薛 梅，魏秀芹，康春博，賈 偉，張夢巧，馬 超，王立偉，高 強

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院消化科，北京 100144）

結(jié)腸癌（colon cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第4 位[1]。據(jù)報道[2]，早期結(jié)腸癌5年生存率為95%，中晚期結(jié)腸癌5年生存率僅為20%。結(jié)腸腺瘤性息肉是結(jié)腸癌公認的癌前病變，結(jié)腸腺瘤發(fā)展成浸潤性癌的年轉(zhuǎn)化率約為0.25%[3]，因此結(jié)腸腺瘤性息肉的早診早治對于改善結(jié)腸癌預(yù)后至關(guān)重要[4]。結(jié)腸鏡下息肉切除治療是目前治療結(jié)腸腺瘤性息肉的首選方法，但清潔腸道和腸鏡檢查較為痛苦，且麻醉會增加結(jié)腸鏡檢查后并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險，因此尋找結(jié)腸腺瘤性息肉新的預(yù)防和治療方法將有效減少結(jié)腸癌的發(fā)生。同源基因家族（sine oculis homeobox，SIX）由6個成員組成（SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5 和SIX6）[5]，這6個家族成員均有兩個保守的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)的相互作用，而同源異形域（homeo-domain，HD）參與DNA 結(jié)合[6]。SIXs 參與調(diào)控多種細胞功能，包括參與組織和器官的發(fā)育等，而其失調(diào)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究主要分析SIX1 和SIX4 在結(jié)腸腺瘤性息肉中的表達和意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片 采用從上海芯超生物科技有限公司購買的結(jié)腸癌/癌旁組織芯片，該芯片手術(shù)時間為2019年11 月-2020年5 月，結(jié)腸癌組織和癌旁組織各1個點，共30例，其中男21例，女9例，年齡36～73歲，平均年齡66.7歲。收集2019年11 月-2020年5 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院結(jié)腸腺瘤性息肉患者共30例，其中男18例，女12例，年齡33～71歲，平均年齡65.5歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批同意，患者知情同意并簽屬知情同意書。

1.1.2 主要試劑 一抗為兔抗人SIX1 和SIX4 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、小鼠/兔鏈霉卵白素一生物素法檢測系統(tǒng)通用SP 試劑盒SP-9000（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、抗原修復(fù)液（pH=9.0，20 倍）、PBS（濃度為0.01 mmol/L，pH=7.4）、DAKO 顯色劑（北京安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 SP 免疫組化法染色 參照文獻[7]的免疫組化方法，SIX1 和SIX4 一抗（一抗∶抗體稀釋液=1∶200）稀釋過夜，次日DAKO 顯色后，蘇木素染核、分化、封片，鏡下觀察評分。

1.2.2 結(jié)果判定 SIX1 和SIX4 蛋白主要表達于腺體細胞的細胞質(zhì)及細胞膜，以細胞質(zhì)及細胞膜出現(xiàn)淡黃色、黃色、棕黃色為陽性。按陽性細胞比例計分：＜10%為0 分，10%～30%為1 分，31%～60%為2 分，＞60%為3 分；按染色強度計分：無色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。將兩項計分相乘，乘積≤3 分為SIX4 表達陰性（-），＞3 分為SIX4表達陽性（+）[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)腸腺瘤性息肉組織中SIX1、SIX4 蛋白表達低于結(jié)腸癌組織，高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1；SIX1、SIX4 蛋白表達在結(jié)腸腺瘤性息肉內(nèi)定位于結(jié)腸上皮細胞質(zhì)及細胞膜，見圖1。

表1 結(jié)腸腺瘤性息肉、結(jié)腸癌癌組織與癌旁組織中SIX1、SIX4 表達水平比較[n（%）]

圖1 結(jié)腸腺瘤性息肉組織、結(jié)腸癌組織和癌旁組織中SIX1 和SIX4 的表達（SP×200）

3 討論

大多數(shù)結(jié)腸癌起源于腺瘤，因此結(jié)腸腺瘤性息肉是結(jié)腸癌癌前病變。結(jié)腸息肉中80%是腺瘤性息肉，其發(fā)展由小到大，然后發(fā)展為不典型增生，最后成為癌癥，而這個演變?yōu)榘┑倪^程至少需要10年[9]。因此，臨床早期預(yù)防、診斷和治療結(jié)腸腺瘤性息肉對于改善患者預(yù)后具有重要意義。目前關(guān)于結(jié)腸息肉發(fā)生癌變的具體機制尚不清楚，臨床發(fā)現(xiàn)絨毛狀腺瘤較管狀腺瘤性息肉癌變率高，而炎性及增生性息肉基本不癌變[10]。研究證實[11]，腸道中正常存在的干細胞功能紊亂，如自我更新、克隆增殖、分化和凋亡失去平衡，不但與結(jié)腸腺瘤性息肉和結(jié)腸癌的發(fā)生有直接或者間接的關(guān)系，而且很有可能是腫瘤細胞的最早起源。因此，從細胞和分子生物學(xué)水平上研究結(jié)腸腺瘤性息肉發(fā)生規(guī)律及原因，對于結(jié)腸腺瘤性息肉的早期診斷、結(jié)腸癌發(fā)生風(fēng)險預(yù)測及尋找新的治療方法和新的靶點具有非常重要的意義。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與腫瘤干細胞相關(guān)的表面標志物，SIX 家族蛋白是器官發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸腺瘤性息肉組織中SIX1蛋白表達低于結(jié)腸癌組織，高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示SIX1 可能參與結(jié)腸腺瘤性息肉癌變的過程。Xu H 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SIX1 可以顯著促進大腸癌的生長和轉(zhuǎn)移。Xia Y 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SIX1 參與非小細胞肺癌腫瘤發(fā)展過程中的侵襲和增殖。此外，SIX1 在乳腺癌[13]、宮頸癌[14]、肝細胞癌[15]、結(jié)直腸癌[16]等多種腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并與患者不良臨床預(yù)后密切相關(guān)[17-19]。研究表明[20]，SIX1 通過刺激血管生成，促進腫瘤間質(zhì)的重塑、轉(zhuǎn)移，是結(jié)腸癌患者主要死亡原因。與SIX1相似，結(jié)腸腺瘤性息肉組織中SIX4 蛋白表達低于結(jié)腸癌組織，高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明SIX4 在結(jié)腸腺瘤性息肉向結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮作用，與Li G 等[21]研究結(jié)果類似。SIX4 含有760個氨基酸，參與器官發(fā)育，如肌肉發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生，而其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中通過將DNA 序列與靶基因結(jié)合，既可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，又可作為轉(zhuǎn)錄激活因子。

綜上所述，在結(jié)腸腺瘤性息肉中SIX1 和SIX4表達低于結(jié)腸癌，但高于癌旁正常組織，提示SIX1和SIX4 可能在結(jié)腸腺瘤性息肉發(fā)生過程中發(fā)揮作用。檢測SIX1 和SIX4 蛋白表達可能有助于結(jié)腸癌的早期診斷。