潘雨涵，洪 益，徐 肖，欒海業(yè)，朱 娟，呂 超，郭寶健，沈會權(quán)，許如根

(1.植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇揚(yáng)州 225009； 2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224001)

大麥黃花葉病是由大麥黃花葉病毒(barley yellow mosaic virus, BaYMV)、大麥溫和花葉病毒(barley mild mosaic virus, BaMMV)或兩種病毒復(fù)合體引起的病毒病。兩種病毒均屬正義單鏈RNA病毒。病毒以土壤中的禾谷多黏菌()為傳播介體，冬前禾谷多黏菌侵入大麥幼苗的根部并釋放出病毒，病毒隨水分由根部運(yùn)輸至葉片；待翌年春季的氣溫回升到10 ℃以上時(shí)，病毒在葉片內(nèi)快速增殖，破壞葉片的葉綠體造成褪綠斑點(diǎn)。隨病毒數(shù)量的增加，褪綠斑點(diǎn)連成線，繼而連成面，造成葉片黃化、死亡，繼而光合效率下降或光合功能喪失，最終導(dǎo)致大麥減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)70%～80%。大麥黃花葉病于20世紀(jì)70年代由日本傳到中國，首先在沿海和長江中下游大麥區(qū)流行，對大麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響，目前該病害已蔓延到全國大部分麥區(qū)。

抗病品種的選育與推廣是防治大麥黃花葉病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。鑒定篩選抗病種質(zhì)，發(fā)掘定位抗病基因，是培育抗黃花葉病品種的關(guān)鍵。大麥黃花葉病是由主基因控制的性狀，隨著病毒株系的進(jìn)化與變異，原有抗性品種的抗性逐漸喪失，因此需要不斷發(fā)掘新的大麥黃花葉病抗性基因并在育種中加以利用。目前已定位的大麥黃花葉病抗性基因共計(jì)22個(gè)，其中僅有和基因被克隆，和基因來自木石港3號，基因來自Russia 57，基因來自Ragusa。位于大麥4H染色體長臂上，為廣譜抗性，抗歐洲所有大麥黃花葉病毒株系，其抗性是由于感病基因外顯子區(qū)段1 375 bp的序列缺失而無法產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物導(dǎo)致的。Yang等研究表明，基因的30種單倍型中，具有黃花葉病抗性的單倍型僅有7種。位于3H染色體末端，在大麥黃花葉病抗性育種中應(yīng)用廣泛，其抗性是由真核翻譯起始因子基因編碼的氨基酸突變導(dǎo)致，對BaMMV和BaYMV不同毒株的抗性存在差異，目前報(bào)道的基因的單倍型共有67種。本研究以29個(gè)大麥黃花葉病抗性存在差異的大麥品種(系)為材料，對供試品種的和基因單倍型及黃花葉病抗性進(jìn)行分析，并探究供試品種黃花葉病抗性基因單倍型的親緣關(guān)系，以期為大麥品種黃花葉病抗性改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所育成的14個(gè)大麥品種(系)和15個(gè)黃花葉病抗性存在差異的大麥品種(系)為材料，供試材料的名稱和來源見表1。

表1 供試材料的來源及其黃花葉病抗性評價(jià)Table 1 Origin and resistance evaluation of yellow mosaic disease in the test materials

1.2 黃花葉病抗性鑒定

于2019年秋季，將供試材料同時(shí)播種于揚(yáng)州大學(xué)大麥黃花葉病病圃(江蘇揚(yáng)州，32° N，119° E)及江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所大麥黃花葉病病圃(江蘇鹽城，33° N，120° E)。每個(gè)材料種植1行，行長1.5 m，行距0.2 m，每行人工均勻點(diǎn)播10粒，3次重復(fù)。

于2020年春季，參照大麥黃花葉病鑒定標(biāo)準(zhǔn)，對供試材料進(jìn)行大田黃花葉病自然抗性鑒定。每行連續(xù)調(diào)查5株，取平均值。揚(yáng)州試點(diǎn)調(diào)查6期(2020年2月2日、2月10日、2月18日、2月24日、3月4日和3月15日)，取平均值；鹽城試點(diǎn)調(diào)查5期(2020年2月9日、2月18日、2月24日、3月4日和3月15日)，取平均值。根據(jù)發(fā)病的病級判斷黃花葉病抗性，具體標(biāo)準(zhǔn)：平均病級=0.00，免疫；平均病級=0.00～1.00，高抗；平均病級=1.00～2.00，中抗；平均病級=2.00～ 3.00；中感；平均病級=3.00～4.00，高感。

1.3 HvPDIL5-1和 HvEIF4E基因的擴(kuò)增與純化

供試材料均采用植物基因組DNA小量提取法提取DNA。采用20 μL PCR擴(kuò)增體系，包括2 μL (40 ng)基因組DNA、2 μL上、下游引物(表2)、10 μL 2×Green Taq Mix (南京諾唯贊生物科技有限公司)和6 μL ddHO。參考Don等開發(fā)的Touch-down PCR程序，稍加改變進(jìn)行擴(kuò)增，即94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s， 66 ℃退火30 s，72 ℃延伸1～2 min，退火溫度每循環(huán)1次降低1 ℃，直到60 ℃；保持94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1～2 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃冷卻30 s。

表2 本研究所用的引物信息Table 2 Primer information in this study

將目的片段在紫外燈下快速切割，用北京全式金生物公司提供的Easy Pure Quick Gel Extraction試劑盒對供試材料的目的片段進(jìn)行回收純化，純化片段溶于20 μL EB緩沖液中，用NanoDrop進(jìn)行QC檢測和濃度測定，供試材料1～25(名稱見表1)送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測序。供試材料SRY01、Gairdner、日引3號和蘇啤1號的目的片段純化后送至華大基因公司進(jìn)行Sanger測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在NCBI網(wǎng)站下載已公開的大麥基因和的CDS序列，利用Sequencher 5.4.6軟件對測序結(jié)果進(jìn)行整理分析，依據(jù)Yang等的研究結(jié)果，對和基因單倍型的抗性進(jìn)行判斷。依據(jù)的單倍型，利用MEGA X軟件的Neighbor-joining算法對該基因在供試品種間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試大麥品種(系)的黃花葉病抗性表現(xiàn)

由表1可知，2019-2020年度在揚(yáng)州和鹽城試點(diǎn)，大麥黃花葉病發(fā)病普遍較輕，其中高感大麥黃花葉病品種早熟3號和蘇啤1號在兩試點(diǎn)均表現(xiàn)為中抗，比早熟3號和蘇啤1號更感病的品種(系)有Franka、Morex、Bowman、Gairdner、日引3號，其中Gairdner病級最重，在揚(yáng)州和鹽城試點(diǎn)分別為2.78和2.33。其他22個(gè)品種(系)在揚(yáng)州試點(diǎn)均表現(xiàn)為免疫。其中，有9個(gè)品種(揚(yáng)飼麥1號、揚(yáng)飼麥2號、揚(yáng)農(nóng)啤5號、揚(yáng)農(nóng)啤6號、揚(yáng)農(nóng)啤7號、揚(yáng)農(nóng)啤8號、A9187、農(nóng)科2-6和農(nóng)科1-6)在鹽城試點(diǎn)也表現(xiàn)為免疫，其他13個(gè)品種(系)在鹽城試點(diǎn)均有不同程度地感病。

2.2 HvPDIL5-1基因的擴(kuò)增、回收及測序結(jié)果

用引物PDI_45_2138對供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1A和圖1B所示，可以看出，29個(gè)材料均能擴(kuò)增出全CDS區(qū)片段，全長2 093 bp。其中22個(gè)材料可擴(kuò)增出明亮的目的條帶，符合回收純化測序的要求，對目的片段進(jìn)行回收、純化及測序，均獲得測序結(jié)果。但有7份材料(揚(yáng)農(nóng)啤8號、早熟3號、新3109、SRY01、Gairdner、日引3號和蘇啤1號)的條帶均較弱，達(dá)不到純化、回收及測序的要求。因此，進(jìn)一步用引物Till_M56_957和Till_1749_2200對達(dá)不到純化回收測序要求的7個(gè)材料的全CDS區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出1 013 bp和451 bp的目的條帶，擴(kuò)增結(jié)果如圖1C和圖1D所示。2對引物均能擴(kuò)增出明亮的目的條帶，符合回收、純化及測序的要求，對目的片段進(jìn)行回收、純化及測序，均獲得測序結(jié)果。

M1：5 000 bp DNA Marker；M2：2 000 bp DNA Marker。1～29所對應(yīng)的品種(系)名稱見表1。圖3同。M1:5 000 bp DNA Marker; M2:2 000 bp DNA Marker. The names of varieties(lines) corresponding to 1-29 are shown in table 1. The same in figure 3.圖1 29份材料 HvPDIL5-1基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of HvPDIL5-1 gene in the 29 varieties(lines)

2.3 供試材料 HvPDIL5-1基因的單倍型與抗性

由圖2可知，僅木石港3號、A9187和SRY01中基因的外顯子區(qū)存在SNP突變，其中，木石港3號在182 bp處發(fā)生了G→A的非同義突變，為單倍型hap-VII()，該突變使編碼色氨酸的密碼子TGG突變?yōu)門AG(終止密碼子)，導(dǎo)致感病基因提前終止編碼，感病功能丟失，獲隱性黃花葉病抗病性；A9187中基因的外顯子區(qū)存在2個(gè)SNP突變位點(diǎn)，分別在138 bp和374 bp處發(fā)生了A→T的同義突變和C→G的非同義突變，其編碼氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榫彼?，但不影響基因編碼蛋白質(zhì)的功能，為感病單倍型hap-XIII；SRY01在26 bp處發(fā)生了C→A的非同義突變，其編碼氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樯彼?，但不影響基因編碼蛋白質(zhì)的功能，為感病單倍型hap-XVII。

黃色高亮標(biāo)記表示SNP突變位點(diǎn)。圖4同。右側(cè)紅色和綠色羅馬數(shù)字分別表示感病單倍型和抗病單倍型。SNPs are highlighted in yellow. The same in fugure 4. Red and green Roman numerals on the right indicate the haplotypes of susceptible and resistant, respectively.圖2 供試材料 HvPDIL5-1單倍型與黃花葉病抗性Fig.2 Haplotypes of HvPDIL5-1 and resistance to yellow mosaic disease in the test materials

2.4 HvEIF4E基因的擴(kuò)增、回收與測序結(jié)果

利用3個(gè)分段引物(eIF4e_m56 s/309as、eIF4e_1659 s/2394as和eIF4e_4857 s/5396as)對29個(gè)大麥供試材料的基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3A和圖3B所示，由圖3可以看出，所有供試材料均能擴(kuò)增出目的條帶，引物eIF4e_m56 s/309as可擴(kuò)增出365 bp的目的條帶，引物eIF4e_1659 s/2394as可擴(kuò)增出735 bp的目的條帶，引物eIF4e_4857 s/5396as可擴(kuò)增出539 bp的目的條帶，所有條帶均達(dá)到回收、測序要求，對目的片段進(jìn)行回收、純化及測序，均獲得測序 結(jié)果。

圖3 29份材料 HvEIF4E基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of HvEIF4E gene in 29 varieties(lines)

2.5 供試材料 HvEIF4E基因的單倍型與抗性

以大麥基因的野生型hap-wt0A為參考序列進(jìn)行比對，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，供試材料基因外顯子區(qū)的12個(gè)位置出現(xiàn)14種SNP突變，所有SNP均為非同義突變，產(chǎn)生14種單倍型。其中，感病單倍型有：揚(yáng)農(nóng)啤7號、Morex、Bowman和新3109的野生型hap-wt0A；早熟3號的單倍型hap-I；揚(yáng)飼麥3號、木石港3號、農(nóng)科2-6和農(nóng)科1-6的單倍型hap-II；Franka的單倍型hap-IV；揚(yáng)農(nóng)啤2號和揚(yáng)農(nóng)啤8號的單倍型hap-XIV；揚(yáng)農(nóng)啤10號和揚(yáng)農(nóng)啤11的單倍型hap-XX；Gairdner的單倍型hap-XXXVI；A9187的單倍型hap-XLIV；SRY01的單倍型hap-L。抗病單倍型有：揚(yáng)農(nóng)啤9號的單倍型hap-XIII；日引3號和蘇啤1號的單倍型hap-XV；揚(yáng)農(nóng)啤4號、揚(yáng)農(nóng)啤5號、揚(yáng)農(nóng)啤6號、揚(yáng)農(nóng)啤12、蘇B1306、蘇B1403和Ea52為抗病單倍型hap-(攜帶抗大麥黃花葉病基因)?？剐晕粗獑伪缎陀校簱P(yáng)飼麥1號的單倍型hap-XII和御島裸的單倍型hap-XVI。

右側(cè)紅色、綠色和紫色羅馬數(shù)字分別表示感病單倍型、抗病單倍型和未知抗性單倍型。Red, green and purple Roman numerals on the right represent haplotypes of susceptible, resistant and unknown resistance, respectively.圖4 供試材料 HvEIF4E基因的單倍型與黃花葉病抗性Fig.4 Haplotypes of HvEIF4E gene and resistance to yellow mosaic disease in the test materials

2.6 供試材料黃花葉病抗性基因 HvEIF4E單倍型的親緣關(guān)系

根據(jù)黃花葉病抗性基因的單倍型，利用MEGA X軟件構(gòu)建供試材料的進(jìn)化樹(圖5)。其中，單倍型為hap-XIII的揚(yáng)農(nóng)啤9號單獨(dú)聚在一枝，與單倍型為hap-XV的日引3號和蘇啤1號聚在一個(gè)大分枝上，且這兩類單倍型均為抗病型，說明這兩類抗病單倍型親緣關(guān)系較近；單倍型為hap-的揚(yáng)農(nóng)啤4號、揚(yáng)農(nóng)啤5號、揚(yáng)農(nóng)啤6號、揚(yáng)農(nóng)啤12、蘇B1306、蘇B1403和Ea52聚在一個(gè)分枝上，與單倍型為hap-XX的揚(yáng)農(nóng)啤10號和揚(yáng)農(nóng)啤11聚在一個(gè)大分枝上，說明單倍型hap-和hap-XX親緣關(guān)系較近，而hap-為抗病單倍型，hap-XX為感病單倍型，具體原因尚待分析；揚(yáng)飼麥1號為抗性未知單倍型hap-XII，單獨(dú)聚在一枝，與單倍型為hap-XIV的揚(yáng)農(nóng)啤2號與揚(yáng)農(nóng)啤8號聚在一個(gè)大分枝上，而hap-XIV為感病單倍型，推測hap-XII也為感病單倍型；而單倍型為hap-XVI的御島裸單獨(dú)聚為一枝，其親緣關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

圖5 基于供試材料 HvEIF4E基因的單倍型構(gòu)建的的進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the tested materials based on HvEIF4E haplotype

3 討 論

3.1 野生大麥可能是黃花葉病抗性基因的來源之一

基因的所有單倍型中，有7種單倍型抗大麥黃花葉病毒株系BaMMV-ASL，包含一個(gè)來自野生大麥()的單倍型hap-XVIII，表明野生大麥?zhǔn)谴篼滭S花葉病抗性基因的來源之一。Yang等對1 816份大麥種質(zhì)基因的單倍型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9份來自中東地區(qū)的二棱野生大麥種質(zhì)屬于單倍型hap-XIII，單倍型hap-XIII種質(zhì)在人工接種BaMMV-ASL后表現(xiàn)為感?。煌瑫r(shí)，在半野生大麥A9187基因外顯子區(qū)段檢測到對BaMMV-ASL表現(xiàn)為感病的單倍型hap-XLIV。本研究發(fā)現(xiàn)，A9187的基因在外顯子區(qū)存在同義突變和非同義突變，為單倍型hap-XIII，且在揚(yáng)州和鹽城試點(diǎn)對大麥黃花葉病均表現(xiàn)為免疫(平均病級=0.00)，說明A9187雖然不具有BaMMV-ASL病毒抗性，但存在抗江蘇大麥黃花葉病病毒的抗性基因，可進(jìn)一步發(fā)掘該抗病基因，為江蘇大麥黃花葉病抗性品種的培育提供幫助。

Yang等用BaMMV-ASL接種不同來源的大麥種質(zhì)，檢測到基因的感病單倍型hap-XVII和基因的感病單倍型hap-L均來自大麥野生種。本研究在半野生大麥SPY01中也檢測到這兩種感病單倍型。但該品種在揚(yáng)州病圃對大麥黃花葉病表現(xiàn)為免疫(平均病級= 0.00)，在鹽城病圃表現(xiàn)為高抗(平均病級= 0.47)，說明半野生大麥SRY01對BaMMV-ASL病毒不具有抗性，但存在抗江蘇大麥黃花葉病病毒的抗性基因，且其抗性基因不同于和抗性單倍型。

3.2 HvPDIL5-1和 HvEIF4E基因單倍型與供試品種黃花葉病抗性的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，29個(gè)供試大麥品種(系)中，只有木石港3號基因的單倍型hap-XIII對大麥黃花葉病表現(xiàn)為抗病，其余材料的單倍型均表現(xiàn)為感??；29個(gè)供試大麥品種(系)的14種單倍型中，17個(gè)品種(系)有hap-wt0A、hap-I、hap-II、hap-IV、hap-XIV、hap-XX、hap-XXVI、hap-XLIV和hap-L共9種感病單倍型，10個(gè)品種(系)有hap-XIII、hap-XV和hap-共3種抗病單倍型，分別有1個(gè)品種(系)為hap-XII和hap-XV 抗性未知單倍型。從大麥黃花葉病病圃抗性鑒定結(jié)果來看，29個(gè)供試大麥品種(系)中，有20個(gè)品種(系)在揚(yáng)州和鹽城均表現(xiàn)為免疫或高抗，2個(gè)品種(系)在揚(yáng)州表現(xiàn)為免疫、在鹽城表現(xiàn)為中抗。從基因單倍型和供試品種(系)的抗性來看，具有抗性單倍型的品種在江蘇不一定抗大麥黃花葉病，甚至表現(xiàn)為中感，如日引3號基因檢測到抗病單倍型hap-XV，但在揚(yáng)州和鹽城分別表現(xiàn)為中抗和中感，說明江蘇揚(yáng)州和鹽城病圃存在不同的致病 株系。

來自中國木石港3號的是歐洲黃花葉病抗性育種中的主要抗源，高抗大麥黃花葉病毒主要的株系BaMMV-ASL、BaYMV-1和BaYMV-2。啤酒大麥品種(系)揚(yáng)農(nóng)啤4號、揚(yáng)農(nóng)啤5號、揚(yáng)農(nóng)啤6號、揚(yáng)農(nóng)啤12、蘇B1306和蘇B1403均攜帶抗性基因，在揚(yáng)州病圃對大麥黃花葉病均表現(xiàn)為免疫，而除揚(yáng)農(nóng)啤5號和揚(yáng)農(nóng)啤6號外的4個(gè)品種(系)在鹽城病圃對大麥黃花葉病表現(xiàn)為中抗或高抗。大麥黃花葉病抗性基因較多，每一個(gè)抗性基因可能只抗一種或幾種病毒株系，且大麥黃花葉病的病毒株系在不斷變異，不斷產(chǎn)生新的病毒株系，基因的抗病性被克服也被報(bào)道過。2017年之前揚(yáng)州試點(diǎn)鑒定的抗性品種在鹽城試點(diǎn)對大麥黃花葉病也表現(xiàn)為抗病，但本研究發(fā)現(xiàn)，近幾年出現(xiàn)了在揚(yáng)州試點(diǎn)對大麥黃花葉病表現(xiàn)為免疫，而在鹽城試點(diǎn)表現(xiàn)為高抗或中抗的品種，說明鹽城試點(diǎn)可能傳入或產(chǎn)生新的病毒株系，需不斷發(fā)掘黃花葉病抗性基因，以保證大麥黃花葉病抗性育種的可持續(xù)性。

本研究29個(gè)供試大麥品種(系)中，揚(yáng)農(nóng)啤2號、揚(yáng)飼麥3號、揚(yáng)農(nóng)啤7號、揚(yáng)農(nóng)啤8號、揚(yáng)農(nóng)啤10號、揚(yáng)農(nóng)啤11、A9187、農(nóng)科2-6、農(nóng)科1-6和SRY01在揚(yáng)州和鹽城試點(diǎn)對大麥黃花葉病均表現(xiàn)為免疫或高抗，但其和基因均未檢測到抗黃花葉病的單倍型，說明這些品種(系)中含有除和以外的黃花葉病抗性基因，有待進(jìn)一步研究與發(fā)掘；木石港3號基因檢測出抗性單倍型hap-VII(-d)，基因檢測出感病單倍型hap-II，且單倍型hap-II中只有1個(gè)與一致的SNP位點(diǎn)，而Yang等研究發(fā)現(xiàn)，共有3個(gè)SNP位點(diǎn)，因此還需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。