司 雨，肖 紅,楚 萌，劉洋銓，余 航，葉亞瓊，周作紅，張 暉,*

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2. 宜春市畜牧科學(xué)研究所，江西 宜春 336000；3. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

泰和烏骨雞是中國(guó)特色家禽，其肉和蛋具有很高的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)療保健價(jià)值[1-2]。此外，該雞種外貌秀麗奇特，體型優(yōu)美，賞心悅目，具有較高的觀賞價(jià)值，是一種集藥用、滋補(bǔ)、觀賞于一體的珍貴禽類種質(zhì)資源。目前泰和烏骨雞養(yǎng)殖技術(shù)的研究較多，但有關(guān)其組織學(xué)方面的研究較少[3-5]。泰和烏骨雞最獨(dú)特的表型是其體內(nèi)含有大量的黑色素。已有研究表明，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的黑色素具有包括射線保護(hù)和抗氧化等諸多重要生理作用[6-8]。因此，烏骨雞體內(nèi)的黑色素也可能是其發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。黑色素是反映烏骨雞肉質(zhì)的重要標(biāo)志，也是影響市場(chǎng)價(jià)格的重要因素。對(duì)機(jī)體黑色素沉積細(xì)胞學(xué)機(jī)理的研究，有助于調(diào)控黑色素沉積量，提高烏骨雞的藥效作用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]。

在機(jī)體中，皮膚黑素細(xì)胞以L-酪氨酸為底物合成黑色素[10-13]。但L-酪氨酸影響黑色素合成的具體細(xì)胞學(xué)機(jī)理仍然不清楚。肥大細(xì)胞是一種廣泛分布的間質(zhì)細(xì)胞，能夠分泌多種細(xì)胞因子[14]。研究表明，肥大細(xì)胞分泌的5-羥色胺和兒茶酚胺也是黑色素合成的前體物[15-16]。而且L-酪氨酸也是兒茶酚胺合成的底物[17]。然而，有關(guān)L-酪氨酸與肥大細(xì)胞之間的相關(guān)性并不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)在飼料中添加不同濃度的L-酪氨酸，檢測(cè)胸腺內(nèi)肥大細(xì)胞的數(shù)量變化，揭示飼糧L-酪氨酸對(duì)胸腺肥大細(xì)胞的影響，為闡明禽類黑色素生成的機(jī)理提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和方法

選用健康、體重均勻的1日齡泰和烏骨雞180只，隨機(jī)分成6個(gè)組，即對(duì)照組和5個(gè)試驗(yàn)組。試驗(yàn)組飼料中添加不同濃度的L-酪氨酸，分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。試驗(yàn)期為4周。

1.2 組織切片

不同組烏骨雞處死并解剖，取胸腺，剪成小塊，PBS清洗， Bouin氏液中固定。自來(lái)水沖洗固定后的胸腺小塊，上行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，常規(guī)石蠟切片(5 μm厚)。切片二甲苯脫蠟，復(fù)水，HE染色，乙醇脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。BM2000型光學(xué)顯微鏡(江南永新)觀察和拍照。

1.3 甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色

試劑：甲苯胺藍(lán)、高錳酸鉀、蒸餾水、二甲苯、乙醇、中性樹(shù)膠等。

染色步驟：胸腺石蠟組織切片二甲苯脫蠟至水，入甲苯胺藍(lán)染液30 s。染液配制見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。蒸餾水洗切片，95%乙醇分色，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，溫箱烘干。BM2000型光學(xué)顯微鏡觀察、拍照和計(jì)數(shù)。

1.4 觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)

BM2000型光學(xué)顯微鏡觀察肥大細(xì)胞，并對(duì)每個(gè)組織切片隨機(jī)取10個(gè)400倍視野(物鏡40×，目鏡10×)計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 泰和烏骨雞胸腺顯微結(jié)構(gòu)

泰和烏骨雞胸腺表面被覆薄層被膜，被膜結(jié)締組織到達(dá)胸腺深部，將實(shí)質(zhì)分成許多小葉，每一小葉均由外周顏色較淺、淋巴細(xì)胞較少的皮質(zhì)和中央顏色深、淋巴細(xì)胞密集的髓質(zhì)兩部分構(gòu)成，且界線較為清晰(圖1)。髓質(zhì)可見(jiàn)近圓形的胸腺小體，細(xì)胞較少，常見(jiàn)嗜酸性強(qiáng)呈深紅色的粒細(xì)胞(圖1b)。此外，在烏骨雞胸腺內(nèi)分布有黑色素(圖1)。

圖1 泰和烏骨雞胸腺顯微結(jié)構(gòu)和黑色素分布(HE染色)a.胸腺小葉；b.胸腺小葉局部放大 C.皮質(zhì)；M.髓質(zhì)；HC.胸腺小體；→指向黑色素顆粒；┄為皮質(zhì)和髓質(zhì)分界Fig. 1 Microstructure and melanin location of thymus in the silky fowl (HE staining)a. thymic lobule; b. thymic lobule at high magnification C. cortex; M. medulla; HC. hassall corpuscle; → shows melanin;┄ shows the boundary between cortex and medulla

2.2 肥大細(xì)胞形態(tài)與分布特點(diǎn)

甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色顯示，泰和烏骨雞胸腺中存在大量胞質(zhì)為紫紅色的肥大細(xì)胞，多數(shù)呈近圓形，少量呈錐體形(圖2)。胸腺中肥大細(xì)胞主要位于髓質(zhì)，特別是胸腺小體附近(圖2a，2c)。在胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處也有肥大細(xì)胞分布。胸腺髓質(zhì)血管周圍肥大細(xì)胞較為密集(圖2b，2e)。

圖2 不同濃度L-酪氨酸飼喂后胸腺肥大細(xì)胞的分布與形態(tài)(甲苯胺藍(lán)組織化學(xué)染色)a～f.分別為對(duì)照組、0.2%、0.4%、0.8%和1.0%的L-酪氨酸濃度組 HC.胸腺小體；V.血管；→示肥大細(xì)胞；┄ 為胸腺小體。標(biāo)尺=20 μmFig. 2 Location and morphology of thymic mast cells after feeding different concentrations of L-tyrosine (toluidine blue staining)a～f are the control group，L-tyrosine groups with concentration of 0.2%，0.4%，0.8%和1.0%, respectively HC. Hassall corpuscle; V. blood vessels; → indicate mast cells;┄ indicates hassall corpuscle. scale plate=20 μm

2.3 胸腺肥大細(xì)胞數(shù)量

組織化學(xué)染色顯示，各試驗(yàn)組泰和烏骨雞胸腺中均有肥大細(xì)胞分布(圖2)。隨著飼料L-酪氨酸濃度從0.2%開(kāi)始逐漸增加，試驗(yàn)組胸腺肥大細(xì)胞的數(shù)量也逐漸增加；飼料L-酪氨酸濃度0.4%～0.8%組肥大細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，0.8%組肥大細(xì)胞數(shù)量最多，可達(dá)28.8±6.5個(gè)/視野)；然而，當(dāng)飼料L-酪氨酸濃度達(dá)到1.0%時(shí)，與0.8%組比較肥大細(xì)胞數(shù)量明顯下降(P<0.05)，但與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 不同L-酪氨酸濃度對(duì)胸腺肥大細(xì)胞數(shù)量的影響Table 1 Effects of L-tyrosine concentrations on the number of thymic mast cells

3 討 論

肥大細(xì)胞通過(guò)分泌化學(xué)遞質(zhì)和細(xì)胞因子，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用[20-21]。先前有研究表明，雞胚胸腺中有數(shù)量較多的肥大細(xì)胞，且分布位置主要在髓質(zhì)，特別是胸腺小體周圍[22]。在雞胚孵化至第16或17日時(shí)，胸腺中肥大細(xì)胞數(shù)量最多，隨后逐漸減少[22]。在人類胸腺中，肥大細(xì)胞僅限于胸腺髓質(zhì)和結(jié)締組織間隔中，且成人的數(shù)量比胎兒數(shù)量多[23]。在海賽克斯褐雞中研究表明[24]，與0、7、30和120日齡雞相比，21日齡雞胸腺肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增加。胸腺肥大細(xì)胞的數(shù)量可能隨著生理狀態(tài)改變而發(fā)生變化，然而肥大細(xì)胞在胸腺中的具體生理功能仍需進(jìn)一步探索。

本試驗(yàn)中，胚后4周齡的泰和烏骨雞胸腺中仍有大量肥大細(xì)胞分布，數(shù)量可達(dá)14.1±2.8個(gè)/視野。分布位置也多位于髓質(zhì)的胸腺小體或血管周圍。動(dòng)物胚胎期胸腺肥大細(xì)胞可調(diào)控造血干細(xì)胞的發(fā)育和分化[22]，并通過(guò)釋放細(xì)胞因子調(diào)控淋巴細(xì)胞的發(fā)育和成熟，也可調(diào)控胸腺上皮細(xì)胞的功能[25]。泰和烏骨雞胚后4周齡，胸腺中仍有大量肥大細(xì)胞存在，且分布位置與胸腺功能位點(diǎn)相一致，提示泰和烏骨雞胸腺肥大細(xì)胞在胚后仍可能繼續(xù)調(diào)控胸腺的生理功能。研究表明，L-酪氨酸是黑色素和兒茶酚胺合成的底物[10,17]。肥大細(xì)胞可分泌吲哚胺(5-羥色胺)和兒茶酚胺等多種生物胺[14]，且5-羥色胺是黑色素合成的前體物質(zhì)[15]。5-羥色胺也能夠通過(guò)調(diào)控黑色素合成通路相關(guān)因子，影響黑色素的生成[26-27]。此外，兒茶酚胺物質(zhì)——多巴胺可通過(guò)黑素細(xì)胞的β2-腎上腺素受體和cAMP信號(hào)促進(jìn)黑色素合成[16]。這些研究結(jié)果提示，肥大細(xì)胞可通過(guò)釋放多巴胺或/和5-羥色胺影響黑色素的合成。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在適宜的濃度范圍內(nèi)，L-酪氨酸濃度與胸腺肥大細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)。飼喂較多的L-酪氨酸，一方面L-酪氨酸可直接作為黑色素合成的底物；另一方面可能導(dǎo)致肥大細(xì)胞具有充足的底物合成和分泌兒茶酚胺或5-羥色胺，這些物質(zhì)也可作為黑色素合成的前體物，給黑色素合成提供充足的原料，促進(jìn)黑色素生成量。

4 結(jié) 論

飼料L-酪氨酸添加濃度在0～0.8%范圍內(nèi)，隨著L-酪氨酸濃度增加，胸腺肥大細(xì)胞的數(shù)量也增加，并在濃度0.8%時(shí)肥大細(xì)胞達(dá)到峰值，提示在適宜濃度范圍內(nèi)，L-酪氨酸可促進(jìn)胸腺肥大細(xì)胞的成熟和發(fā)育。肥大細(xì)胞可合成和釋放兒茶酚胺，這些物質(zhì)是黑色素合成的前體物質(zhì)，因此L-酪氨酸可能通過(guò)增加肥大細(xì)胞數(shù)量，提升兒茶酚胺水平，促進(jìn)黑色素的合成。本試驗(yàn)結(jié)果有助于理解禽類體內(nèi)黑色素生成的細(xì)胞學(xué)機(jī)理。