奈：κ且l(fā)或加劇膜脂的過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。丙二醛是植物器官在逆境條件下或衰老時(shí)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用而產(chǎn)生的一種有機(jī)化合物，它的產(chǎn)生加劇膜的損傷。因此，MDA 產(chǎn)生數(shù)量的多少能夠代表膜脂過(guò)氧化的程度，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱。同時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率也是衡量細(xì)胞膜受損情況的一個(gè)重要指標(biāo)，逆境脅迫下細(xì)胞膜受損導(dǎo)致電解質(zhì)外滲增加，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響植物的抗逆能力。在本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在鹽脅迫、低溫脅迫還是凍害脅迫中，轉(zhuǎn)基因型白樺植株的相對(duì)電導(dǎo)率及MDA 含量均低于野生型（圖5，7 和9）。這些代表細(xì)胞膜損傷程度的生理指標(biāo)的相對(duì)降低表明ERF 基因的過(guò)表達(dá)對(duì)于保護(hù)白樺細(xì)胞膜具有積極作用，可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜傷害的降低來(lái)增加抵御非生物脅迫的能力。此外，在鹽脅迫中，轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電導(dǎo)率及MDA 含量的增加顯著低于野生型植株（見(jiàn)圖5），這可能意味著ERF基因的過(guò)表達(dá)對(duì)于鹽脅迫下細(xì)胞膜的保護(hù)具有更重要的意義。

SOD 廣泛的存在于微生物、動(dòng)物、植物和培養(yǎng)細(xì)胞中，SOD 不僅是超氧化物陰離子消除酶，也是HO主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有著重要作用。SOD 是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。POD 是以過(guò)氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于載體的過(guò)氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過(guò)氧化氫，氧化酚類和胺類化合物和烴類氧化產(chǎn)物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類、醛類、胺類、苯類毒性的雙重作用。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，在3 種非生物脅迫中，隨著脅迫時(shí)間的增加，過(guò)表達(dá)ERF 株系的POD、SOD 的活性均高于野生型植株。值得注意的是，轉(zhuǎn)基因4號(hào)株系的SOD 的活性表現(xiàn)出了更高的優(yōu)勢(shì)（見(jiàn)圖5，7，9），表明轉(zhuǎn)基因4 號(hào)株系對(duì)于SOD 活性的調(diào)控可能更為重要。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建植物表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因株系。進(jìn)行了鹽脅迫、低溫和凍害脅迫的抗性實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因株系在各個(gè)脅迫中表現(xiàn)都優(yōu)于野生型株系。轉(zhuǎn)基因株系中酶活性的快速增長(zhǎng)為過(guò)表達(dá)ERF 基因的白樺維持了一個(gè)較低的受損情況，猜測(cè)其產(chǎn)生了大量抵御物質(zhì)保衛(wèi)白樺從而降低受損情況。推測(cè)基因改善了植物的耐鹽和抗寒性。如何通過(guò)調(diào)控白樺的抗逆機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。