唐克峰 李 志 夏莉花 舒 艷 胡 剛 方 嶸 沈國松

低磷酸酯酶癥（hypophosphatasia，HPP）是一種由于編碼組織非特異性堿性磷酸酶（tissue non-specific alkaline phosphatase，TNSALP）的堿性磷酸酯酶基因（alkaline phosphatase gene，ALPL）變異導(dǎo)致的罕見常染色體顯性或隱性遺傳病，臨床表現(xiàn)主要是骨骼和牙齒礦化不全以及血清堿性磷酸酶（ALP）活性偏低[1]。重癥HPP 的發(fā)病率大概為十萬分之一，輕度HPP 較多見，血清ALP 活性和分子遺傳學(xué)是最常用的診斷方法，目前尚無可靠的治療方法[2]。本研究中，我們對1 例骨骼發(fā)育異常胎兒的染色體核型、全基因組拷貝數(shù)變異以及骨骼系統(tǒng)相關(guān)基因的致病性變異進(jìn)行分析，為其產(chǎn)前診斷提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，24 歲，停經(jīng)19+2W，唐氏篩查高風(fēng)險（1/180），產(chǎn)前診斷超聲（超聲儀器是GE，volusionE8，超聲頻率3.5～5MHz，檢查方法：超聲探頭尋找胎兒上肢，顯示完整肱骨，盡量讓聲束與肱骨垂直，正常肱骨是平直的，成角的肱骨顯示肱骨分成兩條有角度的強(qiáng)回聲。股骨也是同樣的方法顯示。）顯示股骨及肱骨彎曲成角（見圖1）。余無殊。夫妻否認(rèn)近親結(jié)婚，家族中無類似病史。所有研究對象均已簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)（2019-R-016）。

圖1 胎兒產(chǎn)前診斷超聲圖（A：胎兒左肱骨成角；B：胎兒右肱骨成角；C：胎兒左股骨成角；D：胎兒右股骨成角）

1.2 方 法

1.2.1 常規(guī)染色體核型分析 無菌條件超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水細(xì)胞30mL，并對羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、制片、G 顯帶核型分析。

1.2.2 染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA）檢測 利用Affymetrix Cytoscan 750k 芯片（CYTOSCAN 750K ARRAR AND R p/n 901859）檢測羊水細(xì)胞全基因組不平衡現(xiàn)象。

1.2.3 應(yīng)用DNA 提取試劑盒（廈門至善生物公司，批號200517）提取胎兒、孕婦及其丈夫外周血的基因組DNA，利用紫外分光光度計測量待檢DNA 濃度及純度，取一定量的DNA 原液稀釋成20ng/μL 的工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆?，DNA 原液-70℃保存。使用Aligent SureSelect 方法制備檢測樣本。文庫采用Illumina HiSeq X-Ten 系統(tǒng)完成高通量測序。利用FastQC、BWA（v0.7.15-r1140）、Picard、GATK（v3.7-0）、Annovar 及VEP 等軟件包進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)合人群基因變異數(shù)據(jù)庫（dbSNP 數(shù)據(jù)庫（SNP150）、千人基因組數(shù)據(jù)庫等）信息，去除MAF＞0.01 或MAF＞0.05 的高頻變異。參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關(guān)指南[3]，并篩選出與先證者表型相關(guān)的可疑致病性變異。針對篩選出的可疑致病基因變異，利用Primer 3 軟件設(shè)計PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger 測序分析。采用Mutation Surveyor等軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。孕婦及其丈夫、胎兒DNA 樣本測序結(jié)果進(jìn)行家系共分離分析。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)染色體檢型分析結(jié)果 胎兒羊水染色體核型分析結(jié)果為46，XN。

2.2 CMA 檢測結(jié)果 未發(fā)現(xiàn)致病性拷貝數(shù)變異、雜合性缺失及單親二倍體。

2.3 基因檢測結(jié)果 提示胎兒ALPL 基因存在第2外顯子c.18del 和第9 外顯子c.979T＞C 復(fù)合雜合變異（見圖2）。其中c.18del 為移碼變異，屬于功能缺失性變異，功能預(yù)測軟件結(jié)果偏向于致病性變異，根據(jù)ACMG 指南[3]分析該變異致病性為P（致病性變異）=PM2（ESP 數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、EXAC 數(shù)據(jù)庫中正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異）+PM3（在隱性遺傳病中，在反式位置上檢測到致病變異）+PVS1（當(dāng)一個疾病的致病機(jī)制為功能喪失時，無功能變異）。c.979T＞C為錯義變異，功能預(yù)測軟件結(jié)果偏向于致病性變異，預(yù)測值為0.991。根據(jù)ACMG 指南[3]分析該變異致病性為P（致病性變異）=PM2（ESP 數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、EXAC 數(shù)據(jù)庫中正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異）+PM3（在隱性遺傳病中，在反式位置上檢測到致病變異）+PS3（體內(nèi)、體外功能實驗已明確會導(dǎo)致基因功能受損的變異）+PP3（多種統(tǒng)計方法預(yù)測出該變異會對基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響，包括保守性預(yù)測、進(jìn)化預(yù)測、剪接位點影響等）。ALPL 基因轉(zhuǎn)錄本為NM_000478.4。

圖2 堿性磷酸酯酶基因Sanger 測序示意圖

2.4 孕婦夫婦相關(guān)基因驗證結(jié)果 孕婦為c.18del雜合變異攜帶者，其丈夫為c.979T>C 雜合變異攜帶者（見圖2）。

3 討論

HPP 是一種罕見遺傳性代謝性骨病，不同的基因變異位點對于酶的生物學(xué)功能影響程度不一導(dǎo)致臨床表現(xiàn)多種多樣[4]。根據(jù)患者最早出現(xiàn)癥狀的年齡和嚴(yán)重程度將HPP 分為圍產(chǎn)期致死型、圍產(chǎn)期良性型、嬰幼兒型、兒童型、成人型和牙齒型，鑒于目前沒有根治方法，該病的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷顯得尤為重要。其中圍產(chǎn)期致死型表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨骼礦化障礙，胎兒存在發(fā)育遲緩、骨骼成角等骨骼畸形，通常導(dǎo)致死胎或新生兒死亡[5]。

ALPL 是HPP 的致病基因，位于染色體1p36.1，包含12 個外顯子，編碼524 個氨基酸，在基因組中跨度約50kb，其mRNA 長度為2580bp，開放讀框ORF 長度為1575bp。截至2020 年5 月29 日，國際上建立的低磷酸酯酶癥基因變異數(shù)據(jù)庫（http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php）已報道了410 個ALPL 基因變異，變異類型絕大部分為錯義變異共292 種（占71.2%），缺失變異有45 種（占11.0%），其它還包括剪切變異、插入變異、無義變異等多種變異類型，變異分布于ALPL 基因各編碼區(qū)，在外顯子5區(qū)域發(fā)生變異頻率最高。Mornet[6]研究發(fā)現(xiàn)HPP 患者ALPL 基因變異中9 號外顯子變異相對較多，提示可能存在種族差異。95%的HPP 可檢測到ALPL 基因變異，即使未檢測到ALPL 基因變異，也有可能變異位于內(nèi)含子區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)，當(dāng)然也可能存在新的致病基因[7]。ALPL 基因編碼的TNSALP 是一種廣泛存在于各類組織的磷酸單酯酶，在骨骼礦化作用中表現(xiàn)為催化和水解焦磷酸并產(chǎn)生羥磷灰石結(jié)晶需要的磷，該酶活性降低可以引起無機(jī)焦磷酸酶鹽等多種底物蓄積，從而引起骨軟化或者佝僂病[8]。

本研究中對1 例胎兒超聲發(fā)現(xiàn)骨骼成角異常的孕婦進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷，其中羊水細(xì)胞染色體核型為46，XN，羊水細(xì)胞CMA 檢測未發(fā)現(xiàn)致病性拷貝數(shù)變異、雜合性缺失及單親二倍體。骨骼系統(tǒng)相關(guān)基因檢測提示胎兒ALPL 基因存在第2 外顯子c.18del和第9 外顯子c.979T＞C 復(fù)合雜合變異。其中c.18del為移碼變異，屬于功能缺失性變異，該變異導(dǎo)致ALPL 基因編碼的第7 位氨基酸纈氨酸變成酪氨酸，且繼續(xù)編碼12 個氨基酸后終止翻譯，產(chǎn)生的截斷蛋白喪失了發(fā)揮酶活性及骨骼礦化作用至關(guān)重要的區(qū)域。該變異十分罕見，僅有劉海娟等[9]報道了1 例兒童型低磷酸酶血癥患者存在c.18del 和c.G407C 復(fù)合雜合變異，但c.G407C 變異臨床意義不明確，患兒臨床表現(xiàn)為門齒脫落，雙側(cè)橈骨、右股骨彎曲畸形，右下肢較左下肢短等，血ALP 19U/L（正常值42～390U/L），長骨彎曲表現(xiàn)與本研究一致。另一個變異c.979T＞C 為錯義變異，功能預(yù)測軟件結(jié)果偏向于致病性變異，導(dǎo)致ALPL 基因編碼的第372 位氨基酸苯丙氨酸變成亮氨酸，從而影響了酶的活性。該變異有多例HPP 患者文獻(xiàn)報道，其中有13 例是c.979T＞C與c.1559delT 致病性變異形成的復(fù)合雜合變異[10]，并且功能實驗提示該變異會導(dǎo)致酶的活性降低至野生型的70%左右[11]。研究表明，在HPP 患者中觀察到的表型異質(zhì)性極高，主要是由于ALPL 基因的錯義變異導(dǎo)致殘余酶活性不同引起的[12]。上述ALPL 基因兩個變異分別來自父母雙方，符合常染色體隱性遺傳病，結(jié)合胎兒超聲提示的股骨和肱骨各自成角表現(xiàn)，診斷胎兒為首例c.18del 和c.979T＞C 復(fù)合雜合變異的HPP。由于嚴(yán)重的圍生期致死型，可以引起骨骼礦化異常而導(dǎo)致死產(chǎn)，或者出生后新生兒期因骨骼畸形、鈣磷代謝異常、廣泛礦化不良或者肺發(fā)育不良而死亡[13]。孕婦最終選擇引產(chǎn)，引產(chǎn)后我們對死胎進(jìn)行全身X 線檢查，顯示肱骨、尺骨、橈骨以及股骨、脛骨皆有成角彎曲現(xiàn)象（見圖3），提示預(yù)后不良。而產(chǎn)前診斷超聲只顯示肱骨和股骨彎曲，可能是由于胎兒在體內(nèi)體位原因?qū)е履承┕趋喇惓ｏ@示不清。由于該病呈常染色體隱性遺傳方式，所以本例夫婦再生育胎兒患病風(fēng)險為25%，可嘗試自然懷孕后適時產(chǎn)前診斷或者直接選擇第三代試管獲得健康嬰兒。

圖3 死胎全身X 線圖（四肢長骨彎曲成角）

綜上所述，ALPL 基因存c.18del 和c.979T＞C 復(fù)合雜合變異很可能是這例HPP 胎兒的骨骼異常原因，為HPP 的遺傳咨詢以及產(chǎn)前診斷提供了可靠的依據(jù)。