李志萍 趙德明 周向梅 楊利峰 喬 健

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物海綿狀腦病實驗室，北京 100193)(2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

實驗動物是生命科學(xué)研究的重要組成部分，被稱為“活的精密儀器”，是現(xiàn)代任何精密復(fù)雜的儀器都無法替代的科學(xué)工具，維持實驗動物的健康生產(chǎn)是保障動物實驗順利進(jìn)行和獲得可靠動物實驗結(jié)果的首要前提。實驗動物正常的生長繁育和動物實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性與動物的健康狀態(tài)密切相關(guān)，飼料中不同營養(yǎng)攝入的水平會直接影響動物的生長、發(fā)育、繁殖、抗病能力和最終的實驗結(jié)果，動物的某些器官，如消化系統(tǒng)的功能與形態(tài)也會因飼料品種的不同而發(fā)生改變。因此，要根據(jù)實驗動物的需求，對飼料品質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格把控，以最大限度減少飼料差異或飼料污染物對結(jié)果造成的干擾，從而保證研究數(shù)據(jù)的客觀性和真實性。本文梳理了造成實驗動物飼料差異的幾個因素，討論了因飼料質(zhì)量和成分不同在動物研究中對結(jié)果造成的潛在影響，以期在以動物為模型的研究中保證動物實驗的順利進(jìn)行和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性提供參考。

1 對動物實驗結(jié)果存在潛在影響的飼料差異

1.1 飼料配方

動物研究的目的是在單一變量的條件下，探索和評價該變量的作用，而飼料配方的差異可能作為無關(guān)研究變量影響動物實驗結(jié)果?，F(xiàn)行的實驗動物配合飼料標(biāo)準(zhǔn)是《實驗動物 配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 14924.2—2001)，研究者結(jié)合不同實驗動物的營養(yǎng)需要和生理特點進(jìn)行配方設(shè)計。實驗動物飼料一般有3種，天然原料日糧、純合日糧和化學(xué)純合日糧。天然原料日糧由于成本較低通常被用作實驗動物物種的維持和繁殖，但天然原料日糧的缺點在于難以保持每一批次間營養(yǎng)成分的一致，農(nóng)藥殘留、重金屬等物質(zhì)的污染也可能成為改變實驗處理結(jié)果的潛在可能。比如，人們所關(guān)注的脂肪與肥胖、糖尿病和其他代謝性疾病的作用，在多篇研究中報道實驗組使用純化實驗飼料控制脂肪濃度，但低脂對照用的是天然原料日糧，忽略天然原料日糧的內(nèi)在變異性，可能會降低結(jié)果的可靠性[1-3]。另外，天然原料日糧中的某些天然化學(xué)物質(zhì)會引起許多物種的生理反應(yīng)，例如，具有雌激素樣作用的植物雌激素，在動物飼料中主要來源于豆粕和苜蓿，即使是不含大豆和苜蓿的天然原料日糧中也可能會有微量甚至無法檢測到的植物雌激素水平，研究表明，該成分會干擾生殖生物學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肥胖癥、骨密度和毒理學(xué)的研究[4-5]。綜上，涉及藥理學(xué)或內(nèi)分泌干擾物毒理學(xué)評價的動物實驗均應(yīng)考慮這種類型飼料帶來的潛在影響。與天然原料日糧相比，純合日糧雖能減少飼料里成分的變化，但也會存在相應(yīng)的問題。例如，用作高脂純合日糧對照的低脂純合日糧，通常蔗糖含量偏高，而蔗糖含量到達(dá)50%會影響脂質(zhì)代謝和胰島素信號傳導(dǎo)[3]。再者，膳食纖維的種類和濃度對脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和腸道微生物組成起重要作用，但大多數(shù)純化飼料使用的不溶性纖維素作為纖維來源并不會促進(jìn)腸道細(xì)菌的生長[1]。

因此，在選擇飼料類型的時候，研究者必須了解對照組和處理組飼料配方的匹配性，盡可能避免處理組與對照組之間因無關(guān)變量帶來的差異，如果只關(guān)注實驗干預(yù)帶來的差異，那么可能會造成研究結(jié)論的錯誤，失去研究意義，并且結(jié)果不可重復(fù)。

1.2 飼料污染

臨床前動物實驗的研究是產(chǎn)品商業(yè)化前的最后一步，利用實驗動物來評估化學(xué)藥物或轉(zhuǎn)基因食品對哺乳動物的安全性，來預(yù)測對人類健康的風(fēng)險。然而，用農(nóng)作物和動物產(chǎn)品配制的動物飼料不僅攜帶有很多天然的毒物，如微生物或某些化學(xué)物質(zhì)，并且在飼料加工、儲存過程中也有可能造成二次污染，如果在動物研究開始之前不嚴(yán)格把控飼料的質(zhì)量，會從一開始就引入多種復(fù)雜的變量，進(jìn)而影響動物的機(jī)能代謝，甚至引起動物長期的、慢性的、難以分辨的微小變化，給研究者帶來困擾，降低實驗的可靠性和重復(fù)性，增加實驗研究成本。

1.2.1農(nóng)藥：飼料中有農(nóng)藥殘留，動物采食后會在體內(nèi)蓄積，對動物的消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等生理機(jī)能產(chǎn)生急性或慢性影響。最新的研究表明，高劑量或累積的農(nóng)藥會對動物產(chǎn)生毒性，低劑量則會產(chǎn)生興奮效應(yīng)。六六六和滴滴涕是植物飼料中最有可能存在的農(nóng)藥殘留物[6]?！秾嶒瀯游?配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 14924.2—2001)規(guī)定：實驗動物配合飼料應(yīng)該無毒、無害，不得摻入抗生素、驅(qū)蟲劑、防腐劑、色素、促生長劑以及激素等添加劑，并對化學(xué)污染物六六六、滴滴涕制定了殘留量標(biāo)準(zhǔn)。對于預(yù)知少量化學(xué)物質(zhì)殘留會影響結(jié)果的實驗，應(yīng)該要求供應(yīng)商提供關(guān)于殺蟲劑、除草劑等污染物的檢驗報告。

1.2.2微生物：飼料中微生物的污染不僅來自于原料的污染，如動物產(chǎn)品魚、肉和骨粉，或是被動物糞便污染的作物，而且在加工、儲存的過程中也會受環(huán)境中微生物(如細(xì)菌和霉菌)的污染。其中常見的細(xì)菌污染是大腸桿菌、沙門氏菌，最常見的霉菌污染是黃曲霉素[7]。微生物會分解飼料中的蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)素，使?fàn)I養(yǎng)成分發(fā)生改變，并且在分解過程中產(chǎn)生的異味損害了飼料的適口性，導(dǎo)致動物采食量降低；另一個重要的影響是，微生物會紊亂動物腸道菌群的生態(tài)平衡，影響腸道免疫，微生物的代謝產(chǎn)物還會刺激動物的免疫細(xì)胞，改變免疫機(jī)能。雖然在飼料制作的過程中可以物理去除或殺死大多數(shù)的微生物，但在使用前未經(jīng)消毒的天然原料日糧和純化的飼料中偶爾也會分離出潛在的腸道病原體，例如沙門氏菌、大腸桿菌或產(chǎn)氣莢膜梭菌，還有一些微生物可以在制造過程中存活并感染實驗動物，如老鼠諾如病毒和鼠細(xì)小病毒[8-9]?！秾嶒瀯游锕芾項l例》第十三條規(guī)定：實驗動物必須飼喂質(zhì)量合格的全價飼料。霉?fàn)€、變質(zhì)、蟲蛀、污染的飼料，不得用于飼喂實驗動物。采食微生物污染飼料的動物很可能只表現(xiàn)細(xì)微臨床癥狀甚至無癥狀，導(dǎo)致結(jié)果差異或無法重復(fù)，因此，對于實驗動物飼料中預(yù)期存在并且會干擾實驗的污染物應(yīng)定期分析，并作為原始資料保存。

1.2.3重金屬：無機(jī)重金屬是土壤的天然成分，在自然界中普遍存在，與純化日糧相比，天然原料日糧中砷、鎘、鉛和汞的濃度往往更高。砷經(jīng)呼吸道、消化道、皮膚進(jìn)入機(jī)體，先在肝臟蓄積然后進(jìn)入全身；鎘是一種毒性極強(qiáng)的重金屬污染物，對動物的肝、腎、肺、骨骼都可能產(chǎn)生毒性，因其在體內(nèi)代謝緩慢，可能在動物的整個生命周期中都存在；鉛也是一種蓄積性的有毒物質(zhì)，對動物的所有器官都有不同程度的傷害，如肝臟、腎臟組織細(xì)胞變性，腦血管擴(kuò)張，神經(jīng)節(jié)發(fā)生變性壞死等；汞主要侵害動物的神經(jīng)系統(tǒng)，造成腦和末梢神經(jīng)變性[11]。重金屬污染的飼料會影響實驗動物的生長發(fā)育，降低動物的抗病能力，影響實驗動物的品質(zhì)，甚至引起急性或慢性中毒，嚴(yán)重時還可致死[10-12]。《實驗動物 配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 14924.2—2001)對化學(xué)污染物砷、鉛、鎘、汞制定了標(biāo)準(zhǔn)的測定方法，建議飼料使用前先檢測重金屬的污染程度。

1.2.4全氟/多氟烷基化合物(PFAS)：PFAS是廣泛用于消費性商品的保護(hù)涂料，例如不粘和耐水的包裝涂料、消防泡沫等，具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，在自然條件下無法降解，半衰期可達(dá)40～90年，是一種持久性有機(jī)污染物。目前已有毒理學(xué)研究表明，PFAS會對實驗動物造成肝臟毒性、發(fā)育和生殖毒性、遺傳和免疫毒性，并有致癌作用[13]。

1.2.5亞硝胺：亞硝胺是一種化學(xué)致癌物，最早因在實驗動物中發(fā)現(xiàn)被喂食含有亞硝鹽魚粉的動物出現(xiàn)了肝衰竭而引起科學(xué)家的注意。上世紀(jì)中期在挪威因飼養(yǎng)了用亞硝酸鹽保存的青魚粉飼料引起肝中毒，導(dǎo)致綿羊、水貂急性死亡[14-15]；在嚙齒類動物中進(jìn)行的亞硝胺致癌性實驗研究表明，在肝、肺和胃中，即使百萬分之一濃度的亞硝胺也有致瘤作用；抗壞血酸可以抑制亞硝化反應(yīng)，通常被添加到飼料中以減少亞硝胺的形成，但飼喂高脂飲食時抗壞血酸又能反過來促進(jìn)體內(nèi)亞硝胺的形成[16]。動物的天然原料日糧中亞硝胺一般來源于魚粉。

1.3 飼料硬度

顆粒飼料或膨化飼料是實驗動物飼料中較為常見的兩種類型，經(jīng)制粒和膨化的飼料能提高飼料的消化吸收率，同時也較為符合動物的采食特性和生理消化特點。如有些嚙齒類動物的牙齒是終生生長，適當(dāng)?shù)娘暳嫌捕饶芊乐寡例X的過度生長。如果飼料硬度不夠會降低動物的咀嚼作用和胃腸刺激作用，影響動物的消化機(jī)能；反之，如果硬度過高則會減少幼齡小鼠的采食，影響其生長發(fā)育。如在BALB/c裸小鼠生長性能的研究中發(fā)現(xiàn)，將飼料硬度控制在108～137 N范圍，BALB/c裸小鼠能獲得較好的生長性能，同時對飼料的利用率也最高[17]。因此，建議在設(shè)計動物實驗的時候除實驗需求的變量之外，也應(yīng)將飼料硬度納入可能造成結(jié)果差異的來源之一，可以采用顆粒硬度測試的方法盡可能將其調(diào)到一致的水平。

1.4 飼料殺菌方法

實驗動物的飼料大都要經(jīng)過滅菌才能使用，目前采用較多的是輻照滅菌法和蒸汽高壓滅菌法，對于一些大動物的飼料原料如蔬菜、水果會通過藥物浸泡、清洗、加熱的方法進(jìn)行消毒。經(jīng)蒸汽高壓滅菌的飼料會破壞某些對熱不穩(wěn)定的營養(yǎng)成分，例如維生素A、C、B1、B6，高溫之后蛋白質(zhì)的質(zhì)量和利用率也會下降[18]，即便在飼料生產(chǎn)的過程中特別增加對熱不穩(wěn)定的維生素濃度，損失的百分比在不同的批次間也有所差異，難以保證相同的占比，這也可能成為降低實驗重復(fù)性的原因之一。除此之外，研究表明淀粉含量較高的飼料(例如天然原料飼料)高壓滅菌之后會產(chǎn)生丙烯酰胺，丙烯酰胺對嚙齒類動物具有致癌性[19]。輻照滅菌對飼料的營養(yǎng)成分影響較小，但也會對飼料中的某些維生素、氨基酸等成分造成一定程度的破壞，如發(fā)生蛋白質(zhì)變性，脂質(zhì)過氧化等現(xiàn)象[20]。研究報道，維生素B1、維生素B2、維生素B6、泛酸和葉酸等經(jīng)輻照之后會發(fā)生降解或流失，飼料中粗脂肪含量及多不飽和脂肪酸含量也會因照射而發(fā)生氧化反應(yīng)，造成脂肪含量的降低[21-22]。動物長期食用維生素、氨基酸等含量不足的飼料會減低實驗動物的質(zhì)量，飼料中脂肪含量的多少也可能對高脂飼料造模的實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。其他滅菌方法還包括干熱滅菌，干熱滅菌能殺滅霉菌和大腸桿菌，但也會破壞營養(yǎng)成分，且滅菌效果不夠徹底，藥物熏蒸、藥物浸泡、清洗等滅菌方法不常用?？傊鲜龅南痉椒m都有一定的殺菌效果，但都同時降低了飼料的質(zhì)量，且會損失部分營養(yǎng)成分，建議通過化學(xué)、生物指標(biāo)等方法進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，清潔動物還需直接對飼料進(jìn)行無菌測試。

1.5 飼料儲存

合理的飼料儲存對動物的健康和營養(yǎng)至關(guān)重要，飼料儲存不當(dāng)或存放時間過久會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生降解，飼料的營養(yǎng)價值減弱，不再能滿足特定物種的營養(yǎng)要求。淀粉是飼料的主要成分之一，儲存濕度大于75%時淀粉被水解，飼料中的糖分含量減少；含有高脂肪和維生素的飼料很容易因氧化而降解，從而降低適口性和采食量；另外，儲存溫度和濕度過高會導(dǎo)致霉菌生長，產(chǎn)生的霉菌毒素引發(fā)食物中毒[23]。因此，飼料儲存也是提高飼料品質(zhì)的一個重要原因，良好的存放條件能夠最大限度保存飼料的營養(yǎng)價值，促進(jìn)動物的健康生長。

1.6 飼料制作錯誤

因?qū)嶒瀯游镲暳仙a(chǎn)錯誤造成的結(jié)果差異較為少見，但在寵物、實驗動物飼料行業(yè)曾有報道。早在1990年就發(fā)生了由于飼料制造錯誤，飼料中維生素C不足，導(dǎo)致飼養(yǎng)的恒河猴和松鼠猴出現(xiàn)了壞血病的臨床特征[24]；還曾數(shù)次報道馬飼料中無意添加了莫能菌素，或者是因為在牛和馬之間對飼料設(shè)備的清潔不足導(dǎo)致交叉污染[25]。飼料配方或制造錯誤的現(xiàn)象雖然罕見，但其造成的結(jié)果差異卻是顯著的，它能夠在相對較短的時間內(nèi)影響許多動物，甚至是對照組，因此建議在購買新的飼料時，采集所有批次的飼料冷凍保存至少1年，以便在必要時進(jìn)行回溯性測試。

1.7 隨意飼喂與飲食限制

嚙齒類動物由于采食習(xí)慣和生理需要通常采取隨時進(jìn)食的飼養(yǎng)方式，其他大多數(shù)的實驗動物一般是定時定量的飼喂，防止過量飼喂而對健康造成危害。對于隨時采食的嚙齒動物，控制采食量和熱量有一定的困難，它們通常是成群飼養(yǎng)，熱量攝入較多，而活動范圍少[26]，導(dǎo)致肥胖癥，慢性腎臟疾病和心臟疾病，增加腫瘤發(fā)病率[27]，降低壽命，不利于某些疾病機(jī)制的研究，并且同籠中優(yōu)勢動物會比同伴吃得更多，使得同籠中的動物熱量攝入失衡。目前，美國毒理學(xué)會(NTP)針對毒理學(xué)研究而設(shè)計了實驗動物大小鼠的飼料標(biāo)準(zhǔn)NTP-2000配方，與之前采用的NIH-07配方相比，該標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量低，脂肪含量高，可減少慢性腎臟病變，提高生存率[28]，有助于慢性毒性實驗研究中對較晚時間點的評估。不過，限制采食也會帶來可能的問題，原因是限制飲食的動物在喂食時會立即進(jìn)食，從而導(dǎo)致生物化學(xué)和生理學(xué)發(fā)生變化，并且白天喂食夜間進(jìn)食的動物會改變其晝夜節(jié)律[29]。對于嚙齒動物的采食建議制定喂養(yǎng)計劃表，在固定時間自由采食定量的飼料，從而較好的控制其飲食。

2 討論

實驗動物的要求是盡可能減少個體間差異，生理生化指標(biāo)正常，動物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，因此，一方面，實驗動物飼料在滿足動物基本生長繁殖的條件下，要盡可能保證營養(yǎng)恒定，減少因營養(yǎng)不足或過多改變動物質(zhì)量。另一方面，實驗動物研究人員應(yīng)盡可能考慮純合飼料，特別是在已知研究的結(jié)果會受飲食影響的情況下，還應(yīng)當(dāng)注意對照日糧的配方與實驗日糧的配方一致。再者，即使是純化的飼料也可能含有微生物或化學(xué)污染物，在使用前應(yīng)該先做檢測；如果必須使用天然原料日糧時，也應(yīng)考慮采用開放式配方，以使所用飼料的成分更加透明，同樣地，也要定期檢測其營養(yǎng)成分，從而更易于結(jié)果的重復(fù)性。

本實驗室負(fù)責(zé)每年對北京市嚙齒類實驗動物質(zhì)量抽查的病理檢測，連續(xù)幾年的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)送檢的實驗動物少數(shù)出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、肺臟及心臟局灶性炎性細(xì)胞浸潤等病理變化[30]，可能與飼料的品質(zhì)及飼喂方式直接相關(guān)。目前實驗動物從業(yè)人員對飼料因素的影響作用似乎還不夠重視，希望未來在基于動物的研究中能引起研究者更多的關(guān)注，在實驗設(shè)計的過程中將飼料因素納入變量控制的范圍之內(nèi)，從而減少飼料對其結(jié)果的潛在影響，保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和精確度。