張 宇，吳曉淵，管麗華，劉譯遠(yuǎn)，彭星月，謝海燕，胡 瑋，郝可可，夏 寧，陸國軍，侯志波

1.南京市胸科醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院呼吸一科，南京 210029；2.南京市胸科醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院中心實驗室，南京 210029；3.南京市胸科醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院信息科，南京 210029；4.南京融康博臨床醫(yī)學(xué)研究院，南京 210018

肺癌的發(fā)病率和死亡率均高居全球疾病的前列［1］，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是原發(fā)性肺癌的主要類型，約占85%［2］。肺癌伴惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）首診檢出率約15%，疾病發(fā)展過程中至少有50%的患者會出現(xiàn)胸腔積液。胸腔積液一旦被確診為惡性，則提示已是腫瘤晚期，對患者的生活質(zhì)量及預(yù)后有極大的影響［3］。

雖然近年來分子靶向治療、免疫治療在對NSCLC 的治療中取得了里程碑式的進(jìn)展，但含鉑雙藥仍然是驅(qū)動基因陰性晚期NSCLC 患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，有效率為30%～40%［4］。然而在相同的化學(xué)治療（化療）方案和相應(yīng)的給藥劑量下，不同個體對化療的敏感性差異較大。如何挑選出化療有效的患者，減少化療的盲目性，特別對于三線后治療無標(biāo)準(zhǔn)方案的肺癌患者制定出合理的個體化抗腫瘤治療方案，是精準(zhǔn)醫(yī)療時代亟待解決的課題。

本研究選擇NSCLC 合并MPE 患者，獲取胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞，通過使用自動數(shù)字熒光掃描儀的高通量藥物敏感性篩選系統(tǒng)檢測其對化療藥物和分子靶向藥物的體外直接敏感性，評估經(jīng)體外培養(yǎng)的腫瘤原代細(xì)胞的藥物敏感試驗結(jié)果與患者臨床治療療效是否一致，為臨床篩選化療藥物及制定抗腫瘤治療方案提供試驗性參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2019年1月—2020年5月于南京市胸科醫(yī)院呼吸一科就診的伴MPE 的NSCLC 患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸腔積液經(jīng)病理證實為惡性。②血常規(guī)，心、肝、腎等臟器功能基本正常。③卡氏評分≥70 分。④預(yù)計生存期超過3 個月。⑤初診患者胸腔積液同時制備細(xì)胞蠟塊行EGFR、ALK、ROS1檢測。⑥經(jīng)患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胸腔積液腫瘤細(xì)胞數(shù)量≤1×106個的患者。②病例資料不完整者。本研究經(jīng)南京市胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：2018-KL008-01）。

1.2 材料與方法

本研究采用的Techboon D-Sense 法來源于瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院Laszlo教授等研發(fā)的高通量藥物敏感性分析系統(tǒng)，通過液體活檢的方式對患者的癌細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤藥物敏感性體外檢測［5-6］。該方法使用能夠模擬人體內(nèi)環(huán)境的Techboon 培養(yǎng)基培養(yǎng)腫瘤原代細(xì)胞，一次檢測僅需6 d 就可獲得30 種抗腫瘤藥物的體外敏感性分析結(jié)果。

無菌收集NSCLC 合并MPE 患者的胸腔積液400 mL，800×g離心10 min，分離純化腫瘤細(xì)胞后，經(jīng)涂片染色鑒定及質(zhì)控評估，合格方可進(jìn)入藥物敏感性試驗流程。將預(yù)設(shè)的30種抗腫瘤藥物（圖1）溶解在二甲基亞砜中，每種藥物以最大濃度按比例稀釋為4 種濃度（稀釋比例分別為1∶1、1∶5、1∶25 和1∶125），重復(fù)3 孔；未加藥的細(xì)胞孔作為對照。使用Echo 525 液體聲學(xué)處理器噴印在384 孔滴定板上。每孔加入含0.3×104～0.5×104個腫瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)液，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育6 d，用專有的D-染色液對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行固定和差異染色。使用Techboon D-計數(shù)自動數(shù)字熒光成像儀分析藥板，經(jīng)自定義開發(fā)圖像分析程序，使用5 種獨立的成像算法識別和計數(shù)存活的腫瘤細(xì)胞，取3 次重復(fù)的中位數(shù)記錄為試驗結(jié)果。

殺傷效率是根據(jù)既往文獻(xiàn)［5］發(fā)表的公式計算出的不同濃度下所有殺傷效率的加權(quán)總和。腫瘤細(xì)胞藥物殺傷效率排序，濃度依賴性生存圖，以及完全可縮放拼接的原始和處理過的平板圖像，由定制開發(fā)的程序在Linux計算機(jī)上生成。

1.3 治療方法

根據(jù)《中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）原發(fā)性肺癌診療指南（2019 版）》［7］，驅(qū)動基因陽性的患者采用靶向治療，驅(qū)動基因陰性以及靶向治療耐藥后的患者采用含鉑雙藥方案化療（非鱗癌可聯(lián)合抗血管生成治療）。選擇適合病例（如二/三線治療后無標(biāo)準(zhǔn)治療方案的患者或一/二線治療無效的患者），按照藥物敏感性結(jié)果并結(jié)合患者體力狀況選擇敏感藥物給予治療。

1.4 療效評價

化療2 個周期后進(jìn)行療效評價。通過實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)判斷療效：①完全緩解（complete response，CR），所有目標(biāo)病灶消失并維持4 周。②部分緩解（partial response，PR），基線病灶長徑之和縮小≥30%并維持4 周。③疾病進(jìn)展（progressive disease，PD），基線病灶長徑之和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。④疾病穩(wěn)定（stable disease，SD），基線病灶長徑之和有縮小但未達(dá)PR，或者增加但未達(dá)PD。

如Techboon D-Sense 法檢測結(jié)果顯示藥物低度至高度敏感，經(jīng)臨床治療患者療效評定為SD/PR/CR，則提示體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果與患者臨床治療效果一致。如檢測結(jié)果顯示為藥物耐藥，經(jīng)臨床治療患者療效評定為SD/PR/CR，則提示體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果與患者臨床治療效果不一致。

2 結(jié)果

共納入符合條件的患者30 例，其中男性16 例，女性14 例，平均年齡64 歲；初治17 例，復(fù)治13 例；腺癌26例，鱗癌3例，腺鱗癌1例。

2.1 原代細(xì)胞的藥物敏感性

研究采用Techboon D-Sense 法分析30 例NSCLC患者M(jìn)PE中原代細(xì)胞的體外藥物敏感性，每例樣本采用30種不同的藥物進(jìn)行檢測，在第6日計算每個孔中存活細(xì)胞的百分比。結(jié)果見圖2。大部分原代細(xì)胞對表柔比星、洛鉑、吉西他濱以及伊立替康敏感，殺傷效率為30%～45%；大部分原代細(xì)胞對阿來替尼、環(huán)磷酰胺和替莫唑胺具有抗藥性，殺傷效率低于10%。

圖2 30例NSCLC患者M(jìn)PE原代細(xì)胞對30種抗腫瘤藥物的藥物效應(yīng)值Fig 2 Killing efficiency of primary tumor cells cultured from 30 MPE patients with NSCLC for 30 different antitumor drugs

2.2 聚類分析熱圖

為了可視化30 種藥物對所有患者樣本的影響，我們將數(shù)據(jù)繪制為熱圖（圖3）。殺傷效率低于10%為耐藥，10%～30%為低度敏感（標(biāo)為藍(lán)色，藍(lán)色的深淺與藥物的耐藥程度成正比）；殺傷效率30%～70%為中度敏感，高于70%定義為高度敏感（標(biāo)為黃色，黃色的深淺與藥物的敏感程度成正比）。不同原代腫瘤細(xì)胞分離株對藥物的敏感性存在較大異質(zhì)性?；颊逽2、S4、S11、S26 和S30 對藥物較敏感，S1、S3、S12、S20 和S24 對藥物具有耐藥性。表柔比星、洛鉑、吉西他濱和伊立替康是最有效的藥物。

圖3 30例NSCLC患者M(jìn)PE原代細(xì)胞30種藥物殺傷效率的熱圖分層聚類Fig 3 Heat map and hierarchical clustering analysis of the killing efficiency of 30 drugs in primary tumor cells cultured from 30 MPE patients with NSCLC

2.3 體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果與患者臨床治療效果一致性分析

30例患者中，有23例接受化療或分子靶向治療，可以評價療效，進(jìn)行一致性分析（見表1）。①初治15 例。其中EGFR陽性患者9 例，接受了一代/二代EGFR-TKI治療，PR 7例，SD 2例。靶向治療的效果與體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果一致4 例，不一致5 例，一致率為44.4%（4/9）。EGFR陰性患者6 例，5例接受培美曲塞+鉑類化療，1例腺鱗癌接受多西他賽聯(lián)合奈達(dá)鉑化療；PR 2 例，SD 3 例，PD 1 例。與體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果一致4例，不一致2例。②復(fù)治8 例。其中EGFR陽性患者5 例，接受了一代和/或三代EGFR-TKI 治療后耐藥，EGFR陰性患者3 例（鱗癌2 例）；8 例患者均接受化療，PR 3 例，SD 4 例，PD 1 例，其療效與體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果一致。采用化療的效果與體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果一致率為85.7%（12/14）。

表1 23例可評價臨床療效NSCLC患者的臨床特征以及體外高通量藥物敏感試驗結(jié)果與患者臨床治療效果一致性Tab 1 Clinical characteristics of 23 NSCLC patients with evaluable clinical efficacy and the consistency between the results of highthroughput drug sensitivity test in vitro and the clinical efficacy

Continued Tab

其中S21 是一位45 歲晚期肺腺癌男性患者，在一線吉非替尼、二線培美曲塞聯(lián)合順鉑、三線奧希替尼治療后再度疾病進(jìn)展，出現(xiàn)MPE，胸腔積液NGS檢測提示EGFR19DEL/20T790M/20C797S（順式），自服布加替尼出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，應(yīng)用激素治療得到緩解后根據(jù)高通量藥物敏感性檢測結(jié)果（吉西他濱高度敏感、洛鉑中度敏感，見圖4），采用吉西他濱聯(lián)合洛鉑化療后療效達(dá)PR，患者癥狀緩解，胸腔積液控制。本例表明即使分子檢測結(jié)果提示靶向治療無藥可選，基于Techboon D-Sense 法檢測結(jié)果選用化療藥物，仍然是晚期肺癌伴MPE 患者個體化治療的可行選擇。

圖4 S21患者胸腔積液腺癌原代細(xì)胞在藥物稀釋作用下的濃度依賴性生存情況Fig 4 Concentration-dependent survival of primary pleural adenocarcinoma cells in S21 patient with drug dilution

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率位居腫瘤總體發(fā)病率和死亡率的前列，且大部分肺癌患者就診時已是晚期。盡管近年來靶向治療和免疫治療給部分晚期NSCLC 患者帶來生存獲益，但在肺癌患者的全程管理中，化療仍是一線方案，必不可少［8］。

目前肺癌化療方案的選擇主要基于組織學(xué)類型，然而同種組織學(xué)類型的肺癌對相同化療藥物產(chǎn)生的反應(yīng)卻不盡相同。既往通過核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1、核苷酸還原酶1、乳腺癌易感基因1、β 微管蛋白、胸苷合成酶核苷酸等在內(nèi)的化療藥物相關(guān)基因檢測來預(yù)測化療效果及其指導(dǎo)化療的臨床試驗得到的都是陰性結(jié)果，不能用于指導(dǎo)臨床實踐［9-10］。眾多基于體外試驗，甚至臨床前小鼠模型的藥物敏感性預(yù)測的研究結(jié)果同樣令人失望［11-15］。雖然腫瘤細(xì)胞系操作簡單，試驗要求低、周期短，但細(xì)胞系并不能實際反映原代腫瘤的生理狀況，而且將細(xì)胞系原位種植在免疫缺陷小鼠上后，藥敏試驗并不能預(yù)測原位腫瘤的藥物敏感性?；颊邅碓吹哪[瘤模型忠實地再現(xiàn)了人類腫瘤生物學(xué)，并能預(yù)測潛在的臨床反應(yīng)，包括患者來源的腫瘤異種移植模型和患者來源的類器官等等，但這些技術(shù)在檢測藥物通量、周期、成本和準(zhǔn)確率等方面的局限限制了臨床的實際應(yīng)用［16-19］。原代細(xì)胞最接近也更真實地反映體內(nèi)生長特征，更能代表患者的生物學(xué)和臨床特性，表現(xiàn)腫瘤的個體化特征并用于臨床轉(zhuǎn)化，其在體外條件下的研究需要特定的標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)系統(tǒng)［20-21］。

本研究采用的Techboon D-Sense 法與腫瘤體外藥敏試驗方法相比在方法學(xué)上有其優(yōu)點：①個體化。應(yīng)用患者自身惡性細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞，充分模擬液態(tài)下腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生存環(huán)境，避免了細(xì)胞早期凋亡及細(xì)胞變異，保證腫瘤細(xì)胞的體外生存活力，使個體化藥物敏感性檢測分析成為可能。②標(biāo)準(zhǔn)化。使用Echo 525 液體聲學(xué)處理器將藥物噴印在348 孔滴定板上，實現(xiàn)準(zhǔn)確移液，保證組內(nèi)試驗藥物濃度的一致性和穩(wěn)定性。在單細(xì)胞水平重復(fù)3 次的四步藥物稀釋系列測量藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，可重復(fù)性高。③高通量、高效性。臨床采集400 mL 癌性胸腔積液，一次檢測僅需6 d 就可獲得30 種藥物的敏感性分析結(jié)果，可以快速找到個體化的抗腫瘤藥物治療方案。④智能性。運用自定義開發(fā)的智能軟件分析系統(tǒng)，采用5 種獨立圖像分析算法準(zhǔn)確分析計算細(xì)胞數(shù)，自行定制開發(fā)程序在計算機(jī)上生成檢測報告。該方法最大程度地減少了人為因素的影響，提高了試驗效率，為開展臨床樣本檢測提供了保障。

Techboon D-Sense 檢測法適用于白血病、淋巴瘤、癌性漿膜腔積液等腫瘤細(xì)胞呈懸浮生長的標(biāo)本。該方法已用于惡性血液病的藥物敏感性檢測［22-24］，包括建議將紫杉醇和放線菌素D 納入晚期霍奇金淋巴瘤合并胸腔積液的化療方案［22］。在慢性淋巴細(xì)胞白血病研究中發(fā)現(xiàn)，柔紅霉素最有效（有效率97.4%）且與潑尼松龍具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，建議將低劑量柔紅霉素和潑尼松龍聯(lián)合治療作為慢性淋巴細(xì)胞白血病耐藥病例的治療選擇［23］。該技術(shù)應(yīng)用于分子生物學(xué)方面的研究發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶1 抑制蛋白在控制關(guān)鍵蛋白的磷酸化狀態(tài)、調(diào)控白血病細(xì)胞的藥物敏感性和凋亡中起著重要的作用［24］，為臨床診療提供新思路。

MPE 是研究體外和體內(nèi)腫瘤發(fā)展的優(yōu)質(zhì)來源，它再現(xiàn)了腫瘤自然產(chǎn)生的異質(zhì)性［25-27］。腫瘤異質(zhì)性在藥物耐藥中的作用仍不清楚［28］。針對肺腺癌和惡性胸膜間皮瘤患者M(jìn)PE 的Techboon D-Sense 法體外藥物敏感譜分析表明，藥物敏感性的個體差異很大。長春堿、長春瑞濱、紫杉醇和放線菌素D 對50%的肺腺癌原代細(xì)胞顯示出較高的療效，鉑類藥物和吉西他濱的體外敏感性與ERCC1 和RRM1 水平之間存在顯著的相關(guān)性［6］。放線菌素D 和柔紅霉素對于大多數(shù)惡性胸膜間皮瘤患者有效［5］。

王丹［29］收集12 例肺癌伴MPE 患者的胸腔積液培養(yǎng)腫瘤原代細(xì)胞，在高通量藥物篩選平臺進(jìn)行藥物敏感性檢測，篩選出對肺癌細(xì)胞敏感的藥物19 種，但并未與臨床治療效果相比較。

本研究表明，NSCLC 患者的MPE 可以用于研究肺癌的化療敏感性，但與靶向藥物療效的一致性較低。分析其原因，靶向藥物是針對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的，其臨床療效可能并不歸因為它們的體外直接殺傷作用，因而殺傷效率較低。因此對于臨床上存在EGFR突變的初治NSCLC 患者，仍應(yīng)首選相應(yīng)的靶向藥物治療。

以鉑類為基礎(chǔ)的化療仍然是NSCLC 患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。我們基于MPE 原代細(xì)胞培養(yǎng)的高通量藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)5 種鉑類藥物的抗腫瘤藥物效應(yīng)依次為：洛鉑＞奈達(dá)鉑＞奧沙利鉑＞卡鉑＞順鉑。在《中華醫(yī)學(xué)會肺癌臨床診療指南（2018 版）》［30］中，洛鉑新增用于驅(qū)動基因陰性晚期NSCLC 的一線治療。我們的研究提示在鉑類藥物的選擇上無論是一線還是后線治療，洛鉑均可選擇。總之，基于NSCLC 患者M(jìn)PE 原代細(xì)胞培養(yǎng)的高通量藥物敏感性檢測與臨床化療效果的一致性較高，可以為臨床篩選化療藥物及制定抗腫瘤治療方案提供試驗性參考依據(jù)，有助于制定個體化化療方案，特別對于二/三線治療后無標(biāo)準(zhǔn)方案的肺癌患者尤有意義。今后Techboon D-Sense 法的檢測結(jié)果與臨床療效的相關(guān)性有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及分層的臨床驗證。

致謝 感謝瑞典卡羅林斯卡學(xué)院微生物學(xué)、腫瘤和細(xì)胞生物學(xué)系Laszlo Szekely 教授和阿爾及利亞費爾哈特·阿巴斯塞提夫大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系Nida El Islem Guissi在本研究中給予的試驗支持。