鄒新梅 王 洋 鐘麗萍 李 雷

我國是胃癌的高發(fā)國家之一，年新發(fā)病例約40萬例，2009 年數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，胃癌年新發(fā)病例約占全部癌癥的7.8%，約99 萬例[1]。既往研究證實，胃黏膜長期慢性炎癥刺激是導(dǎo)致胃癌發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素之一[2-3]。幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）可介導(dǎo)CagA 基因及對上皮細(xì)胞保護(hù)層具穿透能力的HtrA 的蛋白酶等毒性因子表達(dá)，參與激活胃黏膜組織免疫及炎癥反應(yīng)引發(fā)黏膜受損，甚至萎縮，故Hp 感染與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸受到廣泛的關(guān)注[4]。Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）家族由損傷相關(guān)分子模式和多種特異性識別病原相關(guān)分子模式的跨膜蛋白組成，可識別真菌、細(xì)菌和病毒等微生物，其中TLR2 和TLR4 與Hp 識別、激活的下游炎性因子表達(dá)及癌前病變密切相關(guān)[5]，但在胃癌患者中Hp 的感染是否與TLR2 和TLR4 的表達(dá)相關(guān)，且其異常表達(dá)的臨床意義仍缺乏相關(guān)報道?；诖耍狙芯恳晕赴┗颊邽檠芯繉ο?，以期探討感染和非感染Hp 的胃癌患者TLR2 和TLR4 的表達(dá)差異及臨床意義，旨在更好地了解Hp 感染與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為后續(xù)臨床早期篩查提供新思路。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取浙江省湖州市第三人民醫(yī)院和湖州市中心醫(yī)院2013 年9 月—2015 年3 月收治的胃癌患者128 例[取病灶組織128 例（病灶組）和癌旁正常組織90 例（癌旁組），癌旁組織與病灶組織距離>2cm]和胃黏膜增生患者（增生組）68 例。本次研究所納入病例經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，審批號：（2018）倫審第037 號。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均在術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為胃癌；（2）患者自愿簽署知情同意書；（3）入組前4 周未進(jìn)行抗Hp 治療；（4）預(yù)計生存期>6個月者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴嚴(yán)重肝、腎功能障礙者；（2）胃癌復(fù)發(fā)者；（3）伴嚴(yán)重心腦血管疾病者。

2 方 法

2.1 Hp 感染情況檢查 采用C-14 呼氣試驗測定入組患者Hp 感染情況，具體方案為：（1）患者需口服C-14 尿素膠囊，而后由科室責(zé)任護(hù)士負(fù)責(zé)采集患者呼出氣體100mL，并C-14 紅外線能譜儀（北京格物時代科技發(fā)展有限公司）進(jìn)行檢測，DOB 值>2.5 則判斷為陽性。

2.2 TLR2、TLR4 表達(dá)檢測 取適量石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，并以3min/次的頻率進(jìn)行PBS 沖洗，共沖洗3 次。將組織切片置于耐高溫塑料切片架上，采用微波加熱pH=6.0 的檸檬酸鹽緩沖液，待沸騰后放入已沸騰的緩沖液中，10min 后以3min/次的頻率沖洗2 次，隨后采用PBS 進(jìn)行2 次沖洗，每次3min。室溫下孵育10min。采用免疫組化染色（SP）檢測TLR2、TLR4 的表達(dá)情況。方法為：加一抗1∶200 后4℃過夜，次日加辣根過氧化物酶進(jìn)行二抗孵育。采用已知TLR2、TLR4 陽性切片作為陽性對照。SP 檢測試劑盒購置于上海研啟生物科技有限公司。結(jié)果判定：保證每個視野下需不低于100 個細(xì)胞，并隨機(jī)選取5 個400 倍視野。陽性判定方法：兩項分?jǐn)?shù)相乘結(jié)果＞1 即陽性，無色為0 分，淺黃色著色味1 分，棕黃色著色味2 分；視野內(nèi)陽性細(xì)胞百分比≤10%為0 分、＞10%～25%為1 分、＞25%～50%為2 分、＞50%～75%為3分、＞75%為4 分。并分析TLR2、TLR4 的陽性表達(dá)與胃癌患者年齡、TNM 分期、分化程度、病理分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；采用Cox 回歸模型分析Hp 感染性胃癌患者預(yù)后的影響因素；采用ROC 曲線分析預(yù)測Hp 感染性胃癌患者的價值；采用Kaplan-Merier 進(jìn)行生存分析。

2.3 隨訪方案 患者出院后采用電話聯(lián)系形式對其進(jìn)行為期5 年的隨訪，以患者死亡作為終點事件，記錄并統(tǒng)計隨訪人員生存期。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Person 進(jìn)行相關(guān)性分析；預(yù)后影響分析采用Cox 回歸模型；并繪制受試者工作曲線（ROC 曲線）。采用Kaplan Meier 法進(jìn)行生存分析，組間比較采用Log-rank 檢驗，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三組受試者一般資料比較 三組受試者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 三組受試者一般資料比較

3.2 三組受試者TLR2、TLR4 表達(dá)陽性率比較 胃癌組TLR2、TLR4 的陽性率均顯著高于癌旁組和增生組（P<0.05），見表2。

表2 三組受試者TLR2、TLR4 表達(dá)陽性率比較[例（%）]

3.3 Hp 陽性和Hp 陰性胃癌患者TLR2、TLR4 表達(dá)陽性率比較 Hp 陽性組TLR2、TLR4 的陽性率均顯著高于Hp 陰性組（P<0.05），見表3。

表3 Hp 陽性和Hp 陰性胃癌患者TLR2、TLR4 表達(dá)陰性率比較[例（%）]

3.4 TLR2、TLR4 表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Hp 感染水平與TLR2（r=0.697，P=0.00）和TLR4（r=0.684，P=0.00）均呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。TNM 分期越高、分化程度越高和伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其Hp 陽性率、TLR2 和TLR4的陽性率更高（P<0.05），見表4。

表4 TLR2、TLR4 表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3.5 Hp 感染性胃癌患者預(yù)后Cox 回歸分析 以Hp感染性胃癌患者預(yù)后死亡為因變量，以TNM 分期（Ⅰ-Ⅱ期=0，Ⅲ-Ⅳ期=1）、分化程度（低+中分化=0，高分化=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無轉(zhuǎn)移=0，轉(zhuǎn)移=1）、TLR2陽性、TLR4 陽性為因變量納入多因素Cox 回歸模型，結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅲ-Ⅳ期、高分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TLR2 陽性、TLR4 陽性均為影響胃癌患者死亡的獨立危險因素（P＜0.05），見表5。

表5 Hp 感染性胃癌患者預(yù)后Cox 回歸分析

3.6 TLR2、TLR4 預(yù)測Hp 感染性胃癌預(yù)后的ROC曲線分析 ROC 結(jié)果顯示，擬合TLR2、TLR4 預(yù)測胃癌患者預(yù)后的靈敏度和特異性高達(dá)92.31%和91.67%。見表6 和圖1。

表6 TLR2、TLR4 預(yù)測Hp 感染性胃癌預(yù)后的ROC 曲線分析

圖1 TLR2、TLR4 預(yù)測Hp 感染性胃癌預(yù)后的ROC 曲線分析注：TLR2 為Toll 樣受體2；TLR4 為Toll 樣受體4；Hp 為幽門螺桿菌

3.7 TLR2、TLR4 的表達(dá)與生存期的關(guān)系 入組患者均隨訪60 個月，TLR2 陽性患者中位生存期21 個月，TLR2 陰性患者中位生存期36 個月；TLR4 陽性患者中位生存期23 個月，TLR2 陰性患者中位生存期37 個月（P＜0.05）。

4 討論

胃癌發(fā)病率高居我國消化道惡性腫瘤榜首。研究發(fā)現(xiàn)，我國居民篩查意識較差，而胃癌早期多無特異性癥狀，故就診時病情多已進(jìn)展至晚期[6]。手術(shù)+放化療的綜合方案是現(xiàn)階段胃癌的主要治療方案，但晚期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險顯著更高，5年生存率不足25%。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）認(rèn)為，Hp 是導(dǎo)致胃癌發(fā)生發(fā)展的Ⅰ類致癌因素[7]。本次研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者中Hp 陽性率顯著高于陰性率，提示伴Hp 感染者可能具更高胃癌發(fā)病風(fēng)險。本課題發(fā)現(xiàn)，TNM 分期越高、分化程度越高和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其Hp 陽性率明顯更高，提示在Hp持續(xù)感染可能為胃癌進(jìn)行性發(fā)展的獨立危險因素。新近研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜炎癥反應(yīng)的啟動和持續(xù)惡化參與介導(dǎo)了胃癌的癌前病變和病情惡化，而Hp 感染可能為胃黏膜炎癥反應(yīng)的啟動因素[8]。

Toll 樣受體在人體中包含11 種亞型，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中模式識別受體，可識別DAMPs 和PAMPs，其中TLR2 和TLR4 是主要位于質(zhì)膜上的Toll 受體蛋白，可通過調(diào)控下游MyD88，進(jìn)而激活NF-κB 引發(fā)下級炎癥鏈級反應(yīng)[9]。Jenkins 等[10]證實，TLR2/4 表達(dá)上調(diào)后可分泌IFN-γ，引起T 細(xì)胞的增殖擴(kuò)散，而炎癥通過TLR2/4 誘導(dǎo)的內(nèi)源性介質(zhì)進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。動物實驗發(fā)現(xiàn)，TLR2/4 mRNA高表達(dá)于肝癌組織，且在分化程度更高的胃癌細(xì)胞中表達(dá)明顯更高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組TLR2/4 的陽性率顯著高于癌旁組和增生組，這預(yù)示著TLR2/4的過表達(dá)激活的炎癥反應(yīng)可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，但二者的表達(dá)是否與Hp 感染性胃癌有關(guān)仍尚未明確。

本實驗結(jié)果顯示，Hp 陽性組TLR2/4 的陽性率顯著高于Hp 陰性組，提示Hp 持續(xù)感染誘發(fā)的炎癥反應(yīng)可能與TLR2/4 的表達(dá)上調(diào)有關(guān)?？紤]TLR 家族作為機(jī)體天然免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白，在病毒和細(xì)菌等外來應(yīng)激作用下可激活機(jī)體炎癥反應(yīng)從而促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Hp 感染相關(guān)性胃炎TLR2/4基因突變型表達(dá)量明顯低于野生型，這預(yù)示著TLR2/4 可作為Hp 感染患者進(jìn)一步篩查的血清標(biāo)志物[12]。相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hp 感染與TLR2/4 的表達(dá)密切相關(guān)，表明Hp 感染引發(fā)的慢性炎癥可能通過激活TLR2/4 信號通路表達(dá)促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展。我們發(fā)現(xiàn)Ⅲ－Ⅳ期比Ⅰ－Ⅱ期、高分化比分化程度較低、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TLR2/4 的陽性率前者均明顯更高，這與Paarnio 等[13]在結(jié)直腸癌患者中研究結(jié)果基本一致。考慮Hp 感染后誘發(fā)的炎癥反應(yīng)激活TLR2/4 的表達(dá)，使正常組織異常裂解和凋亡引起癌前病變，且在腫瘤發(fā)展過程中持續(xù)的炎癥微環(huán)境使TLR2/4 長期處于高水平表達(dá)，這有利于激活下游β-catenin 基因、p53 和PIK3CA 等增殖、侵襲基因的表達(dá)[14]。Fan 等[15]證實，肝癌患者腫瘤細(xì)胞中TLR2/4 的過表達(dá)與增殖相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān)。為進(jìn)一步證實我們以預(yù)后死亡為因變量，TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TLR2 陽性和TLR4 陽性為因變量納入多因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)，上述因素均為影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素?？紤]在引發(fā)胃癌患者預(yù)后死亡因素中腫瘤的復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移扮演了尤為重要的角色，而隨分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)展，患者經(jīng)手術(shù)切除病灶后由于腫瘤微環(huán)境的形成，若病灶未完全根除其復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)后形成轉(zhuǎn)移灶風(fēng)險明顯更高[16]。鄧靖宇和梁寒[17]報道顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。為進(jìn)一步明確TLR2/4 在胃癌病情評估中的價值，以預(yù)測概率做ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合TLR2/4 的診斷敏感度和特異性高達(dá)92.31%和91.67%，證實TLR2/4 可作為評估胃癌患者病情的潛在血清標(biāo)志物。我們隨訪發(fā)現(xiàn)，Hp陽性組生存期明顯短于陰性組，進(jìn)一步證實TLR2/4不僅可用于胃癌的早期評估，還可作為預(yù)測其預(yù)后的可靠血清標(biāo)志物。

綜上所述，Hp 感染是導(dǎo)致胃癌發(fā)生發(fā)展的高風(fēng)險因素，其可通過激活TLR2 和TLR4 的表達(dá)持續(xù)激活胃黏膜炎癥反應(yīng)，從而參與腫瘤的發(fā)生及惡性發(fā)展，且TLR2 和TLR4 可作為胃癌早期診斷及預(yù)后評估的可靠血清標(biāo)志物，但本次實驗仍存在樣本量過少的不足之處，今后需進(jìn)一步設(shè)置高質(zhì)量的前瞻性實驗予以論證。