姚玲莉 王金秋 葉 丹 盛賢能 郭 宇

乳腺增生癥是女性常見的乳房疾病，發(fā)病率約為79.5%[1]。其本質(zhì)是雌孕激素比例失調(diào)下的腺體增生與復(fù)舊不良。目前以藥物治療為主，如三苯氧胺、小金丸、乳癖消等。有研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草顆粒對治療乳腺增生癥具有積極意義[2]。在超聲提示下，夏枯草顆?？捎行p小增生乳腺組織的腫塊直徑、導(dǎo)管直徑和腺體厚度[3]，達(dá)到較好的治療效果。但由于缺少夏枯草顆粒作用于乳腺增生組織的理論依據(jù)，未能廣泛應(yīng)用于乳腺增生的治療。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示，雌激素過度刺激背景下，乳腺組織增生與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）高表達(dá)相關(guān)[4-5]。本研究探討夏枯草顆粒在乳腺增生組織中的作用及作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 育齡期雌性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量180～220g，購自浙江維通利華責(zé)任有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001。飼養(yǎng)于寧波大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證號：SYNK（浙）2019-0005。環(huán)境溫度20～25℃，相對濕度40%～60%，12h循環(huán)燈光，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核，對動(dòng)物處置方法符合相關(guān)倫理要求。

1.2 試 劑 苯甲酸雌二醇及黃體酮注射液購于購于吉林華牧有限公司（規(guī)格2mL：4mg，批號 200222；規(guī)格2mL：20mg，批號Z00302）；夏枯草顆粒購自山東仙河藥業(yè)有限公司（批號00860E2）。兔源性Bcl-2、Bcl-2 相關(guān)x 蛋白（Bax）、PCNA 單克隆抗體（江蘇親科生物有限公司，批號1109905、44q6915、64y1542）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物乳腺增生模型制備 30 只雌性育齡期SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組5 只，乳腺增生模型組25 只。乳腺增生模型組貫序肌注苯甲酸雌二醇0.5mg/kg 25 天及黃體酮4mg/kg 5 天[6]。同時(shí)，正常對照組肌注同體積生理鹽水連續(xù)30 天。

2.2 分組及給藥 將乳腺增生模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對照組、三苯氧胺組及夏枯草顆粒低、中、高劑量組，每組5 只。三苯氧胺組大鼠予三苯氧胺1.8mg/kg 溶液灌胃；夏枯草顆粒低、中、高劑量組大鼠分別予夏枯草顆粒0.5、1.0、3.0g/kg 溶液灌胃；正常對照組及模型對照組大鼠予同體積生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)28 天。

2.3 取材與制作石蠟切片 末次給藥1 周后，禁食24h，六組大鼠同時(shí)處死，并觀察乳房形態(tài)，取相同部位乳房（第四對左側(cè)乳房）組織，經(jīng)乳頭向基底部最大切面取材。以4%多聚甲醛固定24h 后將乳腺組織修剪為0.5cm×0.5cm×0.5cm，放入至石蠟包埋，石蠟塊切片厚度4μm，制病理切片。使用蘇木精-伊紅（HE）染色法對石蠟切片進(jìn)行染色，在光鏡下觀察乳腺組織病理變化。

2.4 卵白素-生物素-過氧化酶復(fù)合法（ABC 法）測定乳腺組織Bcl-2、Bax、PCNA 表達(dá) 將大鼠乳腺組織切片進(jìn)行脫蠟補(bǔ)水，加熱、抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，每次5min。3%H2O2去離子水孵育，阻斷內(nèi)源過氧化酶活性。加血清封閉，加入一抗4℃下孵化過夜，PBS 沖洗3 次；加二抗，室溫孵育50min，PBS 沖洗3 次；滴加生物素化過氧化酶復(fù)合物，孵育30min，PBS 沖洗3 次。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑顯色。流水沖洗、干燥、脫水、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察、獲取圖像、分析。

2.5 結(jié)果判斷（1）HE 染色：低倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)小葉內(nèi)腺泡數(shù)量，求出平均值。高倍鏡下觀察乳腺組織，計(jì)數(shù)增生體平均腺泡數(shù)量以及擴(kuò)增導(dǎo)管數(shù)量。（2）免疫組化陽性細(xì)胞強(qiáng)度分析：用賽維爾圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)讀取組織測量區(qū)域，并分析計(jì)算出測量區(qū)域內(nèi)弱中強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)（陰性無著色，計(jì)0 分；弱陽性淡黃色，計(jì)1 分；中陽性棕黃色，計(jì)2 分；強(qiáng)陽性棕褐色計(jì)3分），總細(xì)胞數(shù)，陽性的累積光密度，陽性像素面積，組織面積。將每張切片內(nèi)陽性數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，計(jì)算組織化學(xué)評分（HS），數(shù)值越大說明綜合陽性強(qiáng)度越強(qiáng)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用單因素方差分析，以LSD 法進(jìn)行兩兩組間多重比較，應(yīng)用Graphpad prism 8.0.2 制圖。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠乳腺組織病理學(xué)變化 低倍鏡下正常對照組平均小葉內(nèi)腺泡數(shù)3～6 個(gè)，高倍鏡下乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，管腔無擴(kuò)張，腔內(nèi)未見分泌物及脫落細(xì)胞。模型對照組中，小葉腺泡數(shù)量明顯增加，多者達(dá)30 個(gè)，部分小葉被腺泡充滿，管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)充滿分泌物并伴有少量脫落上皮細(xì)胞。導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生且排列稍不規(guī)則，呈假復(fù)層或乳頭狀，同時(shí)核仁明顯。提示乳腺增生造模成功。低倍鏡下觀察，三苯氧胺組纖維組織增生明顯，小葉腺泡數(shù)5～10個(gè)，導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，未見明顯增生，管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)見少許分泌物及脫落上皮細(xì)胞；夏枯草低劑量組纖維組織稍增生，小葉腺泡數(shù)量較多8～15 個(gè)，導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，未見明顯細(xì)胞增生，腔內(nèi)見少許分泌物但未見明顯脫落上皮細(xì)胞；夏枯草中、高劑量組，乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，未見明顯細(xì)胞增生，部分接近正常對照組，部分仍可見管腔擴(kuò)張，但管腔內(nèi)分泌物較少，可見少量脫落上皮細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組大鼠乳腺組織增生病理（HE ×400）

3.2 各組大鼠乳腺組織平均腺泡導(dǎo)管數(shù)及擴(kuò)張導(dǎo)管數(shù)比較 與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織平均腺泡導(dǎo)管數(shù)及擴(kuò)張導(dǎo)管數(shù)明顯增多（P 均<0.01）。與模型對照組比較，夏枯草低、中、高劑量組及三苯氧胺組大鼠乳腺組織腺泡導(dǎo)管數(shù)減少（P 均<0.05），并且三苯氧胺及高劑量組的平均腺泡導(dǎo)管數(shù)最接近正常對照組。見表1。

表1 各組大鼠乳腺組織平均腺泡導(dǎo)管數(shù)及擴(kuò)張導(dǎo)管數(shù)比較（）

表1 各組大鼠乳腺組織平均腺泡導(dǎo)管數(shù)及擴(kuò)張導(dǎo)管數(shù)比較（）

注：正常對照組未建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；模型對照組建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；三苯氧胺組建立乳腺增生模型，予三苯氧胺1.8mg/kg 灌胃4 周；夏枯草顆粒低、中、高劑量組，為建立乳腺增生模型后分別予夏枯草顆粒0.5、1.0、3.0g/kg 灌胃4周；與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05

3.3 各組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達(dá)HS 評分比較Bcl-2 陽性染色多位于細(xì)胞核內(nèi)，并有細(xì)胞胞漿染色，大多切片中蛋白表達(dá)為彌漫表達(dá)。Bcl-2 蛋白表達(dá)在各組染色為黃棕色或棕色顆粒，肉眼所見差異并不顯著（見圖2）。六組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達(dá)HS 評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.431，P<0.05）。LSD法分析結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.926）。與模型對照組比較，夏枯草高劑量組Bcl-2 表達(dá)明顯降低（P<0.05），夏枯草低、中劑量組及三苯氧胺組Bcl-2 表達(dá)呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 各組大鼠乳腺組織Bcl-2 表達(dá)免疫組化圖（ABC 法×400）

3.4 各組大鼠乳腺組織Bax 表達(dá)HS 評分比較 Bax陽性染色主要為細(xì)胞胞漿染色，模型對照組大鼠乳腺組織Bax 蛋白表達(dá)染色為淺黃色，在三苯氧胺組以及夏枯草干預(yù)各組染色為棕黃色（見圖3），肉眼未見明顯差異。六組大鼠乳腺組織Bax 免疫組化HS 評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.125，P<0.05）。與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織Bax 表達(dá)降低（P<0.05）。與模型對照組比較，三苯氧胺組及夏枯草低、中、高劑量組大鼠乳腺組織Bax 呈降低趨勢，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 各組大鼠乳腺組織Bax 表達(dá)免疫組化圖（ABC 法×400）

3.5 各組大鼠乳腺組織PCNA 表達(dá)HS 評分比較PCNA 陽性染色主要位于細(xì)胞核，并有胞漿染色。PCNA 蛋白表達(dá)在模型對照組中為深棕色顆粒，正常對照組及夏枯草低劑量組染色稍淺，在三苯氧胺組、夏枯草中、高劑量組PCNA 蛋白僅為淡黃色（見圖4）。六組大鼠乳腺組織PNCA 蛋白免疫組化HS 評分統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與正常對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織PCNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型對照組比較，三苯氧胺組及夏枯草低、中、高劑量組大鼠乳腺組織PCNA 表達(dá)明顯降低（P 均<0.05），且接近正常對照組。見表2。

圖4 各組大鼠乳腺組織PCNA 表達(dá)免疫組化圖（ABC 法×400）

表2 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、Bax、PCNA 表達(dá)HS 評分比較（分，）

表2 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、Bax、PCNA 表達(dá)HS 評分比較（分，）

注：正常對照組未建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；模型對照組建立乳腺增生模型，予生理鹽水灌胃4 周；三苯氧胺組建立乳腺增生模型，予三苯氧胺1.8mg/kg 灌胃4 周；夏枯草顆粒低、中、高劑量組，為建立乳腺增生模型后分別予夏枯草顆粒0.5、1.0、3.0g/kg 灌胃4周；Bcl-2 為B 細(xì)胞淋巴瘤-2；Bax 為B 細(xì)胞淋巴瘤-2 相關(guān)X 蛋白；PCNA 為增殖細(xì)胞核抗原；HS 為組織化學(xué)評分；與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05

4 討論

乳腺增生癥在病理學(xué)上表現(xiàn)為乳腺腺泡和導(dǎo)管局灶性增生，并伴有間質(zhì)纖維組織進(jìn)行性增生，小葉失去正常形態(tài)，分為一般性增生和非典型增生[7]。PCNA 與Bcl-2 蛋白高表達(dá)被認(rèn)為與乳腺腺體增生有關(guān)。PCNA 作為修復(fù)與DNA 復(fù)制的組成部分，參與細(xì)胞S 周期控制、細(xì)胞凋亡[8]。在單純性增生中可見PCNA 陽性細(xì)胞，增殖指數(shù)和PCNA 的陽性程度與非典型上皮增生的增殖程度呈正相關(guān)[9]。Bcl-2 與Bax 為Bcl-2 基因家族成員，兩者共同調(diào)控細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞中Bcl-2 同源性區(qū)域3（BH3）蛋白通過抑制線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的抗凋亡蛋白傳播細(xì)胞凋亡信號，或直接刺激Bax 等促凋亡蛋白表達(dá)，導(dǎo)致Bax 寡聚導(dǎo)致線粒體外膜透化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bcl-2則可與BH3 基序結(jié)合隔離促凋亡蛋白Bax，抑制凋亡[10]。當(dāng)Bcl-2 過表達(dá)，促凋亡與抗凋亡蛋白平衡被打破，則使細(xì)胞存活增殖。

夏枯草顆粒具有免疫調(diào)節(jié)[11]、抗炎[12]、抗腫瘤[13]等多種藥理作用。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，使用夏枯草藥物干預(yù)組，乳腺平均腺泡導(dǎo)管數(shù)與擴(kuò)張導(dǎo)管數(shù)明顯減少，更接近正常乳腺組織結(jié)構(gòu)。

本研究還顯示，模型對照組中大鼠乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中PCNA 表達(dá)明顯增高，采用夏枯草顆粒治療組后，PCNA 表達(dá)則明顯下降。提示PCNA 與乳腺增生相關(guān)，夏枯草顆粒通過抑制PCNA 表達(dá)發(fā)揮作用。近年研究提出，抑制PCNA 的酪氨酸211 磷酸化則可減少PCNA 表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的結(jié)果[14]，但是否為夏枯草抑制PCNA 的機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。正常對照組乳腺組織中Bax 表達(dá)明顯高于模型對照組，這一結(jié)果提示，Bax/Bcl-2 極有可能參與乳腺增生，在增生乳腺組織中Bcl-2 過表達(dá)抑制Bax表達(dá)。在熊燚等[15]的研究，夏枯草發(fā)揮抗甲狀腺腫瘤的作用與Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)有關(guān)，夏枯草處理組Bcl-2 蛋白表達(dá)水平減少（P<0.05）；凋亡蛋白Bax 表達(dá)有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組與模型對照組比較，Bcl-2 明顯減少（P＜0.05），與以往此類研究基本相一致。

綜上所述，夏枯草顆?？赏ㄟ^降低PCNA 表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 及促進(jìn)Bax 表達(dá)來改善大鼠乳腺增生。