王振宇，楊 光，賽 娜，潘文秋，宋衛(wèi)寧,2，聶小軍,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

脫落酸(ABA)在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞伸長和分裂、胚成熟、種子脫水耐性、種子休眠和萌發(fā)、葉片衰老以及誘導(dǎo)根生長和果實(shí)成熟等過程。此外，ABA還可以調(diào)節(jié)氣孔孔徑，在調(diào)控植物響應(yīng)各種生物和非生物脅迫中具有不可或缺的重要作用。[()-]是目前已知的最大的植物激素受體基因家族。Park等利用種子萌發(fā)抑制劑Pyrabactin處理擬南芥，首次篩選出了抗Pyrabactin的突變株，并從突變株中分離得到可特異結(jié)合ABA的基因及其他13個的同源基因，將其分別命名為～。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，PYL家族成員可以結(jié)合ABA，抑制A類PP2C蛋白磷酸酶ABI1或者ABI2的活性。PYL蛋白作為ABA的受體，是ABA信號通路最上游的調(diào)控因子，承擔(dān)著識別ABA信號和啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。

鑒于基因家族的重要功能，前人對擬南芥()、水稻(L.)、玉米(L.)、大豆()、甘藍(lán)型油菜(L.)、煙草(L.)和陸地棉(spp.)中的基因家族已經(jīng)進(jìn)行了全基因組鑒定，部分基因的功能也已經(jīng)被驗(yàn)證。如在擬南芥中，、、、、、和可促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的種子萌發(fā)、氣孔關(guān)閉和根系生長，而和則抑制種子萌發(fā)。另外，前人還發(fā)現(xiàn)和與擬南芥的耐旱性相關(guān)；過表達(dá)可以增強(qiáng)擬南芥的耐旱性。在水稻中，過表達(dá)可促進(jìn)種子萌發(fā)、幼苗生長，并增強(qiáng)水稻對干旱和鹽脅迫耐受性；和在水稻胚乳中特異性表達(dá)，并在水稻種子萌發(fā)時促進(jìn)其對ABA的敏感性。在小麥中，基因在ABA和鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果都表明，基因能夠廣泛參與植物生長發(fā)育的調(diào)控以及逆境脅迫的響應(yīng)。

野生二粒小麥(，2=4=28，AABB)是普通小麥(2=6=42，AABBDD)和栽培四倍體小麥(硬粒小麥)(2=4=28，AABB)A、B染色體組的祖先供體種，具有遺傳資源豐富、粒大、蛋白質(zhì)含量高、抗病、耐逆、耐貧瘠等多種優(yōu)良特性，一直是小麥遺傳改良的重要基因庫。但截至目前，有關(guān)野生二粒小麥基因的研究還未見報(bào)道，這限制了野生二粒小麥基因生物學(xué)功能的深入研究。野生二粒小麥參考基因組的破譯，使得在全基因組水平鑒定和分析其基因家族的組成和特征成為可能。鑒于此，本研究利用最新的野生二粒小麥參考基因組信息，基于全基因組搜索的方法，對野生二粒小麥基因家族在全基因組水平上進(jìn)行了鑒定和分析，并進(jìn)一步對其基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、啟動子順式作用元件以及不同組織和逆境脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為研究野生二粒小麥基因的功能以及了解ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 野生小麥PYL基因家族成員的鑒定

首先，從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)中下載野生二粒小麥參考基因組注釋信息及其所有蛋白序列，將下載到的蛋白序列構(gòu)建本地蛋白庫，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(TAIR, https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp)下載得到的擬南芥14條PYL蛋白序列作為query序列，采用BLASTP工具進(jìn)行blast比對，參數(shù)設(shè)置為1e；同時，從PFAM數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載基因家族的profile模型(PF10604)作為搜索模型，利用HMM 3.0軟件篩選含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白序列；然后，將上述兩種方法篩選到的候選蛋白合并，用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行多序列比對，手工去除不完整讀碼框序列和冗余序列；最后，將得到的蛋白序列提交到PFAM及NCBI-CDD在線工具檢測其保守蛋白結(jié)構(gòu)域，只保留含有完整PYR-PYL-RCAR-like功能域的序列作為最終的野生二粒小麥基因；利用ExPASy(https://www.expasy.org/)在線軟件對野生二粒小麥PYL蛋白的分子量、氨基酸長度和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，利用CELLO軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域 分析

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp )和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中檢索并下載擬南芥和水稻基因序列，利用Clustal_W工具將野生二粒小麥、水稻和擬南芥基因序列進(jìn)行多序列比對，利用MEGA 8.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000；根據(jù)野生二粒小麥基因組gtf注釋信息，獲得各個野生二粒小麥候選基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)信息，并利用在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制示意圖；采用MEME工具(http://meme-suite.org/)預(yù)測各野生二粒小麥PYL蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，并利用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域序列多重比對，比對參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.3 順式作用元件分析

利用TBtools工具(https://github.com/CJ-Chen/TBtools/)截取各個野生二粒小麥基因上游2 kb的基因組序列，然后遞交到啟動子預(yù)測數(shù)據(jù)庫PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行啟動子順式作用元件預(yù)測并手工整理，并對預(yù)測到的順式作用元件進(jìn)行圖形化展示。

1.4 野生二粒小麥PYL基因的組織表達(dá)模式及和逆境脅迫表達(dá)分析

從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)下載野生二粒小麥不同組織以及干旱脅迫下野生二粒小麥品系TR39477和TTD22的RNA-seq數(shù)據(jù)，同時利用本實(shí)驗(yàn)室保留的耐鹽品種A5鹽脅迫下不同時間點(diǎn)的RNA-seq數(shù)據(jù)；采用Hisat 2和StringTie軟件將RNA-seq原始reads與參考基因組進(jìn)行映射(mapping)，并計(jì)算各個基因的FPKM值，然后提取所有24個基因在不同樣本中的FPKM值，并利用Deseq2鑒定差異表達(dá)基因，利用R軟件繪制表達(dá)譜熱圖。

1.5 PYL基因在四倍體小麥中的單倍型分析

從GSA數(shù)據(jù)庫中下載所有四倍體小麥重測序的原始測序數(shù)據(jù)(https://bigd.big.ac.cn/gsa)(CRA001951)和SNP遺傳變異的VCF文件(https://bigd.big.ac.cn/gvm)(GVM000082)。重測序樣本共包含有28份野生二粒小麥、29份栽培二粒小麥和13份硬粒小麥材料；根據(jù)野生二粒小麥基因的染色體位置，從VCF文件中提取每個基因的SNP，并計(jì)算群體中每個基因的單倍型及其數(shù)量，將群體中50%以上樣品具有的單倍型定義為主要單倍型，并比較三個群體中主要單倍型的頻率和比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生二粒小麥PYL基因家族鑒定結(jié)果

利用BLASTP比對和HMM比對兩種方法，從野生二粒小麥基因組中共鑒定到26個候選基因，進(jìn)一步對保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，有2個基因的保守結(jié)構(gòu)域不完整，剔除后最終得到24個包含有完整特征結(jié)構(gòu)域的野生二粒小麥基因。這24個基因不均勻分布在野生二粒小麥1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、4B、7A 和7B染色體上，其中3號染色體組最多，3A和3B染色體上均具有5個，其次是1B染色體，有4個基因；5號和6號染色體組上沒有鑒定到基因(表1)。共發(fā)現(xiàn)有10組同源基因，即A和B同源拷貝均存在，而剩下的4個基因發(fā)生了同源基因的丟失，同時還發(fā)現(xiàn)基因在3號染色體上發(fā)生了明顯的片段復(fù)制，這可能是其擴(kuò)張的潛在原因。

表1 野生二粒小麥PYL家族成員基因信息及其編碼蛋白特征Table 1 Genomic information and characterization of protein encoded by PYL gene family members in wild emmer wheat

序列特征分析發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥基因的蛋白序列長度為123～253 aa，相對分子量為13.14～26.99 kDa，等電點(diǎn)為4.47～8.99，表明基因存在較大的組成變異。同時，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，有7個野生二粒小麥基因定位在葉綠體，1個定位在線粒體，其他16個均位于細(xì)胞核中。

2.2 野生二粒小麥PYL基因的系統(tǒng)進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

為明確野生二粒小麥基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將鑒定到的24個野生二粒小麥基因與已報(bào)道的水稻和擬南芥基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，所有基因聚為3大類，其中Class I中只包含有野生二粒小麥和水稻的基因，而Class II和Class III中包含有野生二粒小麥、水稻和擬南芥的基因，說明Class I的基因可能是單子葉植物特異的。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹及水稻和擬南芥基因家族的分類信息，可將24個野生二粒小麥基因分為三大類，其中Class I亞家族包含9個成員，Class II亞家族包含11個成員，Class III亞家族只有4個成員(圖2a)。

圖1 野生二粒小麥、擬南芥和水稻PYL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖2 野生二粒小麥PYL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(a)、保守基序(b)和基因結(jié)構(gòu)(c)

利用MEME工具對野生二粒小麥基因保守結(jié)構(gòu)域的組成和數(shù)目進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果共鑒定到13個保守的蛋白基序(圖2b)，其中，Class I亞家族均含有基序4、6和7，Class II亞家族均含有基序1、2、3和10，Class III亞家族除了、和只含有基序2外，其余基因均含有基序1、2和3。不同亞家族成員間具有各自特異的保守結(jié)構(gòu)域，但同一亞家族成員具有相似的保守結(jié)構(gòu)域組成，這可能與其具體的生物學(xué)功能相關(guān)，同一亞家族具有相似的生物學(xué)功能。

基因的結(jié)構(gòu)是決定基因表達(dá)和功能的重要因素。對野生二粒小麥基因家族的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2c)發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥家族的基因結(jié)構(gòu)相對簡單，含有的內(nèi)含子很少，其中17個基因只含有1個外顯子，沒有內(nèi)含子。從亞家族來看，每個亞家族成員間的基因結(jié)構(gòu)基本一致，各個亞家族之間存在一定差異，其中Class II亞家族基因與其他亞家族基因相比，內(nèi)含子和外顯子數(shù)目較多，基因結(jié)構(gòu)也較為復(fù)雜。

2.3 野生二粒小麥PYL基因啟動子順式作用元件分析

順式作用元件在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。對鑒定到的24個野生二粒小麥基因的啟動子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，共鑒定到56個順式作用元件，主要與ABA代謝、響應(yīng)逆境和光調(diào)節(jié)相關(guān)(圖3)。ABA響應(yīng)元件ABRE在22個野生二粒小麥基因中被檢測到，平均每個基因中含有3.4個ABRE元件，特別是、和分別有9、7和9個ABRE元件，表明其可能參與了野生二粒小麥ABA代謝調(diào)控過程?；蜻€含有豐富的光調(diào)節(jié)因子元件，如G-box和Sp1等。G-box在21個基因中被檢測到，Sp1在15個基因中被檢測到，暗示這些野生二粒小麥基因的表達(dá)可能受光調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)5個基因有MBS元件，表明這些基因可能還參與逆境脅迫的響應(yīng)。

圖3 野生二粒小麥PYL基因啟動子的順式作用元件

2.4 野生二粒小麥PYL基因在不同組織中的表達(dá)模式

為探究基因在野生二粒小麥生長發(fā)育過程中的潛在功能，利用RNA-Seq數(shù)據(jù)對野生二粒小麥基因在不同組織(根、葉、穗、穎片、外稃、花和種子)的表達(dá)模式進(jìn)行研究。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥基因在不同組織的表達(dá)模式有明顯差異。、、和在出穗 1 cm時的表達(dá)量明顯高于其他組織，而所有的基因在出穗3.5 cm時的表達(dá)量都比較低，表明這些基因可能在野生二粒小麥穗部的形態(tài)建成過程中發(fā)揮重要作用。在根中的表達(dá)量高于其他基因，而在葉中表達(dá)上調(diào)，、和在播種后112 d的穎片中表達(dá)量較高，在播種后112 d的外稃中表達(dá)量較高；、、、和在播種后105 d的花組織中表達(dá)量較高；、、和在播種后123 d的籽粒中表達(dá)較高；、和在播種后134 d的籽粒中表達(dá)量較高。

DS1和DS3.5分別代表出穗1 cm和3.5 cm；Flower_105、Flower_110、Flower_112分別代表105 d、110 d和112 d(均為播種后的天數(shù)，下同)的花組織；Glume_112代表112 d的穎片組織；Grain_123和Grain_134分別代表123 d和134 d的籽粒；Leaf_54和Leaf_57分別代表54 d和57 d的葉片組織；Lemma_112代表112 d的外稃組織；Root_20代表20 d的根組織。

2.5 野生二粒小麥PYL基因在干旱和鹽脅迫下的表達(dá)模式

為挖掘與逆境脅迫相關(guān)的野生二粒小麥基因，以野生二粒小麥的兩個品系TR9477和TTD22為材料，利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果(圖5a)發(fā)現(xiàn)，在TR9477品系中，、和基因在干旱脅迫下的表達(dá)量明顯上升；而在TTD22品系，這3個基因在干旱脅迫下表達(dá)量明顯下降，暗示這3個基因可能與野生二粒小麥的抗旱性相關(guān)，參與了干旱脅迫的響應(yīng)。

a：干旱脅迫；b:鹽脅迫。圖a中，TR39477和TTD22分別代表野生二粒小麥的兩個品系；CK代表對照組；Drought代表干旱處理組；1～5代表生物學(xué)重復(fù)。

進(jìn)一步對這些基因在野生二粒小麥耐鹽品系A(chǔ)5鹽脅迫下5個時間點(diǎn)(0 h、0.5 h、3 h、8 h和27 h)的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果(圖5b)表明，在0.5 h時，同源基因和明顯上調(diào)表達(dá)；在3 h時，、、表達(dá)量均高于其他時間點(diǎn)，其中和是同源基因，表達(dá)模式相同；在8 h時，、、上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量高于其他基因；在27 h時，同源基因和的表達(dá)模式相同，均為上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明，多個基因參與了鹽脅迫的響應(yīng)，而且同源基因通常具有相似的表達(dá)模式，沒有發(fā)生功能分化，這為進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究提供了候選基因。

2.6 野生二粒小麥及其他四倍體小麥PYL基因的單倍型

為了進(jìn)一步探討基因家族在四倍體小麥中的遺傳分化，利用重測序數(shù)據(jù)分析野生二粒小麥、栽培二粒小麥和硬粒小麥基因的遺傳變異和單倍型組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因在這三個群體中具有明顯的遺傳差異，發(fā)生了顯著的遺傳分化。整體上，野生二粒小麥的遺傳多樣性較高，而硬粒小麥的遺傳多樣性較低。15個基因均有主要單倍型，而且其主要單倍型在野生二粒小麥、栽培二粒小麥和硬粒小麥群體中的分布具有明顯的差異(表2)。其中野生二粒小麥中有6個基因的主要單倍型比例低于栽培二粒小麥，有14個基因的主要單倍型低于硬粒小麥，比如的主要單倍型TTCCGG，其在野生二粒小麥的比例為 42.86%，而在栽培二粒小麥和硬粒小麥的比例分別為 75.86%和84.62%；的主要單倍型為AAGGGGCCGGGG，其在野生二粒小麥的比例為35.71%，而在栽培二粒小麥和硬粒小麥的比例分別為55.17%和84.62%，這說明在野生二粒小麥馴化成栽培類型過程中，野生二粒小麥的基因選擇了一些特定的單倍型作為主要單倍型被固定下來。此外，還發(fā)現(xiàn)的主要單倍型為CCCCAACCAA，其在野生二粒小麥和栽培二粒小麥的比例為78.57%和75.86%，而硬粒小麥的比例只有38.46%，這可能是在后期育種改良過程中，部分硬粒小麥中引入了其他來源的變異，降低了該基因的主要單倍型頻率。

表2 PYL基因在四倍體小麥中的主要單倍型組成Table 2 Main haplotype of PYL genes in tetraploid wheat

3 討 論

基因家族在許多植物中已被鑒定分離出來，本研究首次鑒定到野生二粒小麥中的基因，在全基因組范圍中共搜索到24個基因，而在擬南芥和水稻基因組中基因家族的成員分別為13個和12個，均少于野生二粒小麥基因家族的成員數(shù)量?；蛐蛄刑卣鞣治霭l(fā)現(xiàn)，基因的蛋白序列長度、分子量和等電點(diǎn)均存在較大的差異，亞細(xì)胞定位在葉綠體、線粒體和細(xì)胞核中，表明它們可能在不同的微環(huán)境中發(fā)揮著不同的功能。

野生二粒小麥基因聚為3個大類，其中Class I中只包含有野生二粒小麥和水稻基因，而Class II和Class III中包含有野生二粒小麥、水稻和擬南芥基因，說明Class I的基因可能是單子葉植物特有的。同源性較高的基因可能具有相似的功能，如擬南芥、和野生二粒小麥和具有較高的同源性，擬南芥、已被證明能促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的種子萌發(fā)，推測、也可能參與ABA誘導(dǎo)種子萌發(fā)的調(diào)控。

順式作用元件通過響應(yīng)不同外界環(huán)境信號來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育，本研究發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥基因啟動子區(qū)域共有56個不同順式作用元件，主要包括ABA響應(yīng)元件ABRE和光響應(yīng)元件Spl和G-box等，暗示基因在調(diào)節(jié)組織生長和發(fā)育過程中可能受到ABA代謝和光調(diào)節(jié)的影響，這與Kong等的研究結(jié)果一致，此外，本研究還檢測到與MBS等逆境相關(guān)的順式元件，表明野生二粒小麥基因的表達(dá)可由不同的脅迫誘導(dǎo)。

基因家族作為ABA的受體，參與多種ABA有關(guān)的生理反應(yīng)，其中、、、、、、等已經(jīng)被成功驗(yàn)證。在本研究中，大部分野生二粒小麥基因在根、葉、穗、穎片、外稃、花和籽粒等不同組織中廣泛表達(dá)，表明它們可能參與多種生理反應(yīng)。另外，野生二粒小麥TR39477品系中、和在干旱脅迫條件下上調(diào)表達(dá)，表明野生二粒小麥基因可能參與干旱脅迫響應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫的各個時間點(diǎn)(0.5 h、3 h、8 h、27 h)都有不同的基因特異表達(dá)，表明野生二粒小麥基因可能參與鹽脅迫的響應(yīng)過程?？傊吧Ｐ←溁蚣易遄鳛锳BA受體，在野生二粒小麥抵抗逆境脅迫過程中發(fā)揮了作用，但各成員的具體功能需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。對野生二粒小麥、栽培二粒小麥和硬粒小麥基因的遺傳變異和單倍型組成的比較分析發(fā)現(xiàn)，基因在這三個群體中具有明顯的遺傳差異，發(fā)生了顯著的遺傳分化。